猪流行性腹泻病毒CH_S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

中图分类号：Ｓ　８５２．６５９．６　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７３－４６９６（２０１１）０１－００３１－

０５猪流行性腹泻病毒ＣＨ／Ｓ株Ｍ蛋白全长的

原核表达及其反应原性分析

张志榜，陈建飞，时洪艳，陈小金，冯　力＊

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨　１５０００１

） 摘要：根据猪流行性腹泻病毒（

ＰＥＤＶ）ＣＨ／Ｓ株Ｍ蛋白的基因组序列，设计了１对引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｍ基因，将其克隆至原核表达载体ｐＭＸＢ１０，构建了重组质粒ｐＭＸＢ－Ｍ，

经测序鉴定正确后转化感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３），并进行了ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示，重组菌ｐＭＸＢ－Ｍ表达的融合蛋白ＭＢＰ－Ｍ－ＣＢＤ（ｒＭ）的分子质量约为９５ｋｕ，在ＩＰＴＧ浓度为０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、

诱导时间为６ｈ时，重组菌的表达效果最好，重组蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ结果显示，ｒＭ能与兔抗ＰＥＤＶ多克隆抗血清及ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白单克隆抗体发生特异的免疫印迹反应，表明原核表达的ｒＭ蛋白具有良好的反应原性，这为进一步开展ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白的研究奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒；Ｍ蛋白；

原核表达；免疫印迹Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｐ

ｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ　ＣＨ／Ｓ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ

ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉ－ｂａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ－ｆｅｉ，ＳＨＩ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎ，ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏ－ｊ

ｉｎ，ＦＥＮＧ　Ｌｉ（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　

ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｗｉｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　

ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５０００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｎｅ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　

ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｍ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ（ＰＥＤＶ）ＣＨ／Ｓ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　Ｍ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＸＢ１０ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＭＸＢ－Ｍ．Ａｆｔｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＩＰＴＧ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ－Ｍ－ＣＢＤ）ｏｆ　９５ｋｕ．Ｉｎ　ｒｅｓｕｌｔ，ｉｎ－ｄｕｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ　ｆｏｒ　６ｈｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉ－ｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗａｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｌｄｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＰＥＤＶ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　

ａｇａｉｎｓｔ　Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＰＥＤＶ　ｉｎ　Ｗｅｓ－ｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ　ｔｅｓｔｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ　ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｌａｉｄ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ＰＥＤＶ　Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ；Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ 猪流行性腹泻（ｐ

ｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ，ＰＥＤ）是由猪流行性腹泻病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉ－ａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）引起猪的一种急性肠道传染病，其主要特征是严重的肠炎、呕吐和水样腹泻。各年龄段的猪均易感，

其中１～２周龄的仔猪最易感，死亡率高达９０％［１］

。ＰＥＤ疫情首次报道于比利时和英国［２］

，我国从２０世纪８０年代初以来也陆续出现该病的流行［

３－

４］。目前该病已成为重要的猪病毒性腹泻病，给我国及其他养猪国家造成了很大的经济损失。

收稿日期：２０１０－０８－１２；修回日期：２０１０－１１－

２９基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目（２００６ＢＡＤ０６Ａ０７

）作者简介：张志榜（１９８４），男，河南濮阳人，硕士生。＊通讯作者，Ｔｅｌ：１８９４６０６６１４４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇ

ｌｉ＿ｈ＠１６３．ｃｏｍ中国兽医科学　２０１１，４１（０１）：３１－

３５Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　

Ｓｃｉｅｎｃｅ

ＰＥＤＶ属于尼多病毒目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）冠状病毒科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）冠状病毒属（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ），其基因组是不分节段的单股正链ＲＮＡ，５′端有一个帽子结构（ｃａｐ），３′端有一个Ｐｏｌｙ（Ａ）尾［５］。ＰＥＤＶ基因组全长约２８　０３３ｂｐ（ＣＶ７７７，ＡＦ３５３５１１），编码４种主要的结构蛋白：纤突蛋白（ｓｐｉｋｅ，Ｓ）、小膜蛋白（ｓｍａｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｓＭ）、核蛋白（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ，Ｎ）和膜蛋白（ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｍ）［６］。Ｍ蛋白是一种跨膜蛋白，该蛋白在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用；在补体存在的条件下，抗Ｍ蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性［７－８］；另外，Ｍ蛋白能介导机体产生α－干扰素（α－ＩＦＮ）［９］。对已知的冠状病毒的研究表明，Ｍ蛋白还与病毒引起的细胞凋亡有密切关系［１０］，Ｍ蛋白在病毒侵染的早期可抑制宿主细胞基因的转录［１１］。因此，表达ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白对ＰＥＤＶ病毒粒子增殖情况的研究以及ＰＥＤ的诊断和预防具有重要意义。

冠状病毒Ｍ基因的表达比较困难。已有关于犬、猪及人ＳＡＲＳ冠状病毒的Ｍ蛋白得到表达的报道，但均存在表达量很低甚至表达不完全的现象［１２］。Ｕｔｉｇｅｒ等［１３］报道了ＰＥＤＶ　Ｍ基因在昆虫细胞中的表达，但表达产物比预期的蛋白明显截短，其原因尚不清楚。高慎阳等［１４］对ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白的表达进行了尝试，成功表达了Ｍ蛋白的膜外区，但没有完全确定Ｍ蛋白全长的表达。张晓丽等［１５］采用原核表达载体ｐＭＡＬ－ｃＲＩ，将ＳＡＲＳ　Ｍ蛋白的Ｎ端和Ｃ端分别融合了ＭＢＰ和ＣＢＤ，最终实现了ＳＡＲＳ　Ｍ蛋白全长的表达。本试验为了获得Ｍ蛋白的完整表达，参考张晓丽等［１５］表达ＳＡＲＳ冠状病毒Ｍ蛋白时的策略，采用了原核载体ｐＭＸＢ１０，期望获得Ｍ蛋白全长的表达，并利用ＭＢＰ标签能提高蛋白可溶性的特点希望实现Ｍ蛋白的可溶性表达。最终，本试验表达出了完整的Ｍ蛋白，但表达产物为包涵体形式。

１　材料与方法

１．１　病毒、血清和单抗

ＰＥＤＶ　ＣＨ／Ｓ株由本实验室保存。兔抗ＰＥＤＶ阳性血清、ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白单克隆抗体由本实验室制备。Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＭＢＰ　ｓｅｒｕｍ和Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＣＢＤｓｅｒｕｍ购于Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ公司。

１．２　菌种和质粒

菌株ＪＭ１０９、ＢＬ２１（ＤＥ３）由本实验室保存，表达载体ｐＭＸＢ１０购自Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ公司。１．３　引物的设计与合成

参照ＰＥＤＶ　ＣＨ／Ｓ株基因组序列，应用软件Ｐｒｉｍｅｒ５．０和Ｏｌｉｇｏ６．０设计了１对Ｍ基因的表达引物，上游引物Ｍｆ：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡ－ＡＣＧＧＴＴＣＴＡＴＴＣ，下游引物Ｍｒ：ＣＣＣＣＴＣＧＡＧ－ＧＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＣ，在上、下游引物的５′端分别引入了ＨｉｎｄⅢ和ＸｈｏⅠ酶切位点（下划线部分），预期扩增的片段大小为６９６ｂｐ。该引物对由北京Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。

１．４　主要试剂

ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｍ－ＭＬＶ反转录酶和ＲＮＡ酶抑制剂为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；限制性核酸内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ公司；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ　ＨＳＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ购自大连宝生物工程有限公司；ＩＰＴＧ和氨苄青霉素购自Ｓｉｇｍａ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的山羊抗兔ＩｇＧ和ＨＲＰ标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ购自北京中杉金桥公司；ＤＮＡ凝胶纯化试剂盒和质粒小提试剂盒购自Ａｘｙｇｅｎ公司。１．５　Ｍ基因的克隆

