融合蛋白柔性linker的选择
蛋白融合Linker的设计与选择
接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为
一条单一的肽链, 其中起连接作用的氨基酸称为Linker[1]。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影响目的蛋白各自的功能。因此, Linker序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。
针对Linker序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的研究主要有两种, 即螺旋形式的Linker肽如[A(EAAAK)nA]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分, 使之能在互不干扰的情况下充
分折叠成各自的天然构象。Ryoichi等[3]在两种不同功能的融合蛋白之间插入
了不同类型的linker序列, 包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性linker 以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发现螺旋状的linker同柔性linker及PA一样, 可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 甚至可增强融合蛋白的功能。Linker的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Linker 的长度过长, 则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感, 导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降; 应用较短的Linker, 可以克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相
距太近导致蛋白功能的丧失。Linker的长度不应小于 nm , 这是由于相邻肽键
的距离为 nm, 因此连接肽至少应包含10个氨基酸。目前最为常用的是Huston
设计合成的(GGGGS)3序列。研究发现, 连接肽为(Gly4Ser)3的融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且柔软, 在复性时能够降低
融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。所以, Linker 的长度不能过长也不能过短。
Linker的选择, 还应考虑Linker内部的氨基酸序列, 研究发现, Linker组成相同但序列不同时, 构建的融合蛋白的稳定性存在显著差异; 编码Linker的核苷酸组成, 调整编码Linker的核苷酸组成, 虽不改变原接头Linker 的氨基酸
序列, 但融合蛋白的表达存在显著差异。Linker序列中有太多的α螺旋和β
角结构会限制融合蛋白的伸缩性, 进而影响融合蛋白的生物学活性。总之, Linker的选择不是一成不变的, 而要根据融合蛋白分子的大小和特性来决定。
细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一大类多功能、高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反应及对各类免疫活性细胞的分化、发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是当今免疫学研究的一个热点方向。该方法是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性而各自作用靶点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一起, 其融合基因表达产物既具有其组成
因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高, 还可能会通过生物学活性的互补及协同
效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备的复合生物学功能, 甚至还可能会产生一些新的结构及生物学功能, 这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和良好的发展前景。早在1986年Seno等用含EcoR I的12个核苷酸(4肽)CCGGAATTCATG为接头, 将IFNγ和IL 2片段加以连接, 结果发现产生的融合蛋白具有IFNγ与IL2的双重活性。迄今为止, 国内外已相继报道了多种有价值的细胞因子融合蛋白。现就细胞因子融合蛋白技术的原则、构建类型、应用现状以及发展前景做一简要概述。
1 细胞因子蛋白融合技术
蛋白融合的构建原则基因工程构建细胞因子融合蛋白须满足以下几个条件: (1)各融合分子的目的DNA片段置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)的控制之下。(2)融合分子间须以富含疏水性氨基酸的接头Linker连接, 同时也要考虑接头序列的长度和核苷酸、氨基酸的组成、排列顺序等因素。如融合蛋白内部接头的不同, 可导致融合蛋白各部分化学结构的改变, 而影响到各融合分子的空间构象, 导致其生物学活性差异。所以, 设计肽链之间的接头时, 要尽可能不影响两端蛋白的自然折叠, 使各融合成分互不干扰。(3)为了保证融合蛋白的生物学活性, 还需考虑构成融合蛋白各成份本身的特性及其相互作用机制。如肿瘤坏死因子(TNF)和α干扰素(IFNα)在抑制肿瘤细胞、增强抗病毒活性等方面有协同作用。有学者构建了TNF和IFNα的融合蛋白, 但发现该融合蛋白的抗病毒和抗肿瘤活性与单独应用TNF和IFNα相比, 抗病毒活性降低24倍, 抗肿瘤活性降低15倍, 与构建融合蛋白的初衷相背。分析原因, 可能是这两种细胞因子的理化性质差异较大, IFNα活性稳定, 而TNF活性极易丧失, 其融合蛋白在一定程度上影响了彼此的活性。
蛋白融合Linker的设计与选择接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链, 其中起连接作用的氨基酸称为Linker[1]。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影响目的蛋白各自的功能。因此, Linker序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。
