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利用整合载体构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌

　遗传学报　Acta G enetica Sinica ,August 2003,30(8):737～742ISS N 0379-4172

收稿日期:2002-03-10;修回日期:2003-05-07

基金项目:国家自然科学基金(N o.39970423)和国家863(N o.2001AA214011和2001AA212301)项目资助[Supported by the National Natural Science

F oundation of China and M az or National Basic Research Development Program]

作者简介:乐超银(1967-)女,博士,研究方向:苏云金芽胞杆菌分子生物学①　通讯作者。E 2mail :yz41@https://www.wendangku.net/doc/3d10016001.html,

Construction of I nsecticidal R ecombinant Bacillus thuringiensis

U sing An I ntegrative V ector

Y UE Chao 2Y in 1,2,S UN Ming 1,CHE N Shou 2Wen ,Y U Z i 2Niu 1,①

(11Huazhong Agricultural University ,College o f Life Science and Technology ,K ey Laboratory o f

Agricultural Microbiology o f Ministry o f Education ,Wuhan 430070,China ;

21Three G orges University ,College o f Chemistry and Life Science ,Yichang 443002,China )

Abstract :Insecticidal crystal protein gene cry1C which is highly toxic to Spodoptera exigua was cloned into an integrative vector pBM B 2F7E ,which was derived from Bacillus thuringiensis transpos on Tn4430.The recombinant integrative plasmid pBM B 2F LC har 2boring the cry1C gene was gained and trans formed into a wild 2type Bt strain Y BT 80321.A trans formant BM B8032A was obtained ,and grown at 46℃for about 120generations ,From which three recombinants with cry1C gene integrating into the chrom os ome were achieved at a frequency of approximately 314×10-5.S outhern blotting revealed that the integration occurred in different sites of the chrom os ome.The integrated cry1C were expressed effectively.The results of bioassays showed that the toxicity of recombinants BM B8032X and BM B8032Z against Plutella xylostella were similar to that of strain Y BT 80321,and their toxicity to Spodoptera ex 2igua were higher than that of strain Y BT 80321.

K ey w ords :Bacilus thuringiensis ;integrative vector ;integrative recombinant ;Spodoptera exigua

利用整合载体构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌

乐超银1,2,孙　明1,陈守文1,喻子牛1,①

(11华中农业大学生命科学技术学院,教育部暨农业部农业微生物重点实验室,微生物农药国家工程研究中心,武汉　430070;

21三峡大学化学与生命科学学院生物工程系,宜昌　443002)

摘　要:利用由苏云金芽胞杆菌整合子Tn4430衍生出的整合载体pBM B 2F7E ,克隆了对鳞翅目夜蛾科昆虫有毒力的杀虫晶体蛋白基因cry1C ,获得了整合重组质粒pBM B 2F LC 。用电脉冲法将该重组质粒转入对鳞翅目昆虫高毒力的野生菌株Y BT 80321,在46℃下,经过约120代转接培养后,筛选出在染色体基因组上整合了cry1C 基因的重组子,整合频率约为314×10-5。S outhern blotting 验证了cry1C 在菌株Y BT 80321中于染色体的不同的位点整合。生物测定结果显示,重组子BM B8032Z 对小菜蛾的毒力与出发菌株无明显差异,而对甜菜夜蛾则较出发菌株高。关键词:苏云金芽胞杆菌;整合载体;整合重组子;甜菜夜蛾

中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:037924172(2003)0820737206

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis )是一类

可产生伴胞晶体蛋白的革兰氏阳性菌,对许多农林害虫都具有杀虫活性[1]。研究表明苏云金芽胞杆可

产生的伴胞晶体种类繁多、分布广泛,大多数杀虫晶体蛋白的编码基因分布在大小不同的质粒上,少数存在于染色体上,且常常与一些转座子相邻[2],如

cry1Ac 、cry1Ab 、cry1B 等cry1类基因常与转座子

Tn4430紧密相连[3],cry3类基因则被发现与转座子Tn5401连在一起[4]。由于这些转座子携带转座酶

基因tnp A 和整合酶基因tnpI ,常介导包括杀虫晶体

基因在内的遗传物质在蜡状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌种群间水平传播,目前已被用来构建转移目标基因的载体[5]。本实验所用整合载体pBM B 2F7E 是在Tn4430的基础上增加了四环素抗性基因(T c ,置于两个IR 序列构成的转座单元外)标记,以及在高温下不能自我复制的温敏复制子(repU ),并且将转座酶基因(tnp A )和整合酶基因(tnpI )移置于两IR 之间的转座单位之外,使之可随温敏复制子在高温下被消除,这样可大大降低整合到染色体上的基因发生再次转座的几率。利用整合载体pBM B 2F7E 将外源基因cry1C 整合到野生受体菌的染色体基因组中,以避免同源重组和质粒的不稳定性,从而使得被导入的基因在受体菌中能够稳定地表达。

