激光共聚焦FV1000IX81-中文使用说明书讲解

激光共聚焦显微镜 FV1000 - 光谱扫描型 - (倒置显微镜IX81 简易使用说明书 1 1

内容启动系统显微镜镜下观察微分干涉差观察荧光观察取图的操作界面如何取图 XY平面单标 XY平面双标同步扫描方式序列扫描方式 XY平面单标 + 微分干涉差 XYZ扫描双标 XYL光谱扫描 2D 操作界面图像分析打开文件 3D图像的叠加比例尺的使用 3D图像的重建 3D图像的旋转 Unmixing 保存图像保存到CD-

R 关闭系统附录 3 4 5 6 7 10 13 16 19 21 24 24 25 26 27 29 31 35 36 37 38 2 2

开启系统 1 1. 2. 打开计算机. 打开激光器. (打开钥匙开关. 2-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm ON (打开电源开关后,打开钥匙开关. 2-2. 氦氖绿 (543 nm ON 2-3. 氦氖红 (633 nm ON 3. 4. 打开汞灯电源开关. 登陆 Windows XP系统. User ID: Administrator Password: fluoview 5. 双击快捷方式：打开 FV10-ASW应用软件. User ID: Administrator Password: Administrator * 系统软件的启动需要等待一定时间. 3 2 5 3 3

显微镜镜下观察微分干涉差观察 1 手控面板 *DIC 元件 1. 使用手控面板选择

物镜. (参照 Memo . 2 3 2. 插入起偏镜. 3. 插入微分干涉滑块. 4. 点击FV10-ASW软

件中的图标. Note 1. 使用TD滑块控制卤素灯的光强. Note 2. 检查滤色片转盘的位

置是否为“6.DICT” . 如果不是,用手柄按下DICT图标. 用此旋钮进行微分干涉法对比度的调节. 5. 标本聚焦. 4 Memo 按照7-1的操作转换物镜的倍率之后，对：●物

镜●各物镜对应的DIC元件* 进行操作. 4 Note 1 4

显微镜镜下观察荧光观察 1 Hand switch 1. 使用手控面板选择物镜. 2 2. 点击

FV10-ASW软件中的图标. Note 1. 选择第3步后,显微镜进入荧光观察状态. 注意此时汞灯的机械快门要打开. (建议通常机械快门要放在关闭的位置 ( . Note 2. 检查DIC滑块是否拉出. Note 2 Notes 1 & 3 3. 使用手控面板选择荧光滤色片. (参照Memo . Note 3. 观察之前，检查汞灯的机械快门要放在开启的位置 ( . 3 4. 标本聚焦. Memo 关于荧光滤色片 NIBA：蓝色激发/绿色荧光（例：FITC、EGFP等）

WIG ：绿色激发/红色荧光（例：Rhodamine、DsRed等） 5 5

如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差获取单张图像（XY平面）（荧光图像

＋微分干涉）例：绿色荧光（FITC）+DIC图像 1 1. 点击FV10-ASW软件中的按

钮关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮关闭卤素灯快门. 2. 2 3. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2. 点击Apply按钮. (关闭染料选择面板可以

用Close按钮. 3 4. 选择TD1. 4 染料选择后的显示界面 16 16

如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差 5 6 5. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 6.

调节绿色 (FITC图像和微分干涉差的图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1. 7. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo . 7 Memo 扫描控制面板 : 连续扫描 : 停止扫描 : 快速扫描(隔行扫描图像调节略述 [1] [2] [1] 探测器的灵敏度调节 (HV [2] 共聚焦的孔径大小调节 (C.A. [3] 激光输出的调节 (Laser 调节方法 (例: HV调节: 点击滑块, HV直接提高 (或降低到指定的位置. 点击此按钮或者使用鼠标转轮进行

微调. [3] 17 17

如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差 8 9 8. 选择AutoHV, 并选择扫描速度. *

随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除. (也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2. 9. 点击XY按钮取得一幅图像.