针对Linker序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的研究主要有两种, 即螺旋形式的Linker肽如[A(EAAAK)nA]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分, 使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象。Ryoichi等[3]在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的linker序列, 包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性linker以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发现螺旋状的linker同柔性linker及PA一样, 可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 甚至可增强融合蛋白的功能。Linker的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Linker 的长度过长, 则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感, 导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降; 应用较短的Linker, 可以克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近导致蛋白功能的丧失。Linker的长度不应小于 nm , 这是由于相邻肽键的距离为 nm, 因此连接肽至少应包含10个氨基酸。目前最为常用的是Huston设计合成的(GGGGS)3序列。研究发现, 连接肽
为(Gly4Ser)3的融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且柔软, 在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域的
正确折叠。所以, Linker 的长度不能过长也不能过短。
Linker的选择, 还应考虑Linker内部的氨基酸序列, 研究发现, Linker组成相同但序列不同时, 构建的融合蛋白的稳定性存在显著差异; 编码Linker的核苷酸组成, 调整编码Linker的核苷酸组成, 虽不改变原接头Linker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表达存在显
著差异。Linker序列中有太多的α螺旋和β角结构会限制融合蛋白的伸缩性, 进而影响
融合蛋白的生物学活性。总之, Linker的选择不是一成不变的, 而要根据融合蛋白分子的
大小和特性来决定。
2 细胞因子融合方式及其应用
根据细胞因子融合分子的不同, 可把细胞因子融合蛋白大致分成以下几类:
不同或相同细胞因子的融合蛋白细胞因子具有多功能性和通用性, 其作用的靶点各
有不同。利用细胞因子的这一特点, 可以通过基因融合技术创制出更佳的细胞因子融合蛋白, 其融合基因表达产物很可能表现出双因子简单配伍所没有的复合功能, 而且有可能会增强
各个组份间的协同作用。
IL3和GM CSF均为造血刺激因子, 它们对不同发育阶段的造血干细胞及祖细胞均具有促增殖和分化的作用, 且共用受体β链。鉴于两者功能互补, Curtis等于1991年构
建并报道了第一个由不同细胞因子组成的融合蛋白人GM CSF/IL3和IL3/GM
CSF融合蛋白, 分别称为PlXY321和PIXY344。为确保其各自的天然构象, 在GM
CSF与 IL3两者之间均引入了一段疏水氨基酸序列, 从而保证其与受体的结合。体外受体结合实验证明, PIXY321与只表达IL3受体的JM1细胞株或只表达GM CSF的HL60细胞株结合时其亲和力比单体略高, 说明该融合蛋白可经IL3、 GM CSF结构域与其各自的受体结合。同时, PIXY321对AML193细胞株的增殖作用及刺激骨髓集落的形成都明显高于单独使用IL3、 GM CSF或IL3加GM CSF的作用, 其作用可提高5～10倍。
IL2、 IL6是两个具有多种免疫调节活性的细胞因子。1992年Fernad等构建了两个人IL2/IL6融合基因, 目的在于构建表达一种具有双重功能的免疫调节因子, 实验表明融合蛋白与野生型IL2的活性一致, 较IL6活性中度下降。出现此结果的原因可能是由于局部构象的改变或者是IL2与IL6之间的相互作用干扰所致。体外进一步研究表明, 该融合蛋白既可诱导T、 B细胞表达IL2R和IL6R, 并且还可作为分子桥梁促进和稳定T、 B细胞间的相互作用。国内的赵春华等也构建和高效表达了具有促进细胞集落形成、促进LAK的增殖作用的IL2/IL6融合蛋白。将两种相同的细胞因子融合在一起也可以起到明显的生物学功能。马大龙等构建了人双体IL6、双体IL3融合
蛋白, 研究表明双体IL6与单体IL6在生物学活性上差别不大, 但双体IL3对人骨髓细胞的集落刺激作用明显高于单体IL3的作用。
IL7是T、 B淋巴细胞成熟分化过程中重要的细胞因子, 可以增强成熟T细胞的增殖及其功能, 并有促进CTL增殖、分化并加强其杀伤活性, 刺激LAK细胞活性的能力。Lai 等[4]用一段柔性接头将IL7和人肝细胞生长因子β片段( hepatocyte growth factor beta2 chain, HGF beta)连接, 结果发现融合蛋白能选择性的高效刺激B祖细胞系的增殖。
胰岛素样生长因子(IGF)常与其他生长因子一起发挥协同作用, 是最好的二联细胞因子融合蛋白的备选因子。IGF II可刺激多种组织中细胞的增殖或分化。将IGF II与一段信号肽以及胰岛素样的昆虫激素bomyxin的N端序列融合表达, 便可得到分泌形式的具有生物活性的BOM IGF。Difalco等制备了一种BOM IGF和IL3的融合蛋白, 体外试验中它可刺激正常外周血细胞中的骨髓干细胞集落形成, 体内试验结果亦显示该融合蛋白能动员具有高度增殖活性的骨髓干细胞进人外周血, 进而定居至脾脏而发挥造血功能。
细胞因子与其受体的融合蛋白细胞因子与其受体结合时, 可促进其与其他相关分子的结合, 进而提高其生物学活性的发挥。
IL6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL6和IL6Ra (gp80)的结合使其易于和另一个受体IL6Rβ(gp130)结合。可溶性IL6R蛋白(sIL6R)与IL6结合后, 靶细胞对IL6的敏感性增高, 并可使仅表达膜结合型IL6R的细胞(IL6Rа/gp130)对IL6起反应。在sIL6R/IL6双基因转染的小鼠中, sIL6R发挥锚定IL6的作用, 延长血浆IL6半衰期, 同时细胞对IL6的敏感性显著提高。