1　材料和方法

1.1　材　料

1.1.1　菌种、质粒和供试昆虫

苏云金芽胞杆菌Y BT80321由本室分离,含cry1Aa ,b ,c ,cry2基因,血清型为H3ab ,对小菜蛾有高毒力。pBM B 2F LC (本研究构建,图1)为基因cry1C 克隆到整合载体pBM B 2F7E

并去除了红霉素抗性基

图1　含基因cry1C 的整合质粒

Fig.1　I ntegrative plasmid cry1C gene

因的重组质粒。小菜蛾(Plutella xylostella )由本室饲养提供,甜菜夜蛾(Spodoptera exigua )购自湖北省农科院Bt 开发中心。1.1.2　培养基

LB 培养基[6];NS M 培养基[1];L 8培养基[9]。筛选转化子时使用的抗生素的终浓度:四环素为10μg/ml ,红霉素为25μg/ml 。1.2　方　法1.2.1　DNA 操作

质粒抽提、总DNA 的提取、DNA 的酶切、酶连、低熔点琼脂糖回收DNA 片段,均参考文献[6]。1.2.2　电脉冲转化

采用SG 缓冲液(272mm ol/L 蔗糖,15%甘油),电脉冲条件:1215kV/cm ,电阻为400Ω,电容为25μF ,2个脉冲的条件下,电击后恢复培养4h 。电脉冲仪为Bio 2Rad 的G ene Pulser T M ,电脉冲杯也为Bio 2Rad 产品。1.2.3　PCR 扩增

PCR 扩增所用引物见文献[7],引物TY 62和TY 63等由Integrated DNA T ech 合成,扩增条件为:变

性温度94℃,延伸温度72℃,复性温度因引物不同而异:cry1Ab 、cry1Ac 采用55℃复性,cry2的复性温度为53℃,cry1C 则为58℃。PCR 仪为Pekkin Elmer Cetus 的DNA Thermal Cycler 。1.2.4　探针制备

cry1C 探针制备采用PCR 扩增产物作为底物,

扩增引物为TY 62和TY 63,探针标记参照Boehringer Mannheim 公司产品DNA 分子杂交试剂盒说明。1.2.5　S outhern 杂交质粒电泳采用016%琼脂糖凝胶,杂交膜使用硝酸纤维素膜(Hybond ),转膜参考文献[6],杂交及显色按Dig 杂交使用说明进行。1.2.6　生物测定

生物测定均采用L 8培养基发酵,小菜蛾生测方法见文献[8],甜菜夜蛾生测方法见文献[9]。

2　结果与分析

2.1　转化子的验证结果

菌株Y BT80321及其转化子质粒的检测:用电脉冲法将pBM B 2F LC 转化菌株Y BT80321,在四环素

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(T c )平板筛选出转化子,质粒的电泳分析发现其中

多数转化子丢失了部分质粒,选出未丢失内源质粒的转化子BM B8032A ,进行下一步整合实验。2.2　整合重组子的获得

将转化子BM B8032A 接种于20ml LB 培养液中,46℃下培养并转接6次(1次/12h ,约120代),最后取2～5μl 菌液涂布于LB 平板,待其上长出单菌落后,再挑出1000个菌落对点于含T c 和不含T c 的NS M 平板上,置28～30℃培养48h 后,将丢失T c 抗性的菌落挑出镜检,

若能够产生伴胞晶体蛋白,则再通过提取质粒和PCR 扩增进一步验证。最后得到3株重组子BM B8032X 、BM B8032Y 和BM B8032Z 。由图2可见整合重组子除BM B8032Y 少了一条510kb 的带外其他均与出发菌株无明现差异。PCR 扩增结果也显示(图3),BM B8032A 以及3个整合重组子都含有cry1C 基因,除BM B8032Y 丢失了cry2基

图3　cry1Ab (

A),cry1Ac (B),cry2(C)和cry1C (D)特异引物扩增

Fig.3　cry1Ab (A),cry1Ac (B),cry2(C)and cry1C (D)amplification

1:100bp ladder ;2:wild type strain Y BT 80321;3:BM B8032A ;4:BM B8032X;5:BM B8032Y;6:BM B8032Z.

因外,其余都保留了cry1Ab 、cry1Ac 和cry2基因。

图2　野生菌株YBT 80321及其cry1C 转化子和

整合重组子的质粒电泳图谱

Fig.2　P lasmid profile of YBT 80321and its transform ant ,integrative recombinants with cry1C 1:λDNA/Hin d Ⅲ;2:pBM B 2F LC ;3:Y BT 80321;4:BM B8032A ;

5:BM B8032X;6:BM B8032Y;7:BM B8032Z.