10. 点击SeriesDone按钮, “2D ViewLiveImage(x” 2D界面就出现. 10 11 11. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式. Memo FV10-ASW专用的图形格式OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF的图像” 和“一个附属文件,”不能单独分割. OIB 格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 18 18

如何取图 (XYZ扫描-双标获取3D图像(XYZ (荧光图像例: 绿色荧光(FITC和红色荧光 (Rhodamine双标这里介绍线序列扫描取图的过程. 1 4 5 6 7 1. 采用13和14页步骤1到7. 确定Z轴的上限和下限如下. 2. 输入StepSize大小(点击OP按钮可以使用推荐的值, 并选择 . 3. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 4. 点击和按钮上移焦

点位置. (参照 Memo . 5. 当图像显示到达上限时, 点击Set 按钮确定. 6. 点击和按钮

下移焦点位置. (参照 Memo . 2 8 Memo 和按钮 : 点击移动1.0μm. : 点击移动0.1μm.

7. 当图像显示到达下限时, 点击Set 按钮确定. 8. 点击Stop按钮停止扫描. 19 19

如何取图 (XYZ扫描-双标 9 10 9. 选择AutoHV, 并选择扫描速度. * 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提下, 背景噪音就会消除. (也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2. 10. 选择Depth按钮. 11. 点击XYZ按钮取得图像. 12. 点击SeriesDone按钮, “2D ViewLiveImage(x” 2D界面就出现. 11 13. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图像格式. 12 13 Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF的图像” 和“一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 20 20

图像分析 (比例尺的使用 1 2 1. 点击按钮 . 2. 点击图像的同时, 拖放此比例尺到一个特定的位置. 3. 点击手柄的左端或右端, 移动鼠标. 改变比例尺的大小 3 4. 选择比例尺并右击选择属性的设置. 4 5. 设置具体的比例尺属性. 改变文本, 颜色, 字体等.

5 2

6 26

图像分析 (3D图像的重建以一定的角度观察3D图像 1 3 1. 点击按钮 2. 创建

3D图像. . 3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像. → 要保存此图像, 进行下一页第6步的操作. 观察3D图像的某个横截面 4 5 4. 点击按钮并选定 . 5. 拖动鼠标观察某个垂直横断面. → 要保存此图像, 进行下一页第6步的操作. 27 27

图像分析 (3D图像的重建保存上一页中第3、5选项的图像 6 6. 点击按钮 . 7. 会创建一个2D图像 (带文件名. 8 8. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像

图标，选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的图

像格式. Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF的图像” 和“一个附属文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进行其它的操作. 28 28

图像分析 (3D图像的旋转 1. 点击按钮 . 1 3 2. 创建3D图像. 3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像. 动画的播放 4 4. 点击并控制按钮着 X-轴旋转. 再次点击停止旋转. 实现图像围绕点击并控制按钮着 Y-轴旋转. 再次点击停止旋转. 实现图像围绕点击并控制按钮着 Z-轴旋转. 再次点击停止旋转. 实现图像围绕 29 29

图像分析 (3D图像的旋转要保存动态旋转的图像, 请参照如下的方法创建3D 图像. 例, 试图旋转图像180度. 5 6 5. 点击按钮 . 6. 点击Angle rotation菜单. 7 8 9 10 30 7. 选择旋转轴. 8. 输入旋转的角度. Start = End = Frame/s = Interval = 开始角度结束角度旋转速度单次旋转的角度 9. 选择AVI类型并点击Create按钮. 10. 输入一个文件名并点击Save按钮. 30

保存到 CD-R 1. 插入一张CD-R光盘. 2 2. 点击OK. 3 4 3. 选择文件并拖放到CD-R的窗口. 4. 点击"Write these files to CD." 5. 点击Next. 5 6 7 36 6. 开始刻录. 7. 点击Finish按钮结束. 36

关闭系统 1. 选择File/Exit, 退出FV10-ASW软件. 1 2 2. 退出Windows XP. (1 选择Start/Shut Down. (2 在Shut Down窗口中, 选择Shut Down并点击OK按钮. 3. 关闭激光器. (关闭钥匙开关. 3-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm OFF (等待风扇停止,关闭电源开关. 3-2. 氦氖绿 (543 nm OFF 3-3. 氦氖红 (633 nm OFF 4. 关闭汞灯电源. 4 37 3 37