１．５．１　病毒ＲＮＡ的提取　参考ＴＲＩｚｏｌ操作说明书提取ＰＥＤＶ　ＣＨ／Ｓ株的总ＲＮＡ，所有器皿和试剂均经焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）去ＲＮａｓｅ处理。１．５．２　ＲＴ－ＰＣＲ　反转录体系组成：ＲＮＡ　１５．７５μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ下游引物１μＬ，５×Ｍ－ＭＬＶ缓冲液５μＬ，ｄＮＴＰｓ（各１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２５μＬ，ＲＮＡ酶抑制剂１．０μＬ，Ｍ－ＭＬＶ反转录酶１μＬ，混匀后置于４２℃水浴１．５ｈ，７０℃水浴１０ｍｉｎ。ＰＣＲ反应：５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ缓冲液１０μＬ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，上、下游引物各１μＬ，ｃＤＮＡ　２μＬ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭＨＳ　ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，用灭菌去离子水补至５０μＬ。ＰＣＲ反应程序：９４℃５ｍｉｎ；９８℃１０ｓ，５５℃１０ｓ，７２℃４５ｓ，３０个循环，最后７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物于１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下检测。

１．６　重组表达质粒的构建

ＰＣＲ产物和表达载体ｐＭＸＢ１０均用ＨｉｎｄⅢ＋ＸｈｏⅠ双酶切，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将两者连接，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９，涂布于含５０μＬ／ｍＬ氨苄青霉素（Ａｍｐ）的ＬＢ平板，３７℃培养过夜。次日挑取单菌落接种于２ｍＬ含５０μＬ／ｍＬ　Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，３７℃摇菌过夜。以碱裂解法小量制备质粒，重组质粒用特异性引物进行ＰＣＲ和酶切鉴定，将初步鉴定为阳性的质粒送北京华大基因公司测序，阳性质粒命名为ｐＭＸＢ－Ｍ。

１．７　重组质粒的诱导表达

将测序鉴定正确的重组表达质粒转化ＢＬ２１

２

３中国兽医科学第４１卷

（ＤＥ３），涂布于含５０μＬ／ｍＬ　Ａｍｐ的ＬＢ平板上，３７℃培养过夜。次日挑单菌落接种于２ｍＬ含５０μＬ／ｍＬ　Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，３７℃摇菌过夜。次日，按１∶１００比例接种到相同培养基中，待Ｄ４５０ｎｍ值达０．６时，取１ｍＬ菌液作为阴性对照，其余菌液加入ＩＰＴＧ至０．８ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃诱导，每隔１ｈ测其Ｄ６００ｎｍ值，待Ｄ６００ｎｍ值不再增加时，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收获菌体，处理后于８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳检测。

１．８　重组蛋白的可溶性分析

收集诱导表达的菌体，冰浴条件下进行超声波破碎，再超声５ｓ，停１０ｓ，超声１０ｍｉｎ。然后，４℃１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，分别取上清和沉淀进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。

１．９　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析

取表达的蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，并用半干转膜仪转膜，用５０ｍＬ／Ｌ脱脂乳封闭后，分别以兔抗ＰＥＤＶ阳性血清、ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白单克隆抗体、兔抗ＭＢＰ血清、兔抗ＣＢＤ血清为一抗，ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ和ＨＲＰ标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ为二抗，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，最后用ＤＡＢ显色。

２　结果

２．１　Ｍ基因的克隆

提取病毒ＲＮＡ后，经反转录得到病毒ｃＤＮＡ，用特异性引物进行ＰＣＲ扩增，结果显示，出现１条与预期片段大小相符的目的条带（见图１）。经测序验证，插入片段为Ｍ基因，且不存在碱基的插入、缺失或移码突变

。

图１　Ｍ基因的ＰＣＲ扩增

Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ　ｇｅｎｅ

Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：Ｍ基因的扩增产物；２：阴性对照

Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｍ　ｇｅｎｅ；２：Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎ－ｔｒｏｌ

２．２　重组表达质粒的酶切鉴定

分别用ＨｉｎｄⅢ＋ＸｈｏⅠ、ＮｄｅⅠ＋ＸｈｏⅠ双酶切重组质粒ｐＭＸＢ－Ｍ，结果获得了７　７９８ｂｐ的载体

片段和６９６ｂｐ的插入片段、６　６７６ｂｐ的载体片段和１　８１８ｂｐ的重组片段，获得片段的大小与预期结果相符（见图２），证明重组载体ｐＭＸＢ－Ｍ构建成功

。

图２　重组质粒的双酶切鉴定

Ｆｉｇ．２　Ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１：重组质粒ｐＭＸＢ－Ｍ的ＮｄｅⅠ＋ＸｈｏⅠ双酶切产物；２：重组质粒ｐＭＸＢ－Ｍ的ＨｉｎｄⅢ＋ＸｈｏⅠ双酶切产物

Ｍ：ＤＬ２０００ｐｌｕｓⅡＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓ－ｍｉｄ　ｐＭＸＢ－Ｍ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮｄｅⅠ＋ＸｈｏⅠ；２：Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅ－ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＭＸＢ－Ｍ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨｉｎｄⅢ＋ＸｈｏⅠ

２．３　表达产物的鉴定

取诱导不同时间的重组菌裂解产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，经考马斯亮蓝Ｒ２５０染色。结果显示，重组菌诱导裂解物在约９５ｋｕ处有１条特异的蛋白条带，大小与预期值相符，而未诱导的重组菌没有该条带（见图３），空载体诱导则出现约７０ｋｕ的条带，为甘露糖结合蛋白（ＭＢＰ）和几丁质结合蛋白（ＣＢＤ）的复合体。重组菌在诱导后第６小时的表达量最大。可溶性分析显示，重组蛋白以不溶性的包涵体形式存在于菌体中

。

图３　诱导表达的ｒＭ蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析

Ｆｉｇ．３　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒＭ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｉｎ－ｄｕｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ

Ｍ：蛋白质分子质量标准；１～６：重组菌ｐＭＸＢ－Ｍ经ＩＰＴＧ分别诱导１、２、３、４、５、６ｈ的表达产物；７：重组菌ｐＭＸＢ－Ｍ未诱导的表达产物；８：空载体ｐＭＸＢ１０诱导的表达产物

Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ；１－６：Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍ　ｐＭＸＢ－Ｍｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ　ｆｏｒ　１，２，３，４，５ａｎｄ　６ｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；７：Ｐｒｏｄｕｃｔｆｒｏｍ　ｐＭＸＢ－Ｍ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ；８：Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍｐＭＸＢ１０ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ

３

３

第１期 张志榜等：猪流行性腹泻病毒ＣＨ／Ｓ株Ｍ蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

２．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｏｌｔ分析

表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析后，转移至硝酸纤维素膜上进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析。结果显示，表达产物ｒＭ能被兔抗ＰＥＤＶ多克隆抗血清识别（见图４）

。

图４　融合蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析

Ｆｉｇ．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ

Ａ：一抗为兔抗ＭＢＰ血清；Ｂ：一抗为兔抗ＣＢＤ血清；Ｃ：一抗为兔抗

ＰＥＤＶ血清；Ｄ：一抗为ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白单抗；Ｍ：蛋白质分子质量标

准；１：ｐＭＸＢ－Ｍ的诱导产物；２：ｐＭＸＢ１０的诱导产物

Ａ：Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＭＢＰ　ｓｅｒｕｍ；Ｂ：Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ

ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＣＢＤ　ｓｅｒｕｍ；Ｃ：Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓ　ｒａｂｂｉｔ

ａｎｔｉ－ＰＥＤＶ　ｓｅｒｕｍ；Ｄ：Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ

ａｇａｉｎｓｔ　Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＰＥＤＶ；Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ；１：

Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍ　ｐＭＸＢ－Ｍ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ；２：Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍ　ｐＭＸＢ１０

ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ

３　讨论

ＰＥＤＶ是主要引起２周龄仔猪以呕吐、腹泻、脱

水为特征的一种急性肠道传染病，死亡率达

１００％［１６］，已成为世界范围内猪的重要疫病之一。

ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白在该病毒粒子的增殖过程中起

重要作用，并具有良好的抗原性。因此，表达ＰＥＤＶ

Ｍ蛋白对研究ＰＥＤＶ病毒粒子的增殖情况以及

ＰＥＤ的诊断和预防具有重要意义。

冠状病毒Ｍ蛋白的表达比较困难。犬冠状病

毒的Ｍ蛋白得到了表达，但表达量很低［１７］。高慎

阳等［１４，１７－１８］和吴凌等［１９］已经用原核系统表达出了

ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白的膜外区，表达产物为包涵体形式。

本试验为了表达全长的ＰＥＤＶ　Ｍ蛋白，起初采

用了ｐＴＸＢ１和ｐＴＹＢ１１两种原核表达载体，设想

将Ｍ基因全长分别克隆到这２个载体上，表达融合

蛋白Ｍ－ＣＢＤ或ＣＢＤ－Ｍ。这样设计的用意，一是看

标签在Ｍ蛋白的左侧或右侧是否对蛋白的表达有

影响，二是考虑到这两种载体本身的特点，即表达的

融合蛋白在遇到还原剂（如ＤＴＴ）时，标签可自动从

融合蛋白上断掉，可以很方便地去除标签，并实现目

的蛋白的纯化。但将Ｍ基因全长准确无误地克隆

到这２个表达载体，经ＩＰＴＧ诱导后，没有表达目的

蛋白。根据相关文献的报道，Ｍ蛋白在表达过程中

存在溶菌现象，导致表达量很低或不表达。Ｍ蛋白

引起大肠杆菌细胞裂解的原因目前还不清楚。构建

的ｐＴＸＢ－Ｍ和ｐＴＹＢ－Ｍ重组载体不表达目的蛋白

可能与上述现象相似。本试验参考张晓丽等［１５］表

达ＳＡＲＳ　Ｍ蛋白全长的策略，采取在Ｍ蛋白的氨

基端添加ＭＢＰ标签，羟基端加上ＣＢＤ标签，以实现

Ｍ蛋白的完整表达。同时设想用ＭＢＰ提高融合蛋

白的可溶性，而ＣＢＤ标签可以通过还原剂的作用自

动从融合蛋白ＭＢＰ－Ｍ－ＣＢＤ上断掉，并藉此实现目

的蛋白的纯化。最终实现了Ｍ蛋白全长的表达，但

融合蛋白ＭＢＰ－Ｍ－ＣＢＤ上的ＣＢＤ标签没有像预期

的那样能用还原剂将其除去。通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ

验证，ｒＭ具有反应原性。因此，尽管表达的ｒＭ所

带的标签比较大，但仍然有希望用ｒＭ作诊断试剂

或作为免疫原制备血清或作抗原检测相关的抗体，

为进一步的研究打下了基础。

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ｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓ－

ｃｅｎｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　ａｎｄ　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｉｎ－

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［５］　ＫＮＩＰＥ　Ｄ　Ｍ，ＨＯＷＬＥＹ　Ｐ　Ｍ，ＧＲＩＦＦＩＮ　Ｄ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｒｏｎａ－

ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　Ｆｉｅｌｄｓ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ［Ｍ］．４ｔｈ　ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ

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ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ－ｆｅｉ，ＦＥＮＧ　Ｌｉ，ＳＨＩ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａ－

ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ

ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ　ＣＨ／Ｓ　ｓｔｒａｉｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ４

３中国兽医科学第４１卷

Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，２９（１１）：８５６－８６１．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）

［７］　ＣＯＲＮＥＬＩＳ　Ａ　Ｍ，ＫＵＯ　Ｌ，ＭＡＳＴＥＲＳ　Ｐ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ：ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｍ－ｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，１９９８，７２（８）：６８３８－６８５０．

［８］　ＲＯＴＴＩＥ　Ｐ　Ｊ　Ｍ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｍ］／／ＳＩＤＤＥＬ　Ｓ　Ｇ．Ｔｈｅ　Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，１９９５：１１５－１３９．

［９］　ＦＡＮ　Ｊ　Ｈ，ＬＩ　Ｙ　Ｊ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ　ｇｅｎｅｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ　ＬＪＢ／０３［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｓ，２００５，３０（１）：６９－７３．

［１０］　ＫＯＰＥＣＫＹ　Ｓ　Ａ，ＷＩＬＬＩＮＧＨＡＭ　Ｍ　Ｃ，ＬＹＬＥＳ　Ｄ　Ｓ．Ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ａｎｏｔｈｅｒ　ｖｉｒａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ

ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ

［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５（２４）：１２１６９－１２１８１．

［１１］　ＫＯＰＥＣＫＹ　Ｓ　Ａ，ＬＹＬＥＳ　Ｄ　Ｓ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ａｎｄ　ＢＨＫ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖｅ－

ｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ａｒｅ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘ－

ｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２００３，７７（８）：４６５８－４６６９．

［１２］　ＷＡＮＧ　Ｌ　Ｆ，ＧＯＵＬＤ　Ａ　Ｒ，ＳＥＬＬＥＣＫ　Ｐ　Ｗ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｅｑｕｉｎｅ　ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＥＭＶ）ｍａｔｒｉｘ　ａｎｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄｔｈｅｉｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｓ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｒｅａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ，１９９７，１４２（１１）：２２６９－２２７９．

［１３］　ＵＴＩＧＥＲ　Ａ，ＴＯＢＬＥＲ　Ｋ，ＢＲＩＤＧＥＮ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｓ，１９９５，１０（２）：１３７－１４８．

［１４］　高慎阳，邹运明，李一经．猪流行性腹泻病毒Ｍ基因及其片段原核表达效果分析［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００７，２９（１）：２７－

３１．

ＧＡＯ　Ｓｈｅｎ－ｙａｎｇ，ＺＯＵ　Ｙｕｎ－ｍｉｎｇ，ＬＩ　Ｙｉ－ｊｉｎｇ．Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘ－

ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ

Ｍ＇ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，２９（１）：２７－

３１．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）［１５］　张晓丽，王晶茹，张燕，等．重组ＳＡＲＳ冠状病毒Ｍ蛋白的表达、纯化及鉴定［Ｊ］．生物化学与生物物理学学报，２００３，３５

（１２）：１１４０－１１４４．

ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｌｉ，ＷＡＮＧ　Ｊｉｎｇ－ｒｕ，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓ－

ｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＳＡＲＳ

ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏ－

ｐｈｙｓｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００３，３５（１２）：１１４０－１１４４．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

［１６］　殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．２版．北京：科学出版社，１９９７：４３９－４４０．

ＹＩＮ　Ｚｈｅｎ，ＬＩＵ　Ｊｉｎｇ－ｈｕａ．Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ［Ｍ］．２ｎｄ　ｅｄ．Ｂｅｉ－

ｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ，１９９７：４３９－４４０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

［１７］　高慎阳，刘延庆，李一经．猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）Ｍ蛋白原核表达载体的构建［Ｊ］．中国兽医学报，２００９，２９（１２）：１５２７－

１５３３．

ＧＡＯ　Ｓｈｅｎ－ｙａｎｇ，ＬＩＵ　Ｙａｎ－ｑｉｎｇ，ＬＩ　Ｙｉ－ｊｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＰＥＤＶ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ

［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，２９（１２）：１５２７－１５３３．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

［１８］　高慎阳，查恩辉，李一经，等．猪流行性腹泻病毒重组Ｍ蛋白膜外区的原核表达及鉴定［Ｊ］．中国兽医杂志，２００７，４３（１２）：１５－１６．

ＧＡＯ　Ｓｈｅｎ－ｙａｎｇ，ＺＨＡ　Ｅｎ－ｈｕｉ，ＬＩ　Ｙｉ－ｊｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｅｘｔｅｒｉｏｒ　ｏｆ　ｍｅｍ－

ｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，４３（１２）：１５－１６．（ｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅ）

［１９］　吴凌，李一经．猪流行性腹泻病毒ＬＪＢ／０３株的分离及膜蛋白基因的原核表达［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００５，３６（１０）：１０９５－

１０９９．

ＷＵ　Ｌｉｎｇ，ＬＩ　Ｙｉ－ｊｉｎｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＥＤＶ　ＬＪＢ／０３ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｖｅｔｅｒｉ－

ｎａｒｉａ　ｅｔ　Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００５，３６（１０）：１０９５－１０９９．（ｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅ）