Bcl2蛋白家族是细胞程序性死亡的重要调节因子, Bcl XL是Bcl2蛋白家族中的重要成员之一, 它能在多种类型的细胞上抑制由各种刺激所诱发的细胞死亡。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)具有刺激粒细胞和巨噬细胞集落增长的能力, 其功能的发挥依赖于它与GM CSF特异性受体的结合。Antonella等[5]将人GM CSF与Bcl XL蛋白融合, 该融合蛋白可与人单核细胞/巨噬细胞和骨髓祖细胞的上的GM CSF受体结合诱导其增殖, 并使Bcl XL进入细胞抑制细胞的死亡, 加速细胞的增殖。
细胞因子与抗原融合蛋白某些细胞因子可以招募抗原提呈细胞(APC), 促进APC 的
成熟和信号转导, 调节T细胞的功能, 从而提高机体对抗原的免疫应答。因此, 人们通过基因融合技术, 将细胞因子与抗原融合, 使其更好的发挥基因佐剂作用。
肿瘤细胞表达的免疫球蛋白(独特型, Id)可以作为肿瘤特异性抗原, 在B细胞淋巴瘤中已证明用免疫球蛋白的可变区(即独特型)免疫动物, 可保护动物免受随后的肿瘤攻击。Tao 等从B淋巴瘤细胞(38C13)分离出Id, 将其与GM CSF基因融合, 构建了Id与GM CSF 融合蛋白, Id的免疫原性显著增强, 可诱导出具有抗肿瘤作用的特异性抗Id抗体。随后Chen等又构建了Id IL2和Id IL4两种融合蛋白, 均具有比较高的免疫原性。用Id IL 2融合蛋白进行免疫可产生高滴度的抗独特型抗体IgG2a和lgG3, 而Id IL4和Id GM CSF融合蛋白则无此作用。这3种融合蛋白都能诱导抗独特型抗体的产生, 且不需要载体蛋白和佐剂。杨登科等[6]构建了结核分枝杆菌的Ag85B和IL2嵌合基因疫苗, 研究发现该融合蛋白具有Ag85B和IL2的双重功能活性, 两者融合后产生协同作用, 在体外促进了外周血单核细胞的增殖和Th1型细胞因子的分泌。Hitoki等[7]构建了IL12和鼠疫耶尔森菌F1V融合蛋白(IL12/F1V, 荚膜蛋白抗原(F1Ag), 毒力抗原(V Ag))
共表达基因疫苗, 研究发现, 用肺鼠疫攻毒后, IL12(低表达)/F1V相比IL12(低表达)/F1、 IL12(低表达)/V和IL12(低表达)/载体(vector) DNA疫苗而言, 80%的小鼠获得保护。Mark等[8]构建了豚鼠髓脂质碱性蛋白(guinea pig myelin basic protein, GPMBP; neuroantigen or NAg)的主要致脑炎肽和白细胞介素16(IL16)融合蛋白, 研究发现该融合蛋白是路易鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的有效抑制剂并证实IL16是研制致耐受性疫苗的最佳候选细胞因子。
细胞因子与抗原融合产生的佐剂效应, 可能比游离的细胞因子产生的佐剂效应具有更多的优点。因而, 在疫苗研究中, 细胞因子作为免疫佐剂越来越受到人们的重视。
细胞因子与抗体融合蛋白将抗体分子的片段与细胞因子融合, 该融合蛋白不但结合了抗体与抗原特异性结合的特性, 还具有细胞因子的多功能活性, 从而可借助抗体将细胞因子导向到特定的靶部位, 使其高效发挥生物学功能, 减轻全身毒副作用。
IL2是免疫反应的重要介导分子, 也是重要的抗肿瘤细胞因子之一。在体外, IL2可促使细胞毒性T细胞、 NK细胞及辅助T细胞增殖、诱导产生细胞毒性的细胞因子, 诱导LAK细胞增殖。抗体IL2融合蛋白可将IL2靶向肿瘤灶, 提高肿瘤局部IL2的浓度, 从而达到更好的抗肿瘤效应, 同时也有助于减轻IL2的毒性。Heuser等构建了抗黏蛋白的scFv Fc IL2融合蛋白(C595 scFv Fc IL2), 实验表明此融合蛋白能同时特异性地结合MUCI+的肿瘤细胞和CD25+的免疫效应细胞。体外试验还发现, 该融合蛋白能刺激活化的T细胞增殖, 介导静息的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。在免疫重建的SCID
鼠黑色素瘤肝、肺转移瘤模型中, 肿瘤特异性的融合蛋白Ch225 IL2和 IL2可抑制转移灶的生长, 甚至在注射肿瘤细胞后8 d, 肿瘤己形成情况下, 也能完全消退微转移病灶。该研究表明借助抗体将细胞因子导向到肿瘤部位的免疫治疗方法可有效对抗人类黑色素瘤的播散。
Reinartz等将IL6与抗独特型单克隆抗体重组, 制备了chACA125IL6融合蛋白并将其用于卵巢癌的研究。小鼠抗独特型单抗ACA125模拟卵巢癌细胞上的CA125抗原, 可诱导抗-抗独特型抗体反应, 该反应与卵巢癌患者生存时间呈正相关。试验结果表明: 融合蛋白接种后抗CA125(Ab3)的浓度较IL6与chACA联用高, 且未观察到抗人IL6抗体的产生, 而联用情况下可以检测到抗人IL6抗体产生。
IL12是介导先天免疫及细胞免疫的重要细胞因子, 具有很强的抑制肿瘤及阻止肿瘤转移的活性。在体外, IL12对于肿瘤细胞没有直接的作用, 但IL12能激活T细胞及NK细胞, 刺激CD4+ T细胞向Th1细胞分化, 后者产生的细胞因子可激活CTL 和巨噬细胞。IL12也是血管形成的强效抑制剂, 可通过诱导IFNγ等的分泌抑制血管形成, 进而抑制体内肿瘤的生长。纤连蛋白(fibronectin, FN)为一种高分子量多功能糖蛋白, 是血管形成的标志, 主要聚集于新生血管的周围, 在肿瘤的浸润事件中起重要作用。Halin等采用抗FN的scFv L19与IL12融合, 发现该融合蛋白具有强大的抗肿瘤活性, 可导致肿瘤组织中的T细胞、 NK细胞及巨噬细胞浸润。此外, 在鼠肿瘤肺转移动物模型中证实, 应用该融合蛋白治疗比应用等量的IL12具有更强的抗转移效应。
GM CSF能刺激造血细胞的增殖及分化, 也是一种多功能的免疫调节因子。GM CSF
能提高各种APC的抗原提呈及促进单核细胞表达MHC II类分子、粒细胞表达黏附分子及刺激T细胞增殖。动物试验证实, 注射GM CSF后, 通过增强T细胞免疫, 能提高抗肿瘤疫苗的保护效应。Helguera等将鼠GM CSF与HER2抗体融合, 观察到该融合蛋白既保持
了与人HER2/neu抗原的特异性结合能力, 同时也保持了与重组鼠GM CSF相似的生物学活性, 在小鼠体内能够明显抑制表达HER2/neu的肿瘤细胞生长, 能同时增强Th1和Th2型细胞的免疫应答。
细胞因子与毒素融合蛋白细胞因子与毒素的融合蛋白是以细胞因子取代毒素分子的
识别区域, 使毒素蛋白能选择性地杀伤含有相应细胞因子受体的靶细胞, 从而达到治疗那
些细胞因子引起病理性作用的疾病, 如自身免疫性疾病、移植排斥反应等。肿瘤细胞因其恶性增殖、缺少接触抑制的特性, 不同肿瘤细胞均有其异于正常组织细胞的受体特征, 将细胞因子与毒素蛋白融合, 可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境,
使该融合蛋白能选择性杀伤含有相应细胞因子受体的靶细胞, 实现靶向肿瘤的治疗作用。