2.3　整合重组子的Southern 杂交验证

用cry1C 基因的PCR 333bp 扩增片段制备探针

对转化子和重组子的总DNA 的Nsi Ⅰ酶切片段进行S outhern 杂交。结果显示(图4),pBM B 2F LC 和

BM B8032A 的杂交阳性带一样,分别约为810kb 和315kb ;3株整合重组子的杂交阳性带分别是BM B8032X 和BM B8032Y 均约为1115kb 、5kb ;BM B8032Z 约为618kb 、415kb ,可见cry1C 在BM B8032X 和BM B8032Y 的基因组中的插入位置相

37　8期乐超银等:利用整合载体构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌

同,而BM B8032Z 则整合在不同的位点

。

图4　YBT 80321及其cry1C 转化子和整合

重组子总DNA 的Nsi Ⅰ酶切片段与cry1C 的Southern 杂交结果

Fig.4　Southern blot of total DNA of YBT 80321and

its transform ant ,

integrative recombinants

with cry1C digested with Nsi Ⅰ

1:λDNA/Hin d Ⅲ;2:pBM B 2F LC digested with Nsi Ⅰ;

3:BM B8032A ;4:BM B8032X;5:BM B8032Y;6:BM B8032Z.

图5　野生受体菌YBT 80321及其cry1C 转化子和整合重组子的杀虫晶体蛋白的SDS 2PAGE 分析

Fig.5　

SDS

2PAGE analysis of wild type strain YBT 80321and its transform ant ,integrative

recombinants with cry1C

1:protein marker ;2:wild type strain Y BT 80321;3:BM B8032A ;

4:BM B8032X;5:BM B8032Y;6:BM B8032Z.

图6　野生受体菌株YBT 80321及其cry1C 转化子和整合重组子的伴胞晶体和芽胞的透射电镜形态观察(×6000)

Fig.6　TEM observations of p arasporal crystals and spores of wild type strain YBT 80321and its transform ant

integrative recombinants with cry1C (×6000)

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2.4　整合重组子杀虫晶体蛋白的表达

将重组子接种于NS M液体培养基中28℃培养48h,提取晶体蛋白进行S DS2PAGE分析。结果表明(图5),3株重组子均能表达133kDa蛋白,BM B8032X 和BM B8032Z的表达量比出发菌株的有所增高,而BM B8032Y的表达量则较出发菌株的低。可见外源基因随插入的位置不同,其表达的效果也明显不同。

2.5　整合重组子的生物学特性

透射电镜观察发现(图6),3株重组子形成的晶体大小差异较明显,BM B8032X和BM B8032Z所形成的晶体约为出发菌株的114～117倍,而BM B8032Y 形成的晶体则只有出发菌株的1/2～2/3(表1)。

表1　野生菌株YBT80321及其cry1C转化子和整合重组子的伴胞晶体的大小①T able1　The size of p arasporal crystals in the wild type strain YBT80321and its transform ant,integrative recombinants 菌株/S trains Y BT80321BM B8032A BM B8032X BM B8032Y BM B8032Z 长/Length 1.69 1.67 2.16 1.50 1.83宽/W idth0.690.700.830.580.80体积/V olume0.270.270.490.170.39

　①每种样品随机测量30个晶体;长度单位为μm;体积单位为μm3。

　①The values are the averages of30crystals in each sam ple;length unit isμm;v olume unit isμm3.

2.6　生物活性的测定

利用L8培养基对Y BT80321及其转化子和重组子进行发酵,并用小菜蛾和甜菜夜蛾进行生物测定,结果见表2。由表2可见重组子BM B8032X和BM B8032Z对小菜蛾的毒力与出发菌株的无明显差异,但对甜菜夜蛾的毒力则比出发菌株分别提高了25%和38%,BM B8032Y对小菜蛾的毒力则比出发菌株低50%,而对甜菜夜蛾的毒力则高10%。

表2　出发菌株BMB80321及其cry1C转化子和整合重组子的生物测定

T able2　Bioassays of strain YBT80321and its transform ant,integrative recombinants with cry1C against Lepidoperteran larvae

供试昆虫T est pests 菌　株

S trains

毒力回归方程

Regression equation

of toxicity

Bt(苏云金杆菌)乳剂生产工艺规程

Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程衡阳市微生物厂一九九二年三月

Bt 乳剂工业生产技术一、概述 Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。二、生产工艺流程砂土管菌种斜面菌种扁瓶菌种扩大培养发酵罐过滤浓缩加助剂检验包装三、生产工艺操作规程（一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理：取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。 2、砂土管制备：将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。 27－29℃ 48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃ 36－48h

3、砂土孢子的制作：选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。（二）斜面菌种的制备 1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。 2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。（三）扁瓶扩大种子制备 1、培养基：同斜面培养组成，另加葡萄糖1%，溶化后装入扁瓶。 2、灭菌、接种、培养均与斜面菌种同。（四）发酵 1、培养基棉籽饼粉 3.5% 玉米粉 2.0% 鱼粉 1.0% 酵母粉0.2%