（责任编辑　胡弘博）　

５

３

第１期 张志榜等：猪流行性腹泻病毒ＣＨ／Ｓ株Ｍ蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

猪病毒性腹泻的治疗

秋冬季节猪病毒性腹泻病的控制引起猪只腹泻的病毒种类较多，有腺病毒、呼肠孤病毒、杯状病毒、星状病毒、小圆病毒、轮状病毒和冠状病毒等十几种。但危害严重的主要有猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪轮状病毒(RV)三种，在寒冷季节易暴发，各年龄猪只均可感染。对仔猪危害最严重，有较高的发病率和死亡率，而其他猪只由于腹泻会引起生长迟缓、饲料报酬率降低。1秋冬季节猪群病毒性腹泻的流行特点所有猪只均易感，传播速度很快，2～3天内蔓延到全群；发病集中在每年11月至次年4月，中大猪和母猪发病轻，哺乳仔猪发病急，死亡率高，仔猪呈水样腹泻，喷射状，伴有呕吐。部分猪场会呈反复发作流行。2秋冬季节猪群病毒性腹泻的危害2月龄以内仔猪死亡率可达100％，并造成猪只免疫力降低，易引起继发感染，腹泻猪只迅速丧失体重，长势缓慢，耐过猪形成僵猪。整齐度差，出栏延迟至少l周。泌乳母猪感染后表现高度体弱、泌乳停止、食欲不振等。架子猪，肥猪和成年猪发生一至数日的食欲不振或缺乏，体重迅速减轻。病猪和带毒猪是主要传染源。其他动物如猫、犬、燕、八哥等也能传播。主要经消化道、呼吸道传染给易感猪。'TGE在我国从每年的11月份至次年的4月份发病最多，夏季发病少。流行形式以新疫区的暴发性和老疫区的地方流行性或间歇性发生。暴发后，50％的康复猪带毒，排毒可达2~8周，最长可达104天之久。在老疫区，由于病毒和病猪持续存在，仔猪断奶后切断了补充抗体的来源，重新成为了易感猪，把本病延续下去。PEDV可在猪群中持续存在，各年龄的猪都易感，哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，母猪的发病率在15％~90％。PED主要在冬季多发，夏季也可发生。我国从每年的12月份至次年的2月份为PED 的高发期。分娩和断奶仔猪数量大的猪场，PEDV通过感染断奶时丧失母源抗体保护的仔猪而存活，因而呈现地方性流行，PEDV可能是导致这类种猪场5~8周龄猪只持续发生断奶性腹泻的一个原因。PED可单一发生或与TGEV混合感染，最近有PEDV与PCV混感的报道。RV感染相当普遍，成年猪血清抗体检出率为40％～100％，具有明显的季节性，高峰在晚秋及冬季，少数地区季节性不明显而呈终年流行。7~41日龄仔猪易感，l～3周龄仔猪的感染率高于4~6周龄仔猪。初产母猪的仔猪比经产母猪的仔猪更易感。3临床表现及病理变化病毒性腹泻病的潜伏期很短，从几个小时到数日内蔓延全群。TGEV感染仔猪的典型临床表现是突然发生呕吐，接着出现急剧的水样腹泻，粪水呈黄色、淡绿白色或白色，内含未消化的凝乳块，气味腥臭，呈碱性。病猪极度口渴，迅速脱水，体重下降，精神萎靡，被毛杂乱无光。吃奶减少或停止吃奶，战栗，口渴，消瘦。架子猪、育肥猪和成年公、母猪主要表现食欲减退或消失，有时可见呕吐，随后水样腹泻，粪水呈现黄绿色、淡灰色或褐色，含有气泡。哺乳母猪泌乳减少或停止。3～7天病情好转，病猪体温多数正常，少数升高，但在主要症状出现后即降至正常或低于正常。病猪尸体消瘦，脱水明显。胃中充满凝乳块，胃底黏膜轻度充血或出血。小肠肠壁变薄，弹性降低，半透明状，肠内充满黄绿色或白色液体。肠系膜充血、淋巴结肿胀，切面多汁而呈红色。肾脏含有白色尿酸盐类。空肠绒毛的长度与隐窝深度比例，正常为7∶1，而TGE病猪则为1∶1。PED最主要的临床症状为水样腹泻，偶伴有呕吐，其临床症状与TGE十分相似，但程度较轻，在同窝猪群中传播的速度也比TGE慢得多。猪只年龄越小，症状越严重。在1周龄内仔猪在持续3～4天腹泻后因脱水而死亡，平均死亡率为50％。日龄较大的猪感染后1周左右康复，部分发育受阻而成为僵猪，年龄较大的猪表现食欲不振、呕吐、腹泻，而部分成年猪表现精神沉郁、厌食和呕吐，一般4～5天好转。育肥猪有1％～3％的死亡率。剖检仅见小肠扩张、肠内充满黄色液体，小肠黏膜、肠系膜充血，其他实质性器官无肉眼病变。组织学检查可见小肠绒毛长度与隐窝之比从正常的7∶1缩小到3∶1。RV自然感染常发生于7～14日龄的哺乳仔猪或断奶后7天内的仔猪。病初表现精神沉郁、食欲不振和不愿活动，偶有呕吐。随后发生严重腹泻并持续3～4天，粪便呈黄白、黄绿色或暗黑色。可见有水泻，半固体状(糊样)和发酵状，或者在类似乳清的液体上漂浮着絮状物。腹泻3~4天后，部分病猪出现严重脱水而死亡。排泄的外观程度取决于所吃的食物，吃奶的产生黄色腹泻，吃固体食物的一般是黑色或灰色腹泻。哺乳仔猪自然感染RV往往只出现轻微的临诊症状，可能与母源抗体有关。断奶仔猪腹泻综合征危害严重，死亡率可达10％~50％。断奶仔猪发生和轮状病毒相关的严重腹泻时，很多都有与TGE或溶血性大肠杆菌并发的现象(Bohl等，1978)。人工感染试验发现，单独接种轮状病毒或溶血性大肠杆菌时，只引起短暂的轻度腹泻甚至呈亚临床表现；而先后接种RV和溶血性大肠杆菌的猪只则可发生类似

猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV) 简介 猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus,PEDV) 属于Ⅰ类冠状病毒,引起猪流行性腹泻病,仔猪感染此病毒后具有很高得死亡率. PEDV就是一个正向包膜病毒,其基因组就是正义单链RNA 5'端有帽结构( cap) ,3'端有Poly( A)尾,基因组全长为28 033bp,基因组结构如图所示.5'端得2 /3部分编码2 个大得复制酶多聚蛋白ppla与pplab,其余1 /3基因组序列包括5个ORF,编码4个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M)与核衣壳蛋白(N) 以及ORF3编码得1个非结构蛋白.

复制周期 首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分得融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性得基因组RNA。融合后紧密结合得病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合得病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)与主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须得单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖得RNA聚合酶(RdRp)与其它合成病毒RNA所必需得蛋白。RdRp以进入胞质中得基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度得亚基因组mRNA(sgmRNA)与基因组RNA,复制酶、结构蛋白与辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成得病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋得核衣壳,核衣壳与固定在内质网与高尔基体之间空隙得M蛋白结合后再与E 蛋白结合,E蛋白与M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹得核衣壳。最后,包裹得核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰得三聚体S蛋白结合,形成成熟得病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。 一．蛋白组成 1.纤突蛋白(Spike protein,S) 2.小包膜蛋白(Envelope protein,E) 3.膜糖蛋白(Membrane protein,M) 4.核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N) 5.ORF3编码得多肽 6.非结构蛋白(nonstructural protein) ◆Nsp1 ◆Nsp2 ◆Nsp3