白喉毒素具有高效的细胞毒性, 利用其与不同的目的基因融合成的各种毒素复合物,
可对表达一些特异性受体或蛋白的细胞产生杀伤作用, 尤其是一些肿瘤细胞。体外试验表明, 白喉毒素IL2的融合蛋白(DAB389IL2)对表达高亲和力IL2受体的细胞株起毒性作用, 而缺乏完整的高亲和力受体的细胞株(有p55亚单位而无p75亚单位)则对该融合毒素相对耐受。Saleh等报道DAB389 IL2在皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma, CTCL)Ⅰ期临床试验中单独使用显示出显著的临床治疗效果。DAB389IL2已成为美国食品与药品管理局(FDA)批准的临床治疗药物。张建新等基于骨髓瘤、原发性肝癌等肿瘤细胞表面IL6受体可过度表达的事实, 用IL 6 cDNA取代白喉毒素的受体结合区, 构建表达了白喉毒素/IL6融合蛋白。研究表明, 此种融合蛋白对表面有大量IL6受体的骨髓瘤细胞(U266)有较强的细胞毒作用而IL6受体较少的正常细胞对其有一定的耐受性。
前列腺特异性抗原启动子(prostate specific antigen promoter, PSPA)具有高度的组织特异性, 仅在PSPA阳性的前列腺癌细胞中表达。Yu等构建了以人免疫缺陷病毒为基础的病毒表达载体, 在该载体中使PSPA和DTA(白喉毒素A基因)基因形成融合基因。结果表明, PSPA可以高效、特异地在前列腺癌细胞中启动DTA基因表达并产生自杀作用。体外实验表明, 它在雄激素存在的情况下可以杀死PSA阳性的前列腺癌细胞。在异种移植PSA阳性的前列腺癌细胞鼠体内试验证实, 可以使肿瘤细胞快速退化, 并使其存活时间超过一年而
没有肿瘤的进展, 但在PSA阴性的对照却没有这种效果。这一研究结果表明转染基因可以对进展的前列腺肿瘤产生治疗效果。
假单胞菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A, PE)为不可逆性蛋白合成抑制剂, 将其细胞结合域删除即为PE40, 其仅表现出极低的细胞和动物毒性。将编码TGFα的基因与
PE40基因融合, 其表达产物既有TGFα受体结合活性又保留有PE的细胞毒性。某些肿
瘤如人类胰腺癌组织过度表达上皮生长因子受体(EGF receptor), 其配体之一即TGF
α。实验证明TP40这一双功能蛋白能抑制或杀伤表达高水平EGF受体的肿瘤细胞。
细胞因子与血清白蛋白融合血清白蛋白是血浆的重要成分, 正常情况下不易透过肾
小球, 体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性, 是理想的药物载体。白蛋白融合技术具有
以下优点: 白蛋白与目标蛋白在细胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接, 不需额外的体外处理; 白蛋白的表达水平较高, 与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平; 白蛋白是一个稳定的“惰性”蛋白, 与其融合后可以提高目的蛋白的稳定性; 白蛋白融合蛋白具有较长的药物半衰期。如人血清白蛋白(HAS)自身在血浆中的半衰期长达19 d, 将小分子蛋白药物与HSA融合可有望提高在血液中的半衰期。目前, 多种蛋白与HSA 融合后在实验动物体内半衰期的延长得到了证实。
唱韶红等用毕赤酵母中表达的HSA hIFNα2b融合蛋白在猕猴体内的半衰期约为普通 IFNα的20 倍。美国马里兰州人类基因组科学(HGS)公司进行了一系列HSA融合蛋白质药物的研究, HSA/IFNα融合蛋白[9]、 HSA/IFNβ 融合蛋白(albuferon
β)[10]、 HSA/rIL 2 融合蛋白(albuleukin)[11]、 HSA/rG CSF 融合蛋白(albugranin)[12]、 HSA/rHGH 融合蛋白(albutropin)[13]都具有明显的半衰期延长作用。
3 细胞因子融合蛋白技术在兽医学领域的发展前景
细胞因子的种类繁多且每一种细胞因子的作用又具有多样性, 其在机体内环境中的相互作用更为复杂, 因而细胞因子融合蛋白的研究几乎涵盖了所有常见的细胞因子。在功能上相关的细胞因子或分子, 其融合蛋白的生物学活性若能够高于或等于各个组份简单相加的效果, 即具有其他单体分子无法比拟的高效性, 便有构建融合蛋白分子的意义[14]。其次, 细胞因子融合蛋白在与特定的靶向性分子结合之后, 可将有一定毒性的细胞因子选择性的、特异性的浓集于病灶局部, 使全身性的不良反应降至最低点, 即具有某些单体细胞因子所不具有的特异性, 也是融合蛋白的研究方向之一。此外, 诸多融合蛋白虽有衍生因子的双重活性, 但其活性较野生型低或在实际应用中与衍生因子配伍不明显, 解决分子的生物学活性与毒副作用问题是细胞因子融合蛋白发展的实践需求。但是, 细胞因子融合蛋白也有其缺点, 如在重复使用时由于已产生了中和抗体而抑制了其活性的发挥。因此, 在构建细胞因子融合蛋白时, 必须慎重选择所融合的细胞因子, 并且在设计中尽可能降低分子量以减少免疫原性。
融合蛋白技术是一种很有发展潜力的生物工程技术, 在肿瘤治疗研究中[15], 很多制品已进入了临床试验, 并取得了令人鼓舞的进展。目前, 有关动物细胞因子的研究也得到了迅猛发展, 一些重组细胞因子已在动物疾病的预防、治疗和诊断, 特别是在发展安全、高效基因工程疫苗等方面显示出广阔的应用前景。相信在不远的将来, 人们可以应用细胞因子融合蛋白技术设计和获得高表达、高活性的融合蛋白制剂, 从而为动物疾病的防控带来新的希望。
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Protein_domains/Linker
LINKER 查询网址
Linker的选择
1.short linker The sequence produced the amino acids Gly-Gly-Ser-Gly.
Ggtggttctggt
2.Middle Linker ( Gly-Gly-Ser-Gly)x2
Ggtggttctggt Ggtggttctggt
3.long linker (Gly-Gly-Ser-Gly)x3
Ggtggttctggt Ggtggttctggt Ggtggttctggt
4.15 aa long GGGGSx3 linker ggtggaggaggttctggaggcggtggaagtggtggcggaggtagc
蛋白质序列分析
