wb注意事项

1.配胶用的AP要新鲜，最好现用现配。方法是0.1g过硫酸铵，

加1ml水。

2.用异丙醇压平胶面之后要用清水洗几次，确保没有大量异丙醇

残留。建议用水压面。

3.要调整TEMED用量，防止胶凝得过快，凝的过快不利于凝胶均

匀聚合。配置的胶必须混合均匀。

4.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面

的表格配制SDS-PAGE 的分离胶(即下层胶)。SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围:

6%胶 57-212kD

8%胶 36-94kD

10%胶 20-80kD

12%胶 12-60kD

15%胶 10-43kD

5.如果浓缩胶跑的好的话，几个孔的蛋白会跑成一条直线。注意

加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液

6.电泳结束时候蛋白条带会扩散，防治扩散的溶液是：

40%无离子水 10%乙酸 50%甲醇，即

40ml蒸馏水，10ml乙酸，50ml甲醇。

7.转膜：滤纸不要过大，防止形成短路。

8.PVDF膜先用甲醇泡几分钟，目的是为了增强膜的正电荷。甲

醇泡完后，得在转移缓冲液里泡一两分钟。

9.A ll proteins are hindered from binding to membranes by

SDS but small proteins more so than large proteins. If your protein of interest is small, consider removing SDS from the transfer buffer.

10.对于小分子量蛋白(<100 kD)

SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。如果目

的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。

保持甲醇的浓度在20%

一般在转大分子量蛋白时电转液里加入0.1%SDS 是为了增加转印效率，在转小分子时可以不用；另外，

转小分子时电转液里的甲醇浓度最好提高到15-20%。

至于膜的孔径，0.45的也可以用，就是你的电流和时间要掌握好，我做过12kD的，湿转150mA45分钟，没问题

11.1) 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一

起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。

2) 如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋

白会受到影响，因为磷酸酶与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化.

3) 检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭试剂