腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册
目录
腺病毒安全使用和注意事项
腺病毒储存与稀释的注意事项
一、整体实验流程
二、实验材料
三、腺病毒包装和浓缩
四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定
五、重组腺病毒感染目的细胞
六、重组腺病毒用于动物实验
附1：汉恒生物腺病毒载体
附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较
腺病毒安全使用和注意事项
?腺病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）
1)腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时需要特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用
70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5)如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7)实验完毕后请用香皂清洗双手。
?腺病毒储存与稀释的注意事项
1）腺病毒的储存
收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。
注：
a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中
尽量避免反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴
度测定方法）。
2）腺病毒的稀释
需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。
目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。
目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装
必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。
相对于Adeasy系统，AdMAX系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1, 3Cre双载体组成。
一、整体实验流程
二、实验材料
该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1, 3Cre)。
1、载体信息（见附1）
2、菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
3、细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗（DMEM完全培养基）。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70% 以下，则293A细胞能连续培养3～4个月维持原有的细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增加，293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现，我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，可增加细胞复苏成活率。
注：为了达到最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveIt TM抗支原体试剂。
三、腺病毒包装和浓缩
（一）质粒构建和扩增
构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，浓度要求大于1 μg/μl，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。
注：质粒构建推荐使用汉恒生物HB-infusion TM无缝克隆试剂盒。
（二）腺病毒包装
事先准备好用于包装病毒的293A细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直径为6 cm的培养皿成分如下：
pHBAd系列穿梭质粒 2 μg
pBHGlox(delta)E1, 3Cre 4 μg
DMEM需在37℃水浴中预热，LipoFiter TM转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使用前摇匀。转染6h后置换成新鲜培养液。
注：1、LipoFiter TM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiter TM说明书。
2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。
（三）病毒收集
病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。如果穿梭质粒带有荧光蛋白（GFP或RFP），则在空斑形成之前观察荧光，以确定转染效率。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1 ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。
空斑示意图
注：高纯度的低熔点琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用沸水浴完全融化，然后自然降温到45℃待用。用37℃预热的完全培养基稀释5%的琼脂糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到去除培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。6孔板每孔覆盖3 ml琼脂糖/培养基。
（四）病毒扩增
第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。
注：1、收集细胞的时候一般使用细胞刮，不能用胰酶消化，4℃500 g离心10 min，去除大部分上清，只留取2 ml上清重悬细胞沉淀进行-80℃（干冰或者液氮均可）冻融。
2、37℃冻融时一旦病毒融化就马上取出，长时间在37℃温育会降低病毒滴度，完全融化后可以剧烈震荡30s。冻融周期通常会持续2~4次才可以获得高滴度的病毒。
3、细胞冻融结束裂解液可以4℃500×g离心10 min，不立即使用的话可以冻存在-20℃或-80℃。
（五）病毒纯化
病毒纯化采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如下:
1、融化：提前1 天将病毒从-80℃冰箱拿出，室温水浴融化。收集全部细胞裂解物，7000×g 4℃离心10 min，弃细胞碎片，收集上清。
2、PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。7000×g 4℃离心上述混合物20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10 g/ml 的CsCl 溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，PH8.0）（溶液配置见下表），病毒液应呈粉红色。
三种不同密度CsCl溶液的配制
密度（g/ml）
浓度（mg/ml）CsCl的量（g）终体积（ml）(20℃)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 40
2.4 4.024 10
1.10 143.8 1.438 10
3、CsCl 梯度离心：CsCl 梯度的制备方法如下：加入2 ml 密度为1.40 g/ml 的CsCl 溶液（溶剂同上），然后再缓慢加入3 ml 密度为1.30 g/ml 的CsCl 溶液（配置如下表），再加入5 ml 的病毒悬浮液。使用Beckman SW28转子，26,000 rpm，4℃离心2小时。
4、收集病毒：用注射器收集密度在1.30 g/ml 和1.40 g/ml 之间的病毒条带至透析袋中。
注：透析袋使用前用10 mM EDTA-Na2煮沸10 min，降至室温使用。
5、透析：在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl2定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。
6、重悬：500 μl PBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。
四、测定腺病毒滴度（PFU）
空斑(Plaque)是病毒诱导的细胞裂解形成的点状物，可以通过显微镜和肉眼观察。空斑形成单位(Plaque-forming unit, PFU)是单位体积的病毒形成的空斑数，是代表有活性的病毒粒子的浓度单位。PFU测定方法如下：
293细胞铺于60 mm dish，24h后细胞密度接近100%后加入不同稀释度的病毒，37℃
感染4~8h后，铺8 ml低熔点胶（10%FBS，1.25% Agarose）。培养9~11天后对空斑进行计数来计算腺病毒滴度。
注：腺病毒滴度还可以通过观测荧光蛋白（若有）或者通过目的基因的WB、免疫荧光或免疫组化等方法测定。
五、感染目的细胞
因为不同细胞的MOI不同，所以在正式实验前，需设计预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。
注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒颗粒所感染。不同实验室、不同操作手法及不同细胞系条件下所对应的细胞最佳MOI 都是不同的，在正式实验之前强烈建议实验操作者进行一次摸索最佳MOI的预实验。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞密度约为1×105/ml。
注：接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%至70%之间。
（二）病毒感染细胞（腺病毒感染细胞系的话可以略过纯化操作步骤）