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定 09级园林工程系生物技术及应用班级 (制作人—王珏指导教师—韩磊) 内容提要本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。关键词苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1玻璃器皿烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等 1.1.2实验仪器超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等 1.1.3其他用具研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等 1.1.4实验材料土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉 1.2方法与步骤 1.2.1选择性培养及扩大培养 1.2.1.1灭菌前准备 1)PBA培养基的制备 PBA培养基配方（1L）配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠） 2）灭菌器材的准备将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。 1.2.1.2灭菌 1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水； 2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟； 3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→ 待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的过程； 4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到 0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接通电源；此后为升压保压的过程； 5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程； 6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出； 1.2.1.3样品的预处理三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置 1.2.1.4超净工作台的准备接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。 1.2.1.5无菌操作 1）培养基的完善及分装（对照试验）

苏云金杆菌的使用方法

苏云金杆菌的使用方法尽管苏云金杆菌是杀虫剂中使用比较广泛的杀虫剂之一。但还是有不少农民用户对苏云金杆菌的使用方法不是很了解的。今天小编详细给大家介绍苏云金杆菌的使用方法。苏云金杆菌的使用方法：十字花科蔬菜菜青虫、小菜蛾幼虫3龄前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂100～300克，或16000IU/毫克可湿性粉剂100～150克，或32000IU/毫克可湿性粉剂50-80克，或2000IU/微升悬浮剂200～300毫升，或4000IU/微升悬浮剂100～150毫升，或8000IU/微升悬浮剂50～75毫升，或100亿活芽孢/克可湿性粉剂ioo～iso克，兑水30～45丁-克均匀喷雾。水稻稻纵卷叶螟、稻苞虫幼虫孵化高峰至3龄前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂300～400克，或16000IU/毫克可湿性粉剂150r-_J200克，或32000iu/毫克可湿性粉剂80～100克，或2000IU/微升悬浮剂400～500毫升，或4000IU/微升悬浮剂200～250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100-120毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。棉花棉铃虫、造桥虫幼虫孵化高峰至钻铃前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂400～500克，或16000克可湿性粉剂200～250克，或32000IU/毫克可湿性粉剂120克，或2000IU/微升悬浮剂400---500毫升，或4000升悬浮剂200～250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100-120毫升，

或100亿活芽孢/克可湿性粉剂250～400克，兑水45-75千克均匀喷雾。玉米、高梁玉米螟每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂250-300克，或4000IU/微升悬浮剂150-200毫升，在玉米或高粱大喇叭口时期喷雾或混细沙制成毒土灌心叶。大豆天蛾、甘薯天蛾幼虫孵化盛期，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂200～300克，或16000iu/毫克可湿性粉剂100～150克，或32000iu/毫克可湿性粉剂50～80克，或2000iu/微升悬浮剂200-300毫升，或4000IU/微升悬浮剂100~150毫升，或8000IU/微升悬浮剂50-75毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。烟草烟青虫幼虫3龄前喷药，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂400-500克，或16000IU/毫克可湿性粉剂200～250克，或32000IU/毫克可湿性粉剂100～120克，或2000IU/微升悬浮剂400～500毫升，或4000IU/微升悬浮剂200--250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100～120毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。茶树茶毛虫幼虫孵化高峰至3龄前喷药，使用8000IU/毫克可湿性粉剂100～150倍液，或16000iu/毫克可湿性粉剂200～300倍液，或32000iu/毫克可湿性粉剂400-500倍液，或2000IU/微升悬浮剂80～100倍液

苏云金芽孢杆菌

本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。除了这一独特的杀虫机制外，微生物杀虫剂还具有以下一些特点：对人畜安全无毒，不污染环境；杀虫作用具有一定特异性和选择性，不会使天敌和非目标昆虫致死；易于和其他生物学手段结合进行害虫综合治理，维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有较低的生产成本；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用所需等。所以微生物杀虫剂自问世以来发展很快，据报道，全世界已商品化的微生物农药约30种，微生物杀虫剂占其中的90％。苏云金芽孢杆菌杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌从上世纪20年代起就用于害虫的防治，它的生物学特性决定了它的微生物杀虫剂功能。苏云金芽孢杆菌菌株在生长代谢过程中会形成芽胞，在芽胞形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后会导致昆虫死亡，蛋白质晶体含有不具活性的原毒素分子——δ－内毒素，当昆虫幼虫吞食了这种内毒素，晶体就会被幼虫的碱性肠液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素，最终导致昆虫死亡。苏云金芽孢杆菌菌株在营养体生长旺盛期，某些菌株还会产生一些其它的外毒素，如α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素，等等。除上述毒素外，近年来从