蛋白质序列、性质、功能和结构分析 基于网络的蛋白质序列检索与核酸类似，从NCBI或利用SRS系统从EMBL 检索。 1、疏水性分析 ExPASy的ProtScale程序（https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,/cgi-bin/protscale.pl）可用来计算蛋白质的疏水性图谱。输入的数据可为蛋白质序列或SWISS-PROT数据库的序列接受号。也可用BioEdit、DNAMAN等软件进行分析。 2、跨膜区分析 蛋白质跨膜区域分析的网络资源有： TMPRED：https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,/software/TMPRED_form.html PHDhtm: http:www.embl-heidelberg.de/Services/sander/predictprotein/predictpro tein.html MEMSAT: ftp://https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html, 3、前导肽和蛋白质定位 一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。这就是信号肽假说的基础。这一假说认为，穿膜蛋白质是由mRNA编码的。在起始密码子后，有一段疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就称为信号序列（signal sequence）。 蛋白质序列的信号肽分析可联网到http://genome.cbs.dtu.dk /services/SignalP/或其二版网址 http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/。该服务器也提供利用 e-mail进行批量蛋白质序列信号肽分析的方案 （http://genome.cbs.dtu.dk/services /SignalP/mailserver.html），e-mail 地址为signalp@ genome.cbs.dtu.dk。 蛋白质序列中含有的信号肽序列将有助于它们向细胞内特定区域的移动，如前导肽和面向特定细胞器的靶向肽。在线粒体蛋白质的跨膜运输过程中，通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽或引肽（leader peptide）共同组成。迄今有40多种线粒体蛋白质前导肽的一级结构被阐明，它们约含有20~80个氨基酸残基，当前体蛋白跨膜时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解转变成成熟蛋白质，同时失去继续跨膜能力。前导肽一般具有如下性质：①带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列中间；②缺失带负电荷的酸性
融合蛋白定义
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
GST融合蛋白构建、表达与纯化
GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点
3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s
GST融合蛋白的纯化步骤
GST融合蛋白的纯化步骤 一、制取细胞的裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS缓冲液; 2.加入溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min; 3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min; 5.4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 二、纯化GST融合蛋白： 1.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 3.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 5.重复步骤3和4两次； 6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： 1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; 3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： 1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS 的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 3.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。 查询关键词：GST融合蛋白的纯化步骤，GST蛋白纯化步骤，蛋白纯化 试验用的生化试剂，本公司均可以提供，如有需要，请联系我们，我们将为您提供最满意的服务。
融合蛋白标签
在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。 如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极促进了对重组蛋白的有效纯化。 根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。 短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，
GST-Pull-Down原理
分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。
蛋白质数据库
生物芯片北京国家工程研究中心 湖南中药现代化药物筛选分中心 暨湖南涵春生物有限公司 常用数据库名录 1、蛋白质数据库 PPI - JCB 蛋白质与蛋白质相互作用网络 ?Swiss-Prot - 蛋白质序列注释数据库 ?Kabat - 免疫蛋白质序列数据库 ?PMD - 蛋白质突变数据库 ?InterPro - 蛋白质结构域和功能位点 ?PROSITE - 蛋白质位点和模型 ?BLOCKS - 生物序列分析数据库 ?Pfam - 蛋白质家族数据库 [镜像： St. Louis (USA), Sanger Institute, UK, Karolinska Institutet (Sweden)] ?PRINTS - 蛋白质 Motif 数据库 ?ProDom - 蛋白质结构域数据库 (自动产生) ?PROTOMAP - Swiss-Prot蛋白质自动分类系统 ?SBASE - SBASE 结构域预测数据库 ?SMART - 模式结构研究工具 ?STRING - 相互作用的蛋白质和基因的研究工具