激光共聚焦显微镜 FV1000 - 光谱扫描型 - (倒置显微镜IX81 附录 38 38

附录1 共聚焦的原理和调节原理 HV: 探测器灵敏度的调节 (Voltage 给定值↑ > 灵敏度↑ > 图像亮度↑ (注意背景噪音变得突出. * 推荐值为700V或700V以下. 按钮: 改变电压以1V为一个单位 (投射光通道设定为1V Gain调节 (x 给定值↑ >图像亮度↑ 依照放大率的变化, 图像变得更亮. 按钮: 改变增益以x 0.01为一个单位

Offset调节 (% 给定值↑ >图像亮度↓ 按钮: 改变增益补偿以1%为一个单位 C.A.: 共聚焦孔径大小的调节 (μm 给定值↑ > C.A. 大小↑ > 图像亮度↑ (注意光学切片的厚度变大. * 推荐使用Auto设置. 经过调节C.A.要恢复初始值, 再次点击Auto. 按钮: 改变孔径大小以1μm为一个单位. M_Ar or HeNeG, HeNeR: 激光输出强度的调节(% 给定值↑ > 输出强度↑ > 图像亮度↑ (注意荧光漂白变得明显. * 激光输出强度尽量要小. 按钮: 改变输出强度以1%为一个单位. Memo 共聚焦孔径大小、光学切片厚度和图像亮度的关系 C.A. Optical slice thickness Image brightness 激光输出强度、探测器灵敏度和图像亮度的关系 M_Ar PMT Image brightness 39 39

附录2 获取图像如何降低背景噪音降低扫描速度通过降低扫描速度探测器从开始检测就忽略背景噪音. 优点: ? 相比Kalman方式, 能够取到更锐的图. Auto ON: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度不变. Auto OFF: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去除而图像亮度增加. 缺点: ? 单次扫描的速度很慢. 1. 选择扫描速度.

************************************************************************ ********** Kalman方式通过重复获取一定数量的图像进行平均算法运算处理. 从而去除背景噪音和粗糙度. 优点: ? 单次扫描的速度很快. 缺点: ? 由于图像平均而图像模糊. 1. 点击Kalman并选择Line或Frame方式. 2. 输入累计数字(扫描的次数. 40 40

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理 从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用 目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

德国Zeiss 激光共聚焦显微镜 快速操作手册

德国Zeiss 激光共聚焦显微镜快速操作手册德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作: 光学仪器(上海)制作:Zeiss 光学仪器(上海)国际贸易有限公司孙凯 2009 年 6 月目录:目录:1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序软件的快速使用说明2.2 软件的快速使用说明快速使用显微镜的2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。系统组成及光路示意图:系统组成及光路示意图: 组成及光路示意图电动荧光显微镜扫描检测单元激光器电脑工作站实物照片说明:实物照片说明: 电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序 )打开稳压电源(绿色按钮)(1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待 2 分钟(电压稳定)后，再开其它开关) “ ”(2)主开关 MAIN SWITC H “ON” “ ”电脑系统SYSTEMS/PC “ON” “ ”扫描硬件系统COMPONENTS “ON” )(3)打开电动显微镜开关打开荧光灯开关 (注:具有 5 档光强调节旋钮) ) 离子激光器主开关”(4)Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约分钟，预热等待约 15 分钟，”将激光器扳钮由“Standby”扳至”状态，“Laser run”状态，即可正常使用 ) ，(5)打开电脑开关，进入操作系统注:键盘上也具有电脑开关 2.2 软件的快速使用说明(1)电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件 ZEN 图标(2)进入 ZEN 界面，弹出对话框: ”——“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已”存图像数据的处理、分析。(3)软件界面: 功能界面切换:扫描取图( ) 图像处理( 、图像处

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地

进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 （一）细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白

激光扫描共聚焦显微镜_图文讲解

激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2008.10.14 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……

Conventional fluorescence microscope Confocal microscope 历史

1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。 1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。 1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。 Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987 Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus

Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 操作手册

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册 目录: 1 系统得组成 系统组成及光路示意图 实物照片说明 2 系统得使用 2、1 开机顺序 2、2 软件得快速使用说明 2、3 显微镜得触摸屏控制 2、4 关机顺序 3 系统得维护 1 系统得组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。 系统组成及光路示意图: 电脑工作站 激光器 电动荧光显微镜扫描检测单元 实物照片说明: 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO2 培养系统控制器 激光器 电脑工作站 2 系统得使用 2、1 开机顺序 (1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待2 分钟(电压稳定)后,再开其它开关 (2)主开关[ MAIN SWITCH ]“ON” 电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON” 扫描硬件系统[ PONENTS ]“ON” (3)打开[ 电动显微镜开关] 打开[ 荧光灯开关] (注:具有5 档光强调节旋钮) (4)Ar 离子激光器主开关“ON” 顺时针旋转钥匙至“—” 预热等待约15分钟, 将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至 “Laser run”状态,即可正常使用 (5)打开[ 电脑开关],进入操作系统

注:键盘上也具有[ 电脑开关] 2、2 软件得快速使用说明 (1)电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标 (2)进入ZEN 界面,弹出对话框: “Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、 分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已 存图像数据得处理、分析。 (3)软件界面: 1 功能界面切换:扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)、维护(Maintain) (注:Maintain仅供Zeiss专业工程师使用) 2 动作按钮; 3 工具组(多维扫描控制); 4 工具详细界面; 5 状态栏; 6 视窗切换按钮; 7 图像切换按钮;8 图像浏览/预扫描窗口;9 文档浏览/处理区域;10 视窗中图像处理模块 动作按钮: Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。 Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程(1组图片,如XYZ、XYT 等)。 Stop ——暂停/结束扫描。 New ——建立一个新图像扫描窗口/文档。 激光连接状况检查 眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换(ZEN软件界面右上角): Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。(激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。) Camera ——光路切换至相机。 LSM ——共聚焦扫描成像光路。 显微镜设置: “Ocular”——> “Light Path”——> 点击物镜图标,选择物镜——> 样品聚焦。 透射光控制(Transmitted Light Control) 反射光光闸控制(Reflected Light Shutter) 荧光激发块选择(Reflector) 共聚焦LSM 扫描设置 点击“LSM”(ZEN软件界面右上角),系统切换至共聚焦扫描光路: 光路设置: Smart Setup ——自动预设光路 选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法, 应用“Apply”。 (注:Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫 描。Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺 序扫描。Best promise 为兼顾速度与信号得折

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图

二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一）细胞的三维重建

普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡

德国Zeiss激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册

德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司 孙 凯 2009年6月

目录目录：： 1 系统的组成 系统组成及光路示意图 实物照片实物照片说明说明 2 系统的使用 2.1 开机顺序 2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明 2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制 2.4 关机顺序 3 系统的维护

1 系统的组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。。 系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：： 电脑工作站 激光器 扫描检测单元 电动荧光显微镜

实物照片说明实物照片说明：： 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO 2培养系统控制器 激光器 电脑工作站

2 系统的使用 2.1 开机顺序 （1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮）） 等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关 （2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ” 电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ” 扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ” （3）打开 [ 电动显微镜开关 ] 打开 [ 荧光灯开关 ] （注：具有5档光强调节旋钮） （4）Ar 离子激光器离子激光器主开关主开关 “ON ” 顺时针旋转钥匙 至 “—” 预热预热等待约等待约15分钟分钟，， 将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby ”扳至 “Laser run ”状态状态，，即可正常使用 （5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统 注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ]