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书 [兽用名称] 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗 商品名：无 英文名：Swine Transmissble Gastroenteritis,Porcine Epidemic Diarrhea and Porcine Rotavirus V accine，live 汉语拼音：Zhu Chuanranxing Weichangyan、Zhu Liuxingxing Fuxie yu Zhu Lunzhuangbingdu Sanlian Huoyimiao 【主要成分与含量】疫苗含猪传染性胃肠炎病毒弱毒化毒株和猪流行性腹泻病毒弱毒CV777株病毒和猪轮状病毒NX株，每头份疫苗病毒含量≥105.0TCID50。【性状】为黄白色或微粉色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，无异物。 【作用与用途】用于预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒感染。主动免疫接种后7日产生免疫力，免疫期为6个月。仔猪被动免疫的免疫期至断奶后7日。 【用法与用量】每瓶疫苗稀释至5ml或10ml（根据头份数），妊娠母猪与产仔前40日后海穴位（即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位）接种，20日后二免，每次1头份（1ml）；其所生仔猪与断奶后7-10日内接种疫苗1头份。未免疫母猪所产3日龄以内仔猪接种1头份；进针深度：3日龄仔猪为1.5cm，随猪龄增大而加深，成猪为4cm。 【不良反应】无。 【注意事项】 1. 产品仅用于控制这三种病毒引起的腹泻，对于细菌、寄生虫和其他因素引起的腹泻无效。 2. 疫苗运输过程中应防止高温和阳光照射。 3. 妊娠母猪接种疫苗时要适当保定，以免引起机械性流产。 4. 疫苗稀释后，限1小时内用完。 5. 进行抗体检测，在抗体水平较低（TGE、PED中和抗体效价≤1:8，PRV中和抗体效价≤1:16）的情况下使用。 6. 后海穴位接种时，针头保持与脊柱平行或者稍偏上，以免将疫苗注入直肠内。 7. 本产品请在兽医指导下应用。 【贮藏与有效期】在-20℃以下，有效期为24个月。 【规格】5头份/瓶，10头份/瓶。 【批准文号】

产房仔猪易发病毒性腹泻的防控措施

产房仔猪易发病毒性腹泻的防控措施 自2010年12 月开始，我国多数省份相继出现以哺乳仔猪呕吐、腹泻和高死亡率为特征的猪病，给我国的养猪业造成了很大的经济损失。笔者于2011年6 月接触了第1 例产房哺乳仔猪病毒性腹泻病，至今近5年时间里陆续遇到类似病例，尤其是每年的11月到次年3 月的冬春季节，病毒性腹泻发生面很广，几乎所有规模猪场在2～3 年内都要经历1 次以上，有的猪场更是1 个冬春感染2 次。每次感染，持续时间有长有短，康复快的猪场持续2周，康复慢的猪场持续6周以上，感染期间所产哺乳仔猪多数在分娩后1～3 d 突然出现呕吐而后腹泻，数小时内整窝腹泻，24～36 h 几乎同栋产房所有哺乳仔猪都开始呕吐、腹泻。病猪呈喷射状水样腹泻，迅速脱水消瘦，12～36 h 病猪脊椎骨凸显。病猪在腹泻后48 ～96 h出现脱水死亡高峰，7 日龄以下乳猪感染病毒性腹泻死亡率80%以上，7 ～10日龄以上乳猪感染病毒性腹泻死亡率在40%左右，10 日龄以上乳猪感染病毒性腹泻只要产房内温度达到22℃以上，几乎没有死亡发生。更为严重的是在发生病毒性腹泻的产房往往伴随着母猪泌乳性能迅速下降，甚至完全没奶，导致腹泻耐过猪在康复期间饥饿，因而死亡率进一步增加。2013年冬天开始有的猪场妊娠母猪在发生病毒性腹泻的时候会并发流产，流产主要出现在重胎妊娠母猪，流产母猪占猪场重胎母猪比例5%～10%。 期间笔者多次采取腹泻哺乳仔猪病料送科研院所做腹泻病原检测，结果表明造成这几年产房哺乳仔猪严重腹泻的病原主要是流行性腹泻病毒。还有几次送检腹泻哺乳仔猪的同时挤该窝哺乳母猪奶水2mL 送检腹泻病原，发现多数所产哺乳猪发生腹泻的母猪奶水里面含有与腹泻乳猪一致的腹泻病原，说明导致乳猪腹泻的病原很可能是通过母猪奶水感染。 几年来笔者努力寻求各种控制产房7日龄以内哺乳仔猪腹泻的有效方法，然而似乎任何控制其他腹泻病有效的方法对于这个腹泻病都无明显效果。有的方法对某一个猪场效果很好，但是对于其他猪场却治疗效果不明显，这可能与治疗措施执行不到位、猪场条件不同或者病毒毒力强弱不同等因素导致相同的治疗措施在不同猪场出现较大差异的治疗效果。 纵观这几年规模猪场产房腹泻病情况，我们可以从中发现以下特点：1) 发病日龄越大病情越轻，只要发病超过10日龄一般就没有大的损失。2) 病情传播迅速，往往一栋产房只要1 ～2 d 时间就可以感染绝大多数哺乳仔猪。3)所带哺乳仔猪发生腹泻的母猪泌乳性能迅速下降。因此要控制产房哺乳仔猪腹泻必须采用综合措施，延缓病情传播速度，让还未感染腹泻的哺乳仔猪尽量不感染或者日龄大一点再感染。发生了腹泻的哺乳仔猪重点是增加其耐受力，使其减轻症状尽可能帮助耐过。在病猪康复期间，保证母猪泌乳性能，增加病猪康复率。为此我们可以采取以下措施，尽量降低发病期间哺乳仔猪死亡率。 1 疫苗接种 在每年的10月下旬和11 月下旬，每头母猪包括后备母猪后海穴接种4 mL 传染性胃肠炎- 流行性腹泻（T-P）二联灭活苗，作为基础免疫，1 月初开始给产前2 ～4 周的母猪跟胎加强接种T-P 二联灭活苗。3 月初母猪群再次全群接种T-P 二联灭活苗，4月初给产前 2 ～4 周的母猪跟胎加强接种T-P 二联灭活苗，预产期在5 月中旬以后的母猪可以不跟胎加强接种了。接种疫苗的时候针头要水平或略向上斜插入母猪后海穴，针头不能向下斜，以免疫苗注入母猪直肠影响接种效果。在此笔者要强调的是，接种疫苗并不能完全控制产房哺乳仔猪病毒性腹泻的发生，但是可以明显减轻腹泻的症状并使得治疗措施有效，同时也可以降低病毒性腹泻的传播速度。产前未接种T-P二联苗的母猪所产哺乳仔猪在7 日龄以下感染病毒性腹泻，其死亡率将近100%，并且几乎所有治疗措施都没有明显效果，病猪死亡时间多在腹泻开始的48～96 h。产前未接种T-P 二联苗的母猪所产仔猪感染病毒性腹泻，传遍整个产房只需24～36 h，而产前接种2 ～ 3 次T-P 二联苗的母猪所产仔猪感染病毒性