?TIGRFAMs - TIGR 蛋白质家族数据库 ?BIND - 生物分子相互作用数据库 ?DIP - 蛋白质相互作用数据库 ?MINT - 分子相互作用数据库 ?HPRD - 人类蛋白质查询数据库 ?IntAct - EBI 蛋白质相互作用数据库 ?GRID - 相互作用综合数据库 ?PPI - JCB 蛋白质与蛋白质相互作用网络 2、蛋白质三级结构数据库 ?PDB - 蛋白质数据银行 ?BioMagResBank - 蛋白质、氨基酸和核苷酸的核磁共振数据库?SWISS-MODEL Repository - 自动产生蛋白质模型的数据库 ?ModBase - 蛋白质结构模型数据库 ?CATH - 蛋白质结构分类数据库 ?SCOP - 蛋白质结构分类 [镜像: USA | Israel | Singapore | Australia] ?Molecules To Go - PDB数据库查询 ?BMM Domain Server - 生物分子模型数据库 ?ReLiBase - 受体/配体复合物数据库 [镜像： USA] ?TOPS - 蛋白质拓扑图 ?CCDC - 剑桥晶体数据中心 (剑桥结构数据库 (CSD))
GST融合蛋白的纯化
GST融合蛋白的纯化 诱导和收集菌体 在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。IPTG浓度一般为 0.1～1.0mM。 5000rpm 5min离心收集菌体。 亲和层析柱的制备 取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。 将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。 每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。 在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。 将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。 收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。 0.45um过滤后加入亲和层析柱。 室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。 用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。 配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。 用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。 测各管洗脱液蛋白浓度。 PAGE电泳检测纯度。 亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。或者按照beads使用说明书上的方法再生。 如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。 如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
生物信息研究中常用蛋白质数据库的总结
生物信息研究中常用蛋白质数据库简述 内蒙古工业大学理学院呼和浩特孙利霞 2010.1.5 摘要：在后基因组时代生物信息学的研究当中，离不开各种生物信息学数据库。尤其在蛋白质从序列到功能的研究当中，目前各种行之有效的方法都是基于各种层次和结构的蛋白质数据库。随着计算机技术及网络技术的发展，目前的蛋白质数据库不论是所包含数据量还是功能都日新月异，新的数据库层出不穷。一个新手面对如此浩瀚的数据量往往无从下手。本文粗浅地为目前蛋白质数据库的使用勾画出一个轮廓，作为自己蛋白质研究入门的一个引导。 关键词：蛋白质；数据库 0 引言 随着科技的发展，个人的知识往往赶不上快速膨胀的信息量，人们为了解决这个问题，便创建了形形色色的数据库。蛋白质数据库是指：在蛋白质研究领域根据实际需要，对蛋白质序列、蛋白质结构以及文献等数据进行分析、整理、归纳、注释，构建出具有特殊生物学意义和专门用途的数据库。蛋白质数据库总体上可分为两大类：蛋白质序列数据库和蛋白质结构数据库，蛋白质序列数据库来自序列测定，结构数据库来自X-衍射和核磁共振结构测定（详见图1）。这些数据库是分子生物信息学的基本数据资源。上世纪90年代，我国从事蛋白质研究的学者使用的蛋白质数据库储存介质还是国外实验室发布的激光光盘[1]。信息的传播储存甚为不便。随着蛋白质研究的发展飞快，同时伴随着计算机和因特网发展，蛋白质数据库的储存传播方式也发生的巨大的变化。进入21世纪后，我们所用的各种蛋白质数据库都发展成为存储在网络服务器上，基于“服务器—客户机”的访问查询方式。伴随着计算机及物理测试技术的发展数据库的容量和功能成数量级膨胀。但是面对如此浩瀚的数据，新手往往感到无从下手，在需要时找不到自己需要的合适数据库。 本文从目前蛋白质数据库建立的的逻辑层次出发，系统地简绍了常用蛋白质数据的概况，它们的查询方法以及它们相互之间的联系。同时尽量不涉及数据库建设和维护方面的计算机和网络这些数据库底层的技术，为蛋白质研究的入门者及对蛋白质感兴趣的人员的一个引导。
GST蛋白纯化步骤
制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。
分子机制-蛋白检测-GST-pulldown
主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：
蛋白质结构预测和序列分析软件
蛋白质结构预测和序列分析软件蛋白质数据库及蛋白质序列分析 第一节、蛋白质数据库介绍 一、蛋白质一级数据库 1、 SWISS-PROT 数据库 SWISS-PROT和PIR是国际上二个主要的蛋白质序列数据 库，目前这二个数据库在EMBL和GenBank数据库上均建 立了镜像 (mirror) 站点。 SWISS-PROT数据库包括了从EMBL翻译而来的蛋白质序 列，这些序列经过检验和注释。该数据库主要由日内瓦大 学医学生物化学系和欧洲生物信息学研究所(EBI)合作维 护。SWISS-PROT的序列数量呈直线增长。 2、TrEMBL数据库： SWISS-PROT的数据存在一个滞后问题，即 进行注释需要时间。一大批含有开放阅读 了解决这一问题，TrEMBL(Translated E 白质数据库，它包括了所有EMBL库中的 质序列数据源，但这势必导致其注释质量 3、PIR数据库： PIR数据库的数据最初是由美国国家生物医学研究基金 会（National Biomedical Research Foundation, NBRF） 收集的蛋白质序列，主要翻译自GenBank的DNA序列。 1988年，美国的NBRF、日本的JIPID（the Japanese International Protein Sequence Database日本国家蛋 白质信息数据库）、德国的MIPS（Munich Information Centre for Protein Sequences摹尼黑蛋白质序列信息 中心）合作，共同收集和维护PIR数据库。PIR根据注释 程度(质量)分为4个等级。 4、 ExPASy数据库： 目前，瑞士生物信息学研究所（Swiss I 质分析专家系统（Expert protein anal 据库。 网址：https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html, 我国的北京大学生物信息中心(www.cbi.