苏云金杆菌&阿维菌素简介

苏云金杆菌苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，英文名称：Bacillus thuringiensis（B.t.）为了方便都将B.T.写成BT或Bt，故Bt即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。苏云金杆菌在自然状态下以一种生物细菌的形式生存于土壤及水中。这种杀虫菌在生长发育过程中产生芽胞并形成一种蛋白质毒素，在显微镜下观察，通常是不规则的菱形结晶，叫做伴孢晶体。当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的。 Bt杀虫剂与化学农药相比有许多优点第一，对人畜无毒，使用安全。Bt细菌的蛋白质毒素在人和家畜、家禽的胃肠中不起作用。

第二，选择性强，不伤害天敌。Bt细菌只特异性地感染一定种类的昆虫，对天敌起到保护作用。第三，不污染环境，不影响土壤微生物的活动，是一种干净的农药。第四，连续使用，会形成害虫的疫病流行区，造成害虫病原苗的广泛传播，达到自然控制虫口密度的目的。第五，没有残毒，生产的产品可安全食用，同时，也不改变蔬菜和果实的色泽和风味。第六，不易产生抗药性，这只是相对而言。最近已经发现了抗药性的报道，但不象化学农药产生的那么快。毒性：鼠经口按2*10^22活芽孢/Kg体重给药无死亡，也无中毒症状。18名志愿者每人每天吞服30亿芽孢，连服5天，1个月后检查，一切化验正常，无毒性反应。亚急性和毒性试验未见异常，对猪、禽、鸟、鱼、蜂的急性和慢性饲喂养试验未见不正常现象，对家蚕敏感。无致癌、致畸、致突变作用。注意事项： [1]本品对家蚕有毒，蚕室和桑园附近禁用； [2]不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用(如乐果、甲基内吸磷、稻丰散、伏杀硫磷、杀虫畏)及碱性农药等物质混合使用。

苏云金杆菌使用注意事项及作用机理

苏云金杆菌苏云金杆菌（简称Bt）是目前商业开发最为成功的微生物杀虫剂。当前全世界每年生产的Bt制剂约有7000～10000吨，年销售额已达1.5亿美元，其中欧洲国家产量在2000 吨左右，占欧洲国家生物农药总量的90%。 Bt制剂的研究与利用始于20世纪30年代，因其生产设备较为简单，使用比较方便，尤其是它可有效地防治150多种鳞翅目幼虫（其中有些是重要的经济害虫），因此，70年代以后，Bt制剂便成为防治农田和仓库害虫的重要生物杀虫剂之一。美国环保局已将其指定为用于大田作物、果树、蔬菜和观赏植物的主要生物农药，并将它用于仓库害虫的防治。晶体或孢子的混合物进入敏感幼虫体内后，这种没有杀虫活性的原毒素被碱性肠液活化，并在中肠蛋白酶作用下进一步转化为有杀虫活性的δ-内毒素。δ-内毒素能破坏幼虫肠壁的上皮细胞，使幼虫停止取食，从而中毒死亡。幼虫致死的时间取决于昆虫种类和剂量。使用苏云金杆菌杀虫剂注意事项温度：细菌生物农药杀虫剂的活性成分是蛋白质晶体和有生命的芽孢。在低温条件下（15℃以下），蛋白晶体不易发生作用。15℃以下或30℃以上使用Bt都基本无效，但在相对高温下更能发挥作用，一般在30℃左右时最好，害虫死亡速度较快。湿度：细菌生物农药杀虫剂中细菌的芽孢喜欢潮湿环境，因此，在田间湿度越大药效越高。阳光：阳光中的紫外线对芽孢有杀伤作用。所以，喷施细菌生物农药最好再傍晚或阴天进行。雨水：喷施细菌生物农药后短期内，如遇大雨，会降低药效。本品对蜜蜂有毒，对家蚕高毒；对鱼类等水生生物有毒。不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用。对人、畜无毒，使用安全。选择性强，不伤害天敌。不污染环境，不影响土壤微生物的活动，连续使用，无残毒，不易产生抗性。

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208 专题介绍Review 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2* 1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@https://www.wendangku.net/doc/3d10016001.html, 摘要迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在进行测序中。已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组 Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensis Tan Shouhu 1,3 Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2* 1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@https://www.wendangku.net/doc/3d10016001.html, Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.Keywords Bacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome 基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。自1995年首次完成流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae )的全基因组序列以来，已有大量的微生物菌株基因组全序列测定完成。截止到2009年2月3日，全球已经完成基因组测序的微生物菌株有834株，有643株微生物菌株的基因组正处在拼接阶段，此外，有797株微生物菌株的基因组由于各种原因只完成了基因组草图。在已经完成测序的微生物中，有779株为真细菌，55株为古生菌(https://www.wendangku.net/doc/3d10016001.html,/genomes/lproks.cgi)。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt )在《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)中被列为第2类第18群中的芽孢杆菌属。与蜡状芽孢杆菌(B.cereus )，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis )同属于蜡状芽孢杆菌群细菌(Rasko et al.,2005)。 Bt 广泛存在于土壤、虫尸、污水、淤泥、尘埃以及叶面等介质中，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌也是一种典型的昆虫病原菌，对鳞翅目(Lepidoptera )、双翅目(Diptera )、鞘翅目(Coleoplera )、膜翅目(Hymenoptera )、同翅目(Ho － moptera )、直翅目(Orthoplera )、食毛目(Mallophaga )等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异的毒性活性，由此成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的农业害虫生物防治细菌(Crickmore et al.,1998;喻子牛等,1996)。