返饲方法控制仔猪病毒性腹泻_齐海涛

入奶妈房中；四是刚转入奶妈房1~2天的仔猪需要调教喝奶；五是注意保持奶妈房内的干燥清洁，奶妈房中奶杯、水杯与仔猪的睡觉区没有严格的分区，环境潮湿，通常要撒天然净以杀菌和保持干燥；六是注意保持奶妈房内的温度，合理调节保温灯的功率；七是按常规程序进行教槽；八是可分阶段奶以提高奶妈房利用率和仔猪活动空间；九是每日清理奶桶和输奶管道，进猪前和每周用含氯消毒液对设备进行彻底清洗消毒，清洗消毒时空气压缩机压强为70磅/平方英寸，程序为：冷水— 50℃~60℃热水—消毒水—冷水，每个步骤循环时 间不得短于8分钟。 4结论 在当前肉品需求的背景下，仔猪育成率提升 10%，相当于少养繁育母猪10%，可以大大提升养 猪效率，降低养殖成本，为养殖户及社会创造财富。而要提高断奶前后仔猪的育成率，在正确的怀孕母猪、哺乳母猪及产房管理的前提下，还需要增强怀孕后期母猪料的营养及饲养技术，改善、增加初乳的质量和总量，采用代母奶进行恰当的人工哺育，同时辅以合理成功的教槽，才能促进乳猪的健康、快速生长，减少疾病，提高乳仔猪断奶体重和育成率，最终提升断奶育成率。 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 今日畜牧兽医2013·09 19规模养猪 哺乳仔猪腹泻病的发病特征有：（1）发病范围广，全国所有养猪省份几乎都有发生；（2）主要危害7日龄以内哺乳仔猪，症状主要表现为水样腹泻、脱水、部分仔猪呕吐，死亡率高；（3）发病持续时间长且主要集中在每年12月份至第二年3月份；夏季高温时节也时有发生；（4）病情反复发作，间隔2~3周新的哺乳仔猪开始发病；（5）疫苗免疫效果不好，抗生素治疗效果不明显；（6）一些小规模猪场尽管实施了返饲，但仍有腹泻暴发。 目前尚无特异性治疗病毒性腹泻的方法，疫苗紧急免疫效果不佳。关于哺乳仔猪腹泻的病因众说纷纭，使广大猪场管理人员感到迷惑和恐慌。猪场频繁发生病毒性腹泻可能和猪群不断感染新的毒株以及腹泻病毒毒株的不断变异有关；另外疫苗抗原含量和疫苗本身的抗原性还有待提高。目前国内外专家学者公认的控制病毒性腹泻的方法就是返饲，但是很多小规模猪场返饲效果并不 理想，只有一些技术力量比较强的现代化猪场返饲成功率较高。笔者结合临床实践经验和大家交流利用返饲方法控制病毒性腹泻病的关键点。 1发病状况 2013年1月中旬，江苏地区某公司两个规模 化猪场（猪场A 与猪场B ）先后发生大规模的腹泻，发病急、传播速度快，10天内各生产阶段的猪均出现腹泻。两个猪场不同年龄阶段猪的发病顺序也基本一致，均是育肥猪和保育猪先后出现水样腹泻，而后传播到妊娠母猪，最后是产房母猪和哺乳仔猪发病。两个猪场在母猪妊娠后期均使用过韩国某公司进口流行性腹泻—传染性胃肠炎—轮状病毒三联灭活疫苗。仔猪主要表现症状：出生后3~10日龄，先呕吐，而后水样腹泻，3~5天内死亡率高达50%~85%，10日龄以上仔猪容易耐过。发病时补液及时的仔猪，耐过后容易成为僵猪。对于脱水的仔猪，使用抗生素治疗无效。 返饲方法控制仔猪病毒性腹泻 齐海涛，于俊娜，张悦，范安泽，朱春明，马振强（北京大北农种猪科技有限公司，北京100000）

猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）简介 猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus，PEDV) 属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率． PEDV是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5'端有帽结构( cap) ，3'端有Poly( A)尾，基因组全长为28 033bp，基因组结构如图所示．5'端的2 /3部分编码2 个大的复制酶多聚蛋白ppla和pplab，其余1 /3基因组序列包括5个ORF，编码4个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N) 以及ORF3编码的1个非结构蛋白．

复制周期 首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E 蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。 一．蛋白组成 1.纤突蛋白（Spike protein，S） 2.小包膜蛋白（Envelope protein，E） 3.膜糖蛋白（Membrane protein，M） 4.核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N） 5.ORF3编码的多肽 6.非结构蛋白（nonstructural protein） ◆Nsp1 ◆Nsp2 ◆Nsp3 ◆Nsp4 ◆Nsp5 ◆Nsp6 ◆Nsp7 ◆Nsp8 ◆Nsp9 ◆Nsp10 ◆Nsp11 ◆Nsp12 ◆Nsp13 ◆Nsp14 ◆Nsp15 7.依赖于RNA的非结构蛋白pol基因编码（复制酶多聚蛋白lab，pplab）

鸡新城疫疫苗治疗猪病毒性腹泻的事例与原理探讨

鸡新城疫疫苗治疗猪病毒性腹泻的事例与原理探讨 x 最近看了海浪头的《“鸡新城疫”疫苗悄悄走进猪的市场》一文很有感触。鸡新城疫和猪腹泻，这两种看似八竿子打不着的事情怎么就有了交点？这个方子如此之“偏”为何流传甚久并屡有成功的案例，纯属歪打正着还是确有神效？我没有高学历也没有治疗经验，只是希望能以此文帮助大家找到一些想要的答案。以下内容仅供参考。 一、鸡新城疫疫苗治疗猪病的探索 1、第一个“吃螃蟹”的人：我国伟大的基层兽医！ 以鸡新城疫疫苗治疗猪病，有史可查的首个案例发生在1987-1988年。当时浙江省绍兴市受猪传染性胃肠炎病毒所害，经济损失严重，又苦于没有疫苗可用，绍兴市兽医站的沈福钦、宋森泉等人便以新城疫I系疫苗作为内源性干扰素生剂进行了防治猪传染性腹泻病的试验。 具体方法是用生理盐水1：100稀释新城疫I系苗，按仔猪3~5ml，架子猪5~10ml、肥育猪及公母猪10~20ml的剂量, 行皮下或肌肉注射，每天1次，做好临床观察。以腹泻停止和食欲基本恢复判定为治愈。连续2次怡疗未愈, 判定为无效。 他们的结果表明，1987年11月-1988年3月，用新城疫I系苗共试治未用其他任何药物治疗过的传染性腹泻病猪164头，其中经第1次注射治愈95头、第2次注射治愈62头，有效治愈率为157/164=95.7%。另外对有病毒性腹泻流行猪场的28头猪进行了预防实验，结果有效。 他们分析这种方法符合现代免疫学理论，以新城疫中强毒活疫苗作为内源性干扰素诱导剂，可诱导猪产生干扰素并增强免疫系统的活性，因此可以防治猪的病毒性腹泻。但由于当时的实验条件有限，无法分析所用剂量和不同阶段猪体诱导产生干扰素的敏感度。 2、各地兽医试用“特殊疗法”，效果得到印证。 在浙江兽医的带领下，其他地区的兽医工作者们也对这种奇妙的方法进行了一些尝试与验证。 1990-1993年，云南兽医以同样1:100的比例稀释新城疫I系苗，仔猪5ml，10ml、肥育猪及公母猪20ml的剂量注射。治愈率90/93=96.7%。验证了应用鸡新城疫I系苗作为干扰素诱生物，防治猪流行性腹泻病确有较好疗效,，但因初次应用对剂量和治疗效力的持续时间等还须进一步试验。 本人查到的所有以文献或论文形式进行过报道的案例汇总如下： （之后就鲜有确切的治疗事例报道了，大多是以治疗方法推荐的形式见诸报端） 另外还有鸡新城疫疫苗治愈仔猪白痢的案例，来自江苏省泰兴市的兽医应用鸡新城疫I 系冻干苗治疗仔猪白痢在临床上取得了满意疗效，认为这从免疫学、传染病学和微生物学的观点和常理是无法解释的。但作者本着“百家争鸣”的原则，经慎重研究后，决定发表该文章，旨以供同行参考和运用，望能通过进一步的实践来加以验证与总结。湖北省兽医也利用相似的方法防治当地的猪黄白痢，取得了十分显著的临床效果。 二、鸡新城疫VS猪腹泻病毒，以毒攻毒的杀.手锏是【干扰素】 既然有上述诸多新城疫防治猪腹泻的事例，那么就有发生这种现象的原因。在相关的文献中我们经常可以看到同样的字眼—— 关键词：干扰素、干扰素诱导剂、鸡新城疫I系疫苗

猪流行性腹泻的发病原因与治疗措施

级高牧医042 学号200401015227 毕业论文（设计） 题目猪流行性腹泻的发病原因与治疗措施姓名盛吉吉 系部畜牧系 专业畜牧兽医 指导教师王冬梅职称实验师 日期2009.5.20