感染之前，请按照梯度稀释病毒（附2），一般感染时MOI控制在3~1000区间范围。
1、感染贴壁细胞
感染实验分为两组，分别添加带目的基因的腺病毒和等滴度同体积的对照病毒，常用孔板参数如下表（简而言之，就是把一定体积的病毒直接加入到完全培养基中即可）。加入的病毒量范围在MOI=3～1000，一般设置MOI摸索梯度为3，10，30，100，300，1000（详见附2）。每个MOI值加两个孔，4~8h后更换成新鲜完全培养基。
举例：假如收到的病毒滴度为5?1011PFU/ml, 首先用完全培养基稀释到5?1010PFU/ml（1：10稀释）。现在要感染细胞数1?105/孔一个孔，MOI=1000，则需要5?1010PFU/ml病毒的体积=1?105?1000/5?1010 ml=2 μl。直接吸取2 μl的5?1010PFU/ml病毒混入孔板的培养基中即可。混匀后继续培养4-8 hr后更换新鲜的完全培养基。48-72hr可以观察荧光、WB等实验。
注：遗弃的废液按照病毒废液来处理！
腺病毒小体积感染表
培养皿类型表面积/cm2培养基体积腺病毒体积
96-well 0.3 cm2100 μl0.1-0.5 μl
24-well 2 cm2500 μl1-3 μl
12-well 4 cm2 1 ml 2-5 μl
6-well 10 cm2 2 ml 5-20 μl
2、感染悬浮细胞
感染悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（200×g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15 min（不要超过30
min），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续培养，感染过夜后换液即可。
（三）观察感染情况
感染48~72h后，可开始观察到GFP/RFP的表达；也可通过qPCR和WB验证目的基因在基因水平和蛋白水平的表达情况。
六、动物实验（动物实验必须使用纯化的腺病毒，以小鼠尾静脉注射为例说明）
将纯化过的腺病毒以每只小鼠5×109~1×1010个病毒颗粒数注射，例如纯化腺病毒的滴度为1×1011 pfu/ml，则每只小鼠所需的病毒原液体积为50~100 μ。具体的注射量需要进行实验摸索。
注：小鼠尾静脉注射体积一般固定为100 μl，最多不要超过200 μl。注射剂量过多，小鼠容易发生充血性心衰。若要进行其他病毒方面的动物实验可与汉恒生物动物实验工程师沟通交流。
附1：汉恒生物腺病毒载体
载体名称用途启动子容量荧光标记
pHBAd-EF1α-MCS-CMV-EGFP 过表达EF1α 5 kb EGFP
U6/CM
5 kb 无
pHBAd-U6-CMV-MCS 过表达/干扰
V
pHBAd-MCMV-MCS-CMV-RF
过表达MCMV 5 kb RFP P
pHBAd-MCMV-MCS-CMV-Lu
过表达MCMV 5 kb Luc c
pHBAd-EF1α-crRNA-CMV-EG
环状RNA过表达EF1α 5 kb EGFP FP
shRN pHBAd-U6-CMV-GFP 干扰U6
GFP
A
shRN
RFP pHBAd-U6-CMV-RFP 干扰U6
A
Cas9/gRNA敲
pHBAd-CMV-Cas9-U6-gRNA
U6 gRNA 无
除
pHBAd-EF1α-cas9-CMV-EGFP cas9敲除EF1αcas9 EGFP
pHBAd-U6-gRNA-EGFP gRNA敲除U6 gRNA EGFP 注：MCMV为小鼠巨细胞病毒的启动子，具有广谱表达活性。
附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）
注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。不同的实验室、不同的操作手法、不同的细胞系对应的最佳MOI都是不同的，在正式实验之前建议实验操作者进行一次摸索最佳MOI的预实验。
Day 0：将生长状态良好的目的细胞消化计数后稀释至1×05/ml, 加入96孔板，100 μl/孔(1×104个细胞)。放入37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。
Day 1: 在EP 管中配制6个梯度MOI的病毒培养液（都稀释到100 μl完全培养基），取值MOI=3，10，30，100，300，1000。然后把稀释好的病毒和细胞孵
育4-8h，吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100 μl完全培养液。
Day 3：显微镜观察荧光。此时根据荧光细胞的比例估算合适的MOI进行正式实验。
注：如果病毒不表达荧光，还可以通过目的基因的qPCR、WB、免疫荧光、免疫组化等方法摸索最佳MOI.
附3：汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较
慢病毒逆转录病毒腺病毒
感染方式直接加入
换液时间感染后24 h 感染后4-8 h
是否需要筛选需要筛选获得稳定感染株，慢病毒的感染
能力不强不需要，腺病毒感染能力很强
观察时间带有GFP等荧光标签，48-72 h后可以观察到表达；若不带荧光标签，则需要qPCR、WB、免疫荧光或者免疫组化等方法
鉴定
是否需要助转剂
有时需要，但是根据具体情况操作，因为助转剂，如polybrene，
对细胞的伤害比较大，有的细胞可能承受不了
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.wendangku.net/doc/3011649307.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.wendangku.net/doc/3011649307.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
pLVX-TetOne-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息： 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体；四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin ） 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等） 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-TetOne-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统 本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。 本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8
产品有限责任担保 Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了Vigene 更换产品的责任。Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。 产品订购和技术支持 山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处 美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US 北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室 广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室 山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室 Email: service@https://www.wendangku.net/doc/3011649307.html, Phone: 400-077-2566 https://www.wendangku.net/doc/3011649307.html,(美国) https://www.wendangku.net/doc/3011649307.html,（中国） 欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。 重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可
pLVX-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息： 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
自噬监测——LC3双标腺病毒(完整版)
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 1 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 背景： 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作 收到病毒后的处理 （一）、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。 （1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进 行分装； （2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱 保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病 毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间 超过6个月，应该重新测定病毒滴度。 3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小 包装病毒产品（购买时请提出）。 （二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞 用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于 