苏云金杆菌(2014551355)

品名：苏云金杆菌（无添加任何化学杀虫成分）有效含量：16000iu/mg 剂型：可湿性粉剂净含量：100克一、作用方式及特点苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌，英文名称：Bacillus thuringiensis （B.t.）即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌（Bt菌）杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。Bt的杀虫活性物质,主要有二种,即晶体和孢子.晶体又叫原毒素,它是一种蛋白质。当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素—毒性肽。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，肠道内碱性内含物漏入血腔，孢子和菌体通过被破坏的肠壁进入体腔。使其呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的，不象化学农药作用那么快，但染病后的害虫，上吐下泻，不吃不动，不再危害作物。毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD50 852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒,对害虫天敌无伤害。中毒症状: 吞服了制剂可能引起胃肠炎。中毒急救：溅到皮肤或眼内立即用清水冲洗15分钟后就医。吸入，应将病人移到通风处，就医。误服，立即催吐，并送医院对症治疗。二、杀虫原理苏云金杆菌长得像根棍棒，矮矮胖胖,身高不到5‰毫米。当它长到一定阶段，身体一端会形成一个卵圆形的芽孢，用来繁殖后代；另一端便产生一个菱形或近似正方形的结晶体，因为它与芽孢相伴而生，我们叫它伴孢晶体，有很强的毒性。昆虫取食后，晶体蛋白在昆虫碱性肠道内溶解，经过中肠蛋白酶的酶解作用，将前毒素降解为活性蛋白。活性蛋白插入昆虫中肠细胞膜，形成跨膜离子通道或孔，破坏钾离子平衡，最终使昆虫中毒，麻痹而死。三、防治对象 Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等100多种害虫和动植物线虫有很好的毒杀作用。国内外应用统计，Bt对64种森林害虫，34种果树害虫，12种茶树害虫都显示高毒力。最常用具特效的防治对象有：菜青虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟、棉铃虫、棉小造桥虫、茶毛虫、茶尺蠖、松毛虫、天幕毛虫、毒蛾、刺蛾等鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等害虫有很好的防治效果，且有杀卵作用。此外对大豆拌种防治地下线虫也有特效。四、使用方法 1.一包100克可兑水100斤 2.可放农用喷雾器里（一喷雾30斤水），也可放园艺喷雾（800ml约可配18桶/1500ml 可配10桶。记得喷撒之前先过滤沉淀物哦，以免塞住喷壶嘴) 3.杀虫剂苏云金杆菌制剂可用于喷雾、喷粉、灌心、制成颗粒剂或毒饵等，也可进行大面积飞机喷洒，也可与低剂量的化学杀虫剂混用以提高防治效果。草坪害虫的防治用100亿孢子/g的菌粉750g／hm2对水稀释2000倍喷洒，或用乳剂1500～ 3000g/hm2与52.5～75kg的细沙充分拌匀，制成颗粒剂撒人草坪草根部，防治危害根部的害虫。也可将苏云金杆菌致死的发黑变烂的虫体收集起来，用纱布袋包好，在水中揉搓，每50g虫尸洗液加水50～l00kg 喷雾（病毒重复利用！）。(2)防治蔬