GST融合蛋白纯化方法
GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清； 7重复步骤6 两次； 8加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min； 92000 g，3 min离心，收集上清； 10重复步骤8-9至少两次； 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度； 12将蛋白置于-20℃保存。 P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条 Thrombin cleavage (using thrombin produced by Amersham) 1. Thrombin cleavage of eluted fusion protein bound to Sepharose * Mix 50 μl of thrombin (< 10 cleavage U/ml) solution and 950 μl of 1 x PBS for each ml of Glutathione Sepharose bed volume Add thrombin protease mixture to Glutathione Sepharose pellet Gently shake or rotate the suspension at r.t. for 2-16 h Centrifuge the suspension at 500 x g for 5’ to pellet the beads and carefully transfer the eluted fraction to a clean tube. 2. Thrombin cleavage of eluted fusion protein. Add 10 μl of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein. If the amount of fusion protein in the eluate has not been determined, add 80 μl (80 U) of thrombin for each ml of Glutathione Sepharose bed volume from with the fusion protein was eluted. Mix gently and incubate at r.t. (22-25C) for 2-16 h. Once digestion is complete, GST can be removed by first removing glutathione by extensive dialysis (2,000 vol/ml) against 1 x PBS followed by batch purification.
蛋白质结构预测和序列分析软件
蛋白质结构预测和序列分析软件 2010-05-08 20:40 转载自布丁布果 最终编辑布丁布果 4月18日 蛋白质数据库及蛋白质序列分析 第一节、蛋白质数据库介绍 一、蛋白质一级数据库 1、 SWISS-PROT 数据库 SWISS-PROT和PIR是国际上二个主要的蛋白质序列数据库，目前这二个数据库在EMBL和GenBank数据库上均建立了镜像 (mirror) 站点。 SWISS-PROT数据库包括了从EMBL翻译而来的蛋白质序列，这些序列经过检验和注释。该数据库主要由日内瓦大学医学生物化学系和欧洲生物信息学研究所(EBI)合作维护。SWISS-PROT 的序列数量呈直线增长。2、TrEMBL数据库： SWISS-PROT的数据存在一个滞后问题，即把EMBL的DNA序列准确地翻译成蛋白质序列并进行注释需要时间。一大批含有开放阅读框(ORF) 的DNA序列尚未列入SWISS-PROT。为了解决这一问题，TrEMBL(Translated EMBL) 数据库被建立了起来。TrEMBL也是一个蛋白质数据库，它包括了所有EMBL库中的蛋白质编码区序列，提供了一个非常全面的蛋白质序列数据源，但这势必导致其注释质量的下降。 3、PIR数据库： PIR数据库的数据最初是由美国国家生物医学研究基金会（National Biomedical Research Foundation, NBRF）收集的蛋白质序列，主要翻译自GenBank的DNA序列。 1988年，美国的NBRF、日本的JIPID（the Japanese International Protein Sequence Database 日本国家蛋白质信息数据库）、德国的MIPS（Munich Information Centre for Protein Sequences摹尼黑蛋白质序列信息中心）合作，共同收集和维护PIR数据库。PIR根据注释程度(质量)分为4个等级。4、 ExPASy数据库： 目前，瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics, SIB）创建了蛋白质分析专家系统（Expert protein analysis system, ExPASy ）。涵盖了上述所有的数据库。网址：https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html, 我国的北京大学生物信息中心(https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,) 设立了ExPASy的镜像（Mirror）。 主要蛋白质序列数据库的网址 SWISS-PROT https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,/sprot 或 https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,/expasy_urls.html TrEMBL https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,/sprot PIR https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,/pirwww MIPS——Munich Information Centre for Protein Sequences http://mips.gsf.de/ JIPID——the Japanese International Protein Sequence Database 已经和PIR合并 ExPASy https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html, 二、蛋白质结构数据库 1、PDB数据库：