激光共聚焦显微镜技术1讲解

激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别

激光共聚焦显微镜

激光共聚焦显微镜 1．激光器： 1.1系统激光器覆盖可见光及紫外光： 1.1.1蓝光固体激光器488nm20mW； 1.1.2绿光固体激光器552nm20mW； 1.1.3红光固体激光器638nm，20mW 1.1.4紫外固体激光器405nm50mW； 1.2激光器的开闭和电压调节完全由软件控制，无需另设单根激光器的开关。并具有激光寿命保护装置。 1.3具有激光强度回馈稳定电路设计，在动态记录中激光强度不会受环境的影响而改变。 2．共聚焦扫描系统： 2.1激光扫描系统直接与共聚焦机身连接 2.2检测器数量 ①三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器； ②扫描检测器包括2个光电倍增管（PMT）和一个磷砷化镓混合型检测器HyD。*③可以升级为五个以上独立连续光谱荧光检测器。 2.3连续分光设计系统（或其它光谱分离系统） *①三个通道，一个透射光DIC通道；二个荧光通道均为可做连续全光谱检测的荧光通道； ②光谱型荧光通道可自由更换荧光通道检测的波长范围，二个荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描； ③多通道荧光图像即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加，精确对光谱进行分析； ④荧光通道具有高精度的共聚焦针孔，具有宽波谱范围内的色差校正功能，保证在多重荧光标记的同时检测过程中每个通道扫描光切平面和厚度的一致性和荧光精确定位。 2.4光谱扫描功能 ①高速多通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像； ②光谱分辨率2nm，可连续以1nm波长调节； ③光谱扫描范围：400-800nm；光谱扫描步进：1nm； ④高速棱镜分光，线性光谱拆分，可区分光谱大量重叠的染料； ⑤光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设（可调节）。 2.5扫描速度及速度调节 *①扫描视野22mm下扫描速度7幅/秒（512×512pixels）；70幅/秒（512×16pixels）； ②双向扫描速度3600线/秒；扫描速度可精确调节。 2.6共聚焦针孔1个，全自动调节型，孔径50-300微米，调节步进0.5微米。

LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13

Leica激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月

目录： 1 系统的组成 系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)

Leica SP8 系统组成图

1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件

激光共聚焦原理

激光共聚焦显微镜的成像原理 什么是荧光？ 荧光是当以某一波长的光线照射一 个物质（原子/分子）的时候，该物质（原 子/分子）吸收了光线能量的一部分并且 发射出另一种低能量的光线。图中示意的 光线里蓝色（较高能量光线）为入射光线， 绿色（较低能量光线）为反射光线。 什么是分光镜？ 分光镜是可以把不同波长的光线区分开来的光学装置。 分光镜可以起到使特定的光线可以通过，特定光线反射的作用。 荧光显微镜是如何工作的？ 我们假定入射光线是紫色的 （较高能量光线），反射光线是红 色的（较低能量光线）。显微镜系 统使用了一种特殊的分光镜，(更恰 当地说一个“区分两种颜色的镜 片”)。这个镜片反射低于特定波长 的光线，并且可以通过高于特定波 长的光线。因此你的眼睛只能看到 这些由荧光染料反射出来的光线 （红色光线），而不是看到入射的 紫色光线。紫色和红色的光栅位于分光镜后，作为一种特殊的过滤装置，来保证其他颜色的光线传到了不正确的方向。

关于共聚焦显微镜 想象下在显微镜中有一些 镜片组，由镜片组一个焦点发出 的光线延光路发送到另一个焦 点。这表现为图中的蓝色光线。 红色光线表示式样上的其他点发出的光线，这些点并不在镜片组的焦点上，因此这些点就不能通过镜片组在另一边的焦点上成像。（这里的需要注意的是，红色的光线和蓝色的光线是为了区分式样上的不同点，并不是为了表示他们的波长不同。）这样，蓝色光和红色光成像的点就不相同。这里我们只希望得到位于镜片组焦点上发出光线成的像。如果我们在镜片组的另一边放置一个带有针孔的隔挡，这个孔正好在蓝色点成像的位置，那么所有从蓝色点发出的光线都可以通过这个针孔。并且，由红色点发出的大部分光线是不能通过这个针孔的。这就解决了荧光显微镜的一个缺陷。通常来说式样都是完全被照亮的，因此式样上的每一个点都会同时发出荧光。当然，成像最清晰，也就是亮度最高的点是在物镜焦点上的点，但是其他点的光一样会对成像结果产生影响。增加一个针孔就解决了这个问题，因为式样位于物镜焦点上的点会在针孔位置成像，这样对点是共轭的。针孔的位置就是镜片组的位置，这就是共聚焦针孔。 那么共聚焦显微 镜是怎么工作 的？ 激光一般被用作光源，一边产生 高强度的光照。图中，蓝色线表示激 光光线，它被分光镜反射。两个可以 驱动带有扫描功能的镜片，会侦测到 激光器发射的光，而被式样反射的光线是不会被侦测的。焦点位置点的反射光通过分光镜在针孔位置成像，并且通过针孔的光线会被放大。这里如果扫描速度足够快，人眼看到的就是一副运动的画面。