苏云金杆菌

苏云金杆菌杀虫剂苏云金杆菌简称Bt，是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌。可用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。目前世界上研究最深入, 应用最广泛的微生物杀虫剂, 对人畜安全, 不伤害控制害虫群体的天敌, 不污染环境, 是生物防治害虫的重要组成部分, 更适合农作物虫害的综合防治。苏云金杆菌是一种微生物源低毒杀虫剂，以胃毒作用为主。该菌可产生两大类毒素，即内毒素（伴胞晶体）和外毒素，使害虫停止取食，最后害虫因饥饿和死亡而外毒素作用缓慢，在蜕皮和变态时作用明显，这两个时期是RNA合成的高峰期，外毒素能抑制依赖于DNA的RNA 聚合酶。该药作用缓慢，害虫取食后2天左右才能见效，持效期约1天，因此使用时应比常规化学药剂提前2～3天，且在害虫低龄期使用效果较好。由于苏云金杆菌制剂的杀虫活性物质是一种毒性晶体蛋白与活菌的混合物, 其防效易受强光、温度和雨水的影响。最适宜使用苏云金杆菌的温度是24～32℃, 不适宜温度为13～17℃, 雨水主要影响施药的残效期。使用苏云金杆菌杀虫剂一定要在阴天或晴天下午4点以后施药于害虫危害部位。对鱼类、蜜蜂安全，但对家蚕高毒。苏云金杆菌一般对暴食叶片的鳞翅目害虫防效好, 对结苞、卷叶、钻蛀性害虫防治技术性强。如: 2 代棉铃虫发育世代较整齐, 前代成虫产卵主要在棉株嫩尖上, 且初孵幼虫有食卵壳的习性, 防治2代棉铃虫, 主要喷在棉株顶部嫩叶正反面, 即可达到防治效果。稻纵卷叶螟幼虫两龄前结苞较松, 傍晚转苞危害, 防治它应在其幼虫2 龄前, 傍晚施药。玉米螟幼虫在玉米心叶末期, 有群聚喇叭口内危害习性,只要用苏云金杆菌对着喇叭口喷雾或拌毒土撒施入喇叭口内即可。小菜蛾( 吊丝虫) 幼虫2 龄前, 喜在十字花科作物叶背群聚食叶肉, 这是防治的最适期。豆荚螟, 本着治花不治荚的原则, 在日出前重点喷在蕾、花、嫩荚和落地花上。第2 代茶毛虫的初孵幼虫,有群聚叶背取食叶肉习性, 用苏云金杆菌防治应掌握这一时机。苏云金杆菌杀虫剂混用性能好，苏云金杆菌杀虫剂与化学农药交替使用可克服害虫的抗化学农药性。Bt杀虫剂可与多种其它生物制剂、昆虫生长调节剂、菊酯类沙蚕毒素类、氨基甲酸酯类、有机磷类农药及部分杀菌剂和化学肥料现混现用。

苏云金芽孢杆菌的研究——综述

苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。 1Bt的发展历史 1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。 1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。 1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。1981年，Schnept和Whiteley 首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。用血清学技术进行Bt的鉴定和分类始于20世纪60年代。我国对苏云金芽孢杆菌的研究和应用起步较晚，但发展迅速，据统计，在在70年代，我国苏云金杆菌制剂年产量大1000吨以上，并且部分产品用于出口。 1992年联合国“世界环境和发展大会”在巴西的召开促进了全球生物防治的发展，推进了苏云金杆菌制剂产业化进程。世界上许多科学家致力于Bt的研究，并作出卓越贡献，时至今日，Bt在农药上所占的比例仍处于劣势，许多问题依然有待解决。 2 苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体的纯化方法 2.1等密度梯度离心法等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂质分离,获得纯品的方

苏云金芽孢杆菌作业

发酵工艺学作业题目苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展学院班级学号姓名

苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望 Review on fermentation of Bacillus thuringiensis Abstract:Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类

苏云金杆菌说明书

苏云金杆菌说明书篇一：常用农药安全技术说明书常用农药安全技术说明书目录百菌清......................................................................................................... 1 甲基托布津................................................................................................... 2 甲霜灵......................................................................................................... 3 福美双......................................................................................................... 4 多菌灵......................................................................................................... 5 井冈霉素...................................................................................................... 6 辛硫磷.........................................................................................................7 苏云金杆菌 (8) 1. 百菌清

枯草芽孢杆菌发酵探讨

[转载]枯草芽孢杆菌发酵探讨枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。 1、枯草芽孢杆菌的生物学特点杆菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，电子显微镜测量为（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革兰氏阳性，运动，有长而又丰富的周生鞭毛。芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。生长温度：最高温度45～55℃；最低温度5～20℃。阳性反应：接触酶；V-P反应；在7％的氯化钠中生长；pH5.7生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀

粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。阴性反应：厌氧生长；卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。在55℃生长的菌株被0.02％的叠氮化合物抑制。变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0～8.0)；对溶菌酶的抗性；在10％的氯化钠中生长。2、芽孢杆菌制剂的作用机理2.1可产生酶类和营养物质研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。研究表明一些芽孢杆菌产生SOD酶，SOD可以清除生物体内活性氧自由基，减少其对细胞的毒害作用，使生物体免受伤害。芽孢杆菌在生长繁殖过程中可以产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低动物肠道的pH，从而为乳酸菌的生长创造条件，并且抑制病菌的生长。其中丙酸还可以参与三梭酸循环，为动物的新陈代谢提供能量。同时，能够产生