江苏畜牧兽医职业技术学院论文(设计) 猪流行性腹泻的发病原因与治疗措施 盛吉吉 【摘要】本病是由类冠状病毒引起的急性流行性腹泻。季节性很强，以11月至第二年2月底发生较多，各类年龄都可感染。病猪及带毒猪是本病的传染源，主要传染途径是消化道。但其发病率和死亡率随猪龄的增长而下降，1-5日龄内哺乳仔猪感染率最高，死亡率也高，几乎100％，断奶，育肥、种猪症状较轻微，病死率很低或无病死。此病传播迅速，仅数日危及全群。 【关键词】流行性腹泻；冠状病毒；猪；肠道性传染病 1.发生与分布 猪流行性腹泻是一种与传染性胃肠炎（TGE）相似的疾病，在我国长期被误认为是TGE，1976—1977年，在比利时一些主场发生各种年龄的猪急性腹泻。1977年，伍德氏在英国报道类似疾病，称为“流行性腹泻Ⅱ型”，潘萨尔特氏在比利时，查西氏在英国发现此病，其后，在欧洲的捷克，西德等许多国家发生流行。我国在1964年前后开始发生冬季拉稀病，每年冬季11月份起发生流行，春节前后达到高峰，流行面广，数省数县连续发生，不论猪大小，性别，品种，均可发生，但病因不明。国内从70年代起开始研究病原，分离出几株病毒，如上海的“华株”，辽宁省的“辽株”，吉林省的“吉株”，福建省的“龙株”等，均认为是猪传染性胃肠炎，但抗原似乎有差异。在80年代，长春是高德荣氏等通过TGE的Miller株与4个地方毒株的免疫荧光交叉反应，兽医大学朱维正氏等通过吉株，华株与通化株的免疫荧光实验，均证实与猪流行性胃肠炎不同，直到1983年上海市畜牧兽医研究所从比利时引进CVLA株免疫血清，证实华株为CVLA，才正式肯定猪流行性腹泻病毒。 2.病原 猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子呈多形性，倾向球形，直径95—190nm，外有嚢膜，嚢膜上有花瓣状突起，核酸型为RNA型。病毒只能在肠上皮组织培养物内生长。 3.流行病学 病猪是主要传染源，在肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结内存在的病毒，随粪便排出，污染周围环境和饲料用具，以散播传染。

猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展

猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展 摘要：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，是导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来，猪流行性腹泻的流行区域有扩大的趋势，已成为中国甚至全世界最常见的猪腹泻传染病之一。通过对猪流行性腹泻病毒的基因组概述，S基因及其编码蛋白的功能特性、基于猪流行腹泻病毒S基因的诊断技术及其疫苗研究进展等方面的进行综述。 关键词：猪流行性腹泻病毒；S 基因；S 蛋白；诊断技术；疫苗进展 Abstract:Swine epidemic diarrhea is an acute intestinal infection caused by porcine epidemic diarrhea virus, which is one of the important diseases that lead to the early death of piglets. In recent years, epidemic areas of swine epidemic diarrhea have been expanding and have become one of the most common porcine diarrhea-related diseases in China and even in the world. This review summarizes the genome of Swine Epidemic Diarrhea virus and the functional properties of S gene and its encoded protein based on the diagnostic technique of S gene of swine epidemic diarrhea virus and the research progress of its vaccine. Keywords:Porcine epidemic diarrhea virus; S gene; S protein; diagnostic technique; vaccine progression 引言 20世纪70年代初，猪流行性腹泻（PED）在欧洲等国如英国、荷兰、比利时和捷克就被发现，被认定为一种急性肠道传染病，其主要特点为腹泻、脱水以及呕吐。1977年，成功的分离到这种冠状病毒并命名为流行性腹泻病毒（PEDV）。与欧洲等国同时期，我国也出现了新生仔猪的严重腹泻并死亡的事件，采用各种抗生素均无效果，当时被认为是胃肠炎的传染病。到了20世纪80年代初，采用酶标法证明了这种流行病为猪流行性腹泻病毒[1]~[3]。 PED目前在全球范围内流行广泛，特别是在亚洲国家如中国、日本和韩国，这已经给养猪业带来了严重的冲击。现已表明猪流行性腹泻主要是由于猪流行性腹泻病毒导致的一种急性的肠道传染病。PEVD可以导致不同年龄以及不同品种的猪染病引起严重的腹泻，例如成年母猪20%～85%发病，架子猪、哺乳仔猪以及育肥猪100%的发病。主要病症为：症状轻的为日龄大，症状重的为日龄小。具体表现为：成年猪表现为厌食与呕吐，育肥猪和断奶猪的腹泻仅持续7 d左右，

猪流行性腹泻病毒学习资料

猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）简介 猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus，PEDV) 属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率． PEDV是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5'端有帽结构( cap) ，3'端有Poly( A)尾，基因组全长为28 033bp，基因组结构如图所示．5'端的2 /3部分编码2 个大的复制酶多聚蛋白ppla和pplab，其余1 /3基因组序列包括5个ORF，编码4个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N) 以及ORF3编码的1个非结构蛋白．

复制周期 首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp 以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。 一．蛋白组成

猪流行性腹泻

猪流行性腹泻 1 病原学 2 流行病学 3 发病机理 4 临床症状 5 病理变化 6 流行现状 7 诊断 8 综合防治 9 综合防治重点难点解析 参考文献 最近几年，因病毒性腹泻疫情流行，给我国养猪产业乃至整个国民经济带来沉重打击。2011年4月，因该年春节前后的猪病毒性腹泻流行，猪价一改之前一年多逐波下行的萎势，出人意料地快速飚升，使始于2010年初，经过近一年的财政紧缩，已于当年12月见顶回落的CPI再度扭头向上，紧缩的财政政策被逼再度紧缩。2011年7月，CPI上升6.5%，猪肉价格上涨56.7%，推动CPI上升1.46个百分点。 对于近几年猪病毒性腹泻的主要病因，虽然学者们至今仍意见不一，有人认为猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻仍然是主要致病病原，有人指出是猪流行性腹泻病毒发生了变异，还有研究指出是新的病毒博卡病毒或CUBO病毒[1]。但据珠海市赛比奥（原安富来）生物科技有限公司（以下简称赛比奥）猪病诊断实验室对广东省内外几十个病毒性腹泻发病猪场的临床调查和病原学检测：2011年和2012年春节前后的猪病毒性腹泻疫情，70%以上的猪场是因猪流行性腹泻发病所引起；在母猪免疫过来源正当的猪病毒性腹泻三联弱毒苗（含猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和轮状病毒三种抗原，以下简称腹泻三联弱毒苗）的猪场，100%是因猪流行性腹泻发病所引起。 在现有技术条件下，来源正当的腹泻三联弱毒苗或某些实验室制作的腹泻二联弱毒苗（仅含有猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种抗原）对猪流行性腹泻的免疫效果均不够理想，或根本无效，但采取一些非常规的免疫手段对该病作免疫预防，可使该病得到有效控制。 1 病原学 猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV），与猪传染性胃肠炎病毒、猫冠状病毒、犬胃肠炎病毒和人冠状病毒，同属于冠状病毒科（Coronaviridae）

仔猪病毒性腹泻

仔猪病毒性腹泻 （深圳安多福动物药业有限公司整理） 1.概述 猪病毒性腹泻是危害养猪业的重要传染病，尤其是对仔猪危害最为严重，可造成仔猪的死亡。育肥猪则生长发育受阻、饲料报酬降低，影响养殖效益，混合感染其他病原或者延误治疗可造成仔猪的死亡。 2.病原 引起猪群发生腹泻的病毒有流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和轮状病毒，一般将上述几种病毒单独或混合感染引起的腹泻统称为病毒性腹泻。 3.流行特点 病毒性腹泻一般多发于气候寒冷潮湿的冬春季节，潮湿、寒冷、卫生条件差、奶水不足等应激因素易诱发此病。病毒性腹泻的毒力较强，对产房出生7天内仔猪的致死率非常高。目前尚无特效治疗猪兽药，所以猪病防治应以预防为主，并采取综合防控措施。 4.流行病学 （1）猪传染性胃肠炎：猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，具有明显的季节性，冬春季多发，各种日龄的猪均有易感性，10日龄以内的仔猪发病率和死亡率较高，而断奶仔猪、育肥猪和成年猪的症状较轻，多数能自然康复。 本猪病主要经消化道传播，也可以通过空气经呼吸道传播，病猪和带毒猪是主要的传染源。通过粪便、乳汁、鼻分泌物、呕吐物以及呼吸的气体排出病毒，污染饲料、饮水、空气、土壤和用具等。 仔猪发病初期体温升高，后期体温下降。呈水样腹泻，粪便呈黄绿色、灰色或白色，呕吐、脱水、口渴、消瘦，多于2～7d因衰竭死亡。 （2）猪流行性腹泻：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种肠道传染病，多发于寒冷季节，大小猪均可发病，年龄越小，发病率和病死率越高，尤以哺乳仔猪受害最为严重。 猪流行性腹泻主要通过消化道传播。病毒存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结中，随粪便排出后被污染的环境、车辆、衣裤、用具等都可作为传播媒介，继而散播传染。 临床症状为呕吐、水样腹泻，粪便呈灰黄色或灰色，脱水、不食。1周龄内的哺乳仔猪通常于腹泻后2～4d内因脱水而死亡。

猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV) 猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)都是冠状病毒。轮状病毒(RV)呈车轮状外观，是一种人畜共患病。这三种病毒均可被醛威TM和巨碘灭活，福尔马林、氢氧化钠亦可有效将其杀灭。 诊断要点 1. PED和TGE有严格的季节性。冬春季节(11月至下年4月)尤其是春节前后是发病高峰期。 2. 呕吐，水样的喷射状腹泻，有一股很特别的臭味。 3. 大小猪均发，日龄越小死亡率越高。 4. 轮状病毒7日龄以下不发病，多发生于13～39日龄。 5. 粪便呈酸性(细菌性腹泻的粪便一般为碱性)，在普通显微镜下观察，肠绒毛缩短。 治疗原则： 1. 猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒是我国猪群中危害最严重的三种病毒性腹泻。 2. 这三种病毒性腹泻用抗生素和化学抗病毒药治疗无效。重在管理，重在疫苗注射，重在增强体质和免疫力。冬春季节的“病毒性腹泻”危险期，在注射疫苗的基础上定期饮水或拌料添加健力源或瘟毒力克，是未病先防的明智之举。 3. 在该病的治疗上，补液的同时应用免疫增强剂和消毒剂(可饮水消毒的巨碘)是关键，可以考虑使用抗生素防止继发感染(杆菌消、立速健是目前治疗肠道感染较好的敏感药物)。 4. 母猪发病时，新生仔猪由于严重脱水，加上母猪发病时无奶，死亡率可达100%，可采取人工奶或寄奶。 人工奶配方：500ml鲜奶+500ml10%葡萄糖水+1粒VC+2粒复合VB+2粒乳酶生。治疗 该病的发生目前尚无特效疗法，对症治疗可以缓解症状，防止继发感染;加强护理可以减少死亡。具体做法如下：

1、治疗病情较轻病猪。用新城疫I系苗，每支0.5克加生理盐水10毫升，每头猪不论大小注射2毫升;注射三氮唑核苷每公斤体重0.2毫升，每日注射一次。 2、治疗病情较重病猪。用恩诺沙星注射液，防止继发感染，按猪体重每千克用药0.1毫升(含恩诺沙星25毫克)，肌肉注射，每日2次，连用3天。或用肠炎灵注射液，按猪体重每千克用药0.3～0.5毫升，肌肉注射，每日2次，连注2～3日为一个疗程。在注射的同时，尽早在饮水中添加口服补液盐。口服补液盐的配制方法是：精制氯化钠35克、碳酸氢钠25克、氯化钾15克、葡萄糖200克、水10千克，混合溶解即成。无饮欲的小猪，用金属注射器每次灌服40～80毫升，每日服5～6次。可静脉注射5%～10%的葡萄糖生理盐水和5%碳酸氢钠注射液，各500～1000毫升，每日2次，连用2～3天。限食喂给营养丰富、好消化的饲料。 防治措施： (1)对发病猪舍及饲养用具用0.1%百毒杀溶液进行全面彻底消毒。将病死猪及污染物远离猪场焚烧后挖坑深埋。(2)发病猪肌肉注射四黄素注射液。注射液制作方法：取黄芩、黄柏、黄连、大黄各750克，将药研碎，加水浸过药面，煎煮2～3次(煮出药液为原水量的1／3～1／2)，将药液用4层纱布过滤去渣，加入适量白矾，搅拌，静置沉淀，取上清液用滤纸过滤2次，用注射用水稀释至3升，分装、消毒、备用。用量为每头仔猪每次8毫升，每天1次，连用3天。(3)为防止继发感染，全群猪喂服磺胺脒，每天用量为0.2克／公斤体重，分2～3次内服，连用3天。为吸附胃肠道内有害物质和收敛，在猪空腹时给服矽炭银，用量为每头猪每天5克，连用3天。(4)同时供给充足的含有电解质和营养成分的饮水。配制方法是：每1000毫升水中加氯化钠3.5克、氯化钾1.5克、磷酸氢钠2.5克、葡萄糖20克。跟胎次免疫 采用跟胎次免疫方法，这种免疫效果让他出乎意料，今年以来尽管周边不少养殖场损失连连，他的猪场却幸免于难。具体的免疫方式是，母猪配种后60天、90天各免疫一次，同时对后备母猪加强免疫，第一次配种前一周左右免疫一次。 防控腹泻的思路： 海纳川药业动保事业部技术总监孙雪梅则认为，防控腹泻应采取以下思路：第一步，母猪产前控制体内病毒、消除毒素，生出健康仔猪，保证母乳质好、量足，以此保护新生仔猪的安全。第二步，新生仔猪尽可能避免感染病毒，增强体质。第三步，对已经出现腹泻的仔猪，以抗病变、解毒保肝为主，同时补充能量、水分、电解质，确保不发生脱水与酸中毒;适量使用抗生素，避免继发感染。 2009年2月上旬，乐安县公溪镇某猪场突然发病，10日龄仔猪个别出现呕吐、水样腹泻，很快波及全群。半数左右有短暂的体温升高(40．2℃～40．6℃)；粪便呈淡黄、黄白色等，内含未消化的凝乳块和泡沫，腥臭，但不见有血液，严重Vl渴，精神沉郁，很快脱水消瘦，病情严重的仔猪仅2—3d后死亡。架子猪、育肥猪和母猪的症状轻重不一，食欲不振或废绝，个别猪有呕吐，出现灰色、褐色水样喷射状腹泻。母猪泌乳减少。

猪病毒性腹泻

猪病毒性腹泻 随着养猪业的发展，猪病毒性腹泻已成为危害猪生产最严重的疾病之一。猪病毒性腹泻病原主要有三种，分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒。三种病毒致病机理非常相似，临床上表现相近，其中最严重的为猪传染胃肠炎引起的腹泻，猪流行性腹泻仅次之，而猪轮状病毒比前两种病毒引起的腹泻较缓和些。同时病毒性腹泻的几种病原混合感染也普遍存在，有时也常与致病性大肠杆菌混合感染。 1.流行特点 本病呈地方流行，有明显的季节性，尤其在秋冬、冬春换季，天气骤变时易发。主要通过呼吸道及消化道进行感染。 气候突变时易发生且流行速度快，病猪呈水样性腹泻，颜色草绿色、恶臭，随后诱发全群猪腹泻。 几种病原混合感染比较常见，各年龄段的猪均可发病，发病后的死亡率与年龄密切相关，日龄越小，病程越短，死亡率越高。 2.临床症状 （1）猪传染性胃肠炎：大多数猪表现出不同程度的厌食、呕吐和腹泻。哺乳仔猪发病严重，迅速脱水，2～3周龄以下的死亡率很高，日龄越小死亡率越高，大部分不足7日龄仔猪出现症状后2～7天后死亡。病猪迅速出现明显脱水、消瘦等症状，严重口渴，被毛粗乱。哺乳仔猪发病后2～7d衰弱而亡，如不及时采取有效措施，死亡率可高达100%。 （2）猪流行性腹泻：病猪起初呕吐，排灰色或黄色水样稀粪，迅速消瘦、脱水，大部分病猪在短期内可康复，哺乳母猪发病导致无乳症。1周龄以内的仔猪常持续腹泻3～4天后因脱水而死，如不及时治疗，死亡率有时可高达100％。 （3）猪轮状病毒腹泻：轮状病毒感染一周龄以内哺乳仔猪或断奶仔猪，并可导致严重腹泻。猪以精神萎顿、厌食、体重减轻为特征，在1～41日龄的仔猪常可见到自然发生的轮状病毒腹泻，发病率通常低于20%，如无继发感染则症状较轻，哺乳仔猪常继发大肠杆菌病，使病情加重，死亡率升高，最高可达80％。病猪精神萎顿、食欲减退，常有呕吐，继而出现腹泻，粪便呈暗黑色、黄白色。腹泻愈久，脱水愈明显。