激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜原理 激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。 图1. 共聚焦显微镜简化原理图 图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。

图2. 探测针孔的作用示意图 图2解释了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。共聚焦显微技术是由美国科学家马文?闵斯基(Marvin Minsky)发明的；他于1957年就为该技术申请了专利。但是直到八十年代后期，由于激光研究的长足进步，才使得激光共聚焦扫描显微技术（CLSM）成为了一种成熟的技术。 图3. 激光共聚焦显微镜原理框图 当今的激光共聚焦显微镜已经发展为一种结合了激光技术，显微光学，自动控制和图像处理等多种尖端科研成果的高技术工具。是现代微观研究领域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信赖与创造”的一贯企业理念，正在为业界提供世界领先水平的共聚焦显微镜系统产品。

激光共聚焦显微镜操作规程

激光共聚焦显微镜操作规程 一、准备工作 a)打开计算机。依次打开激光器电源、钥匙开关。多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) ON、氦氖绿(543 nm) ON、 氦氖红(633 nm) ON。打开汞灯电源开关。 b)登陆Windows XP系统。双击快捷方式：FV10-ASW 1.1。User ID: Administrator ; Passeword: Administrator。注 意区分大小写。 二、显微镜镜下观察 １.微分干涉差观察 a)使用手控面板选择物镜。插入起偏镜。插入微分干涉滑块。 b)点击FV10-ASW软件中的图标。标本聚焦. ２.荧光观察： c)使用手控面板选择物镜。 d)打开汞灯的机械快门，拉出DIC滑块，点击FV10-ASW软件中的图标 e)使用手控面板选择荧光滤色片。标本聚焦。 ３.获取单张荧光图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮。 b)关闭汞灯快门，点击按钮，关闭卤素灯快门。 c)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV,，并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮，“2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像:右图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像。(保存为“xml”类型是击FV10-ASW 软件专用的图像格式。) ４.获得单张（荧光+微分干涉）图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮，关闭汞灯快门。点击按钮，关闭卤素灯快门。 b)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 c)选择TD1。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节绿色(FITC)图像和微分干涉差的图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV, 并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像。 ５.获取3D图像 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光(Rhodamine)双标（这里介绍线序列扫描取图的过程.）

激光共聚焦技术讲解

模块九激光共聚焦技术 1. 实验目的 让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。 2. 实验原理 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。 激光扫描共聚焦显微镜基本结构 （1）扫描模块 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。 荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。 （2）荧光显微镜系统 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。 （3）常用激光器 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型： 多谱线Ar离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm的蓝绿光；He-Ne激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm的紫外光。 （4）辅助设备 风冷、水冷冷却系统及稳压电源。 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理：激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片。

激光扫描共聚焦显微镜及其应用讲解

激光扫描共聚焦显微镜及其应用 激光扫描共聚焦显微镜（Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像 激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。 激光共聚焦显微镜的原理 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。 主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。 通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。 主要功能 1、图像处理功能 2、细胞生物学功能应用范围：（1）定量荧光测定；（2）定量共焦图像分析；（3）光学切片及三维重组；（4）动态观察；（5）荧光漂白恢复研究；（6）质膜流动性研究；（7）蛋白质相互作用研究；（8）激光显微外科及“光陷阱”研究；（9）光活化技术研究。 （编辑：文静）