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(强克)说明书(完整)
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白使用说明书 【药品名称】 通用名：注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 商品名：强克 英文名：Recombinant Human TNF Receptor-Ig Fusion Protein for Injection 汉语拼音：Zhusheyong Chongzu Ren Erxing Zhongliuhuaisiyinzi Shouti －Kangti Ronghedanbai 【性状】 本品为无菌白色冻干粉针剂。 【主要成分】 每瓶含重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25毫克，甘露醇40毫克，蔗糖10毫克，三羟甲基氨基甲烷1.2毫克。用1毫升灭菌注射用水溶解。【药理毒理】 1.药理重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白是一个二聚体的融合蛋白，包含人75KDa肿瘤坏死因子受体（TNFR）（p75）的细胞膜外配体结合部分与人IgG1的Fc片段，包含934个氨基酸，表观分子量约为150K道尔顿（KDa）。 TNF是机体自然产生的一种细胞因子，参与正常的炎症和免疫反应。在强直性脊柱炎关节病变的炎症反应中，TNF起着重要的作用。TNF存在55KDa蛋白（p55）和75KDa蛋白（p75）两类受体，它们均以单体的形式存在于细胞表面。TNF的生物学活性取决于它与细胞表面两类受体分子的结合。 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的作用机制是竞争性地与TNF 结合，阻止TNF与细胞表面TNF受体的结合，抑制TNF的生物学活性。 2.毒理小鼠急性毒性试验结果显示，静脉注射1.09g/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见毒性反应。猴长期毒性试验结果显示，每周2次连续皮下注射180天15.0 mg/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见有明显的毒性。 【药代动力学】
GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化
收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.wendangku.net/doc/3d11140186.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴 爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031) 摘 要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2 pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3 重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3
《重组结核杆菌融合蛋白(EC)临床应用专家共识》(2020)要点
《重组结核杆菌融合蛋白（EC）临床应用专家共识》（2020）要点 结核分枝杆菌（MTB）感染和菌阴肺结核的准确诊断是结核病防控的两个难点和重要问题。重组结核杆菌融合蛋白（EC）是通过基因工程方法表达MTB特异的ESAT-6和CFP-10两种蛋白的融合蛋白，这两种蛋白在卡介苗菌株中缺失，可诱导特异的迟发型变态反应(DTH)以鉴别MTB感染状态。在传染病国家科技重大专项支持下自主研发的EC，已作为新型MTB 感染皮肤试验的检测试剂通过了国家药品监督管理局药品审批而准予上市在当前我国结核病疫情防控形势下，EC对MTB感染和菌阴肺结核的诊断具有重要的应用价值。 一、全球结核病疫情形势 结核病是由MTB感染引起的慢性传染病，严重威胁人类健康，位列全球十大死因之一，是单一传染病中的头号杀手。中国是结核病高负担国家之一。研究结核感染诊断新技术、新方法对加速结核病疫情下降、实现终止结核病目标具有十分重要的意义。 二、结核感染与发病 LTBI的定义是一种对MTB抗原刺激具有持续免疫反应的状态，但没有活动性结核病的临床表现证据，有时也叫结核感染。LTBI没有病原学诊断依据，只能通过检测机体的免疫反应来诊断。《中国结核病预防控制工作技术规范（2020年版）将结核感染检测和预防纳入结核病预防治疗的重要内容。 结核病诊断的另一个瓶颈是菌阴肺结核的诊断，而儿童结核病多表现为菌
阴肺结核。我国发布的《WS288-2017肺结核诊断》中，将TST、IGRA 和血清抗体检测都纳入了肺结核辅助诊断的方法,其目的是通过提供结核感染证据提高菌阴肺结核的诊断水平。EC是主要针对解决LTBI诊断和菌阴肺结核的辅助诊断等问题而研发的新产品。 三、现行结核感染的免疫学检测方法 （一）TST TST是基于型DTH的一种皮肤试验%常用的反应原是纯蛋白衍生物(PPD)。我国1979--2000年进行的4次全国结核病流行病学调查都采用TST作为儿童结核感染筛查的手段。由于PPD有200多种抗原成分，与卡介苗和非结核分枝杆菌（NTM）有大量相同或相似的抗原成分,导致TST 很容易发生交叉反应。因此，TST出现假阳性的可能性较大,特别是在非结核分枝杆菌（NTM）的高流行地区。 (二)IGRA 机体感染MTB以后，血液中存在着特异的效应K淋巴细胞。当机体再次接触MTB特异性抗原时，效应K淋巴细胞将特异性地产生和分泌γ干扰素(IFN-γ)通过定量检测释放的IFN-γ的水平或计数,来判定患者是否存在LTBI。由于其特异度较高，在临床菌阴肺结核和肺外结核的个体确认方面具有较高的应用价值。 (三)抗原抗体检测 该方法也已纳入我国《WS288-2017肺结核诊断》,作为菌阴肺结核的辅助诊断 技术。