苏云金杆菌对环境生物的安全性评价

Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(1), 63-70 Published Online January 2018 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/3d10016001.html,/journal/ojns https://https://www.wendangku.net/doc/3d10016001.html,/10.12677/ojns.2018.61010 Safety Evaluation of Bacillus thuringiensis to Environmental Organisms Zeqing Wang1,2, Fanmin Huang1,3, Jianhua Chen1,3 1Guangdong Engineering Research Center of Microbe Pesticides, Yangjiang Guangdong 2Guangzhou Harit Bioscience CO. LTD, Guangzhou Guangdong 3Guangdong New Scene Biological Engineering CO. Ltd., Yangjiang Guangdong Received: Jan. 1st, 2018; accepted: Jan. 12th, 2018; published: Jan. 19th, 2018 Abstract This study evaluates the safety of Bacillus thuringiensis GDX026 to environmental organisms based on degrees of toxicity and division standards. The results showed that the toxic degree of Bacillus thuringiensis8000 IU/μL SC to birds, bees, zebrafish, Daphnia, Trichogramma and silk-worm was Ib. The toxic degrees of Bacillus thuringiensis·Indoxacarb 5% SC to bees, silkworm and Daphnia magna was I b, to zebrafish and Trichogramma was II and low toxicity to birds. The toxic degrees of Emamectinbenzoate·Bacillus thuringiensis2.4% SC of silkworm and Daphnia magna was Ia, Ib to bees and zebrafish, II to Trichogramma and no risk to birds. Mixture of Bacillus thu-ringiesis GDX026 and chemical pesticides showed higher risk levels to environmental organisms compared with Bacillus thuringiesis GDX026. Keywords Bacillus thuringiensis, Environmental Organisms, Safety Evaluation 苏云金杆菌对环境生物的安全性评价王泽清1,2，黄番敏1,3，陈建华1,3 1广东省微生物农药工程技术研究中心，广东阳江 2广州禾立田生物科技有限公司，广东广州 3广东新景象生物工程有限公司，广东阳江收稿日期：2018年1月1日；录用日期：2018年1月12日；发布日期：2018年1月19日

微生物杀虫剂苏云金杆菌液体发酵技术的研究

农业环境保护1998,17(6):248 250 A gr o_environ mental P rotection 微生物杀虫剂苏云金杆菌液体发酵技术的研究张俊亭李治祥张克强黄士忠 (农业部环境保护科研监测所,天津300191) 摘要采用不同固形物含量的发酵液,确定出苏云金杆菌发酵液的最佳碳氮比为 1:2.5。不同固形物含量发酵液的试验证明,采用高固形物含量(9%)的发酵液在生产上可有效降低生产费用。应用造价低、便于维修、抵御感染能力强、节能省电的气升式发酵罐对B.t 进行发酵,发酵液不用浓缩其效价就达到国家行业标准(H a 2275IU / L),很适宜在实际生产上采用。关键词苏云金杆菌液体发酵碳氮比气升式发酵罐收稿日期:1998-04-17 苏云金杆菌(Bacillus thrin g iensis ,B.t)是一种杀虫效果良好的微生物农药, 可以应用于多种害虫的防治[1、2] 。B.t 的液体发酵在生产上应用最多,它的杀虫毒力与其发酵水平有着密切的关系。M eg na [3] 采用固形物在3% 4%左右的发酵液来培养,最终发酵液含活孢子20 50亿/mL 。Drake 等 [4] 则采用了固形物含量6% 10%的发酵液,最终的活孢子数达到140亿/m L 。在配方的成本上来看,国外用料成本比较高;而国内由于产品售价低,只能采用一些比较便宜的原料。我们采用了廉价的农产品原料(豆饼粉等),来研究苏云金杆菌的液体发酵技术。研究表明,苏云金杆菌的活孢子数与杀虫毒力之间虽有一定关系,但用活孢子数来表示杀虫效价是不科学的。我们选用棉铃虫作供试害虫,来评价发酵液的杀虫效价。 1材料与方法 1.1菌种 Bacillus thr in g iensis H D-11.2斜面培养基牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,氯化钠 0.5%,琼脂2.0%,余量为水。 1.3发酵配方的筛选发酵的基本配方为豆粉4%,玉米粉3%,酵母粉1%,鱼粉1%和碳酸钙0.2%。在此基础上,通过变换配方的碳氮比,通过摇瓶试验来确定发酵培养基各组分的最佳配比。将选定发酵配方的发酵液20m L 装入250m L 三角瓶,灭菌后,接活化后的斜面菌苔一大环。在30 下进行摇床振荡培养10 12h,作为种子。然后,以3%的量加入到灭菌处理过并含有20mL 培养液的250mL 三角瓶中。在30 恒温条件下摇床振荡培养28 32h 。发酵液均按稀释平板计数方法对菌体进行计数[5]。将发酵液在玻片上染色,在油镜下计数测定晶孢比。 1.4发酵促进剂的筛选在选出最佳发酵培养基配方的基础上,分别向内添加1%玉米糖浆、微量元素(硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁,1%溶液)、1%氨基酸(18种氨基酸混合物)、1%螺旋藻粉等营养物质,期望它们能使发酵水平有所提高。上述发酵液经灭菌后,用摇