激光共聚焦显微镜在材料领域应用的初探

激光共聚焦显微镜在材料领域应用初探 夏仲琦，周向群(2010-07-02 18:35:09) 一、前言 作为一种微观形态学工具，光学显微镜在工业测试方面的应用，目前主要大家比较熟悉的主要是以下方面： 首先，单独作为形态学工具，进行材料组织分析和外观缺陷检查，其典型的产品是金相显微镜和立体显微镜。 第二、光栅量测结合，进行部件的精密尺寸测量，其典型的产品是工具显微镜，测量显微镜。 近年来，随着计算机软件技术的发展，显微镜与图象处理系统的结合，产生了定量金相软件、工显测量软件、一般几何测量软件等等，使其不仅可以定性分析，更能在定量化上发挥重大作用。 但光学显微镜的局限在于，它是一种二维的形态学工具，其极限有效分辨率是0.35微米，该分辨率下的景深在1微米以下。因此如果要在高倍率下观察表面的三维形态，特别是纵向方向的形态，通常一定需要使用SEM而不是OM。SEM是这一方面非常成熟有效的标准工具，但有些样品使用SEM会碰到以下困难： 1、样品本身比较大，且不能做分割的器件组，虽然被观察的部分是微小的局部，但整个样品难 以放入SEM中。 2、非金属样品，且不适合做导电性处理。特别是一些对微小处理很敏感的样品。 3、无法测量多种尺寸数据，比如体积，面积，粗糙度等等。 针对这些问题，SEM厂家在不断推出更新的技术。同时，光学显微镜开发者也在探索如何使光学显微镜成为一种三维的微观形态学工具。 这方面目前比较有成效的技术，是激光扫描共焦显微镜（CF-LSM）。 共聚焦激光扫描显微镜的发展在国外，主要为日本。是从80年代末期开始的，目前在日本，共聚焦激光扫描显微镜已经是一种被广泛采用的技术，既用来观察样品表面亚微米程度（0.12微米）的三维形态和形貌，又可以测量多种微小的尺寸，诸如体积、面积、晶粒、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等等。 另外，它还有以下特点： 1、使用方便,与一般光学相似,且全部采用计算机直观控制。 2、基本无须制样,不损伤样品。不需要做导电处理,也容许大尺寸样品直接观察,完全不破坏样品。 3、几十秒到一两分钟即完成全部的扫描，成像，测量采样工作。该设备目前已经为吉林大学，哈 尔滨工业大学用于材料和机械加工方面的研究。

共聚焦显微镜

共聚焦显微镜 从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管 (photomultipliertube，pmt)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有

划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了 30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分

激光共聚焦显微镜FV中文说明书完整版

激光共聚焦显微镜F V 中文说明书 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

激光共聚焦显微镜 FV1000 (倒置显微镜IX81) 简易使用说明书 开启系统 1.打开计算机. 2.打开激光器.(打开钥匙开关.) 2-1.多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) ON 2-2氦氖绿 (543 nm) ON 2-3氦氖红 (633 nm) ON 3.打开汞灯电源开关. 4.登陆 Windows XP 系统. User ID: Administrator Password: fluoview 5.双击快捷方式： User ID: Administrator Password: Administrator * 系统软件的启动需要等待一定时间. 5 2 3 1

显微镜镜下观察 微分干涉差观察 1.使用手控面板选择物镜. (参照Memo.) 2.插入起偏镜. 3.插入微分干涉滑块. 4.点击FV10-ASW 软件中的图标. Note1:使用TD 滑块控制卤素灯 的光强； Note2:检查滤色片转盘的位置是否为“”，如果不是，用手柄按下DICT 图标 5.标本聚焦 显微镜镜下观察 荧光观察 *DIC 元件 1 2 4 手控面板 用此旋钮进行微分干 涉法对比度的调节 . Memo 按照 7-1 的操作转换物镜的倍率之后，对： ● 物镜 ● 各物镜对应的 D IC 元件 * 进行操作 .

1.使用手控面板选择物镜. 2.点击FV10-ASW 软件中的图标. 3.使用手控面板选择荧光滤色片.(参照 Memo.) 4.标本聚焦. 1 2 3 Hand switch Note 2 Notes 1 & 3 Memo 关于荧光滤色片 NIBA ： 蓝色激发 / 绿色荧光 （例： FITC 、 EGFP 等） WIG ： 绿色激发 / 红 色 荧光 （例： Rhodamine 、 DsRed 等）

激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用

激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用 实验目的与要求 1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。 一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理 1.普通荧光显微镜的不足 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。 Laser Scanning Confocal Microscope 2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理 采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。 Confocal Principle

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。 LSCM的基本特点 观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光、近红外） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察 3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用 细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞 骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等 细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术） 细胞内氧自由基活性 细胞内钙离子浓度变化 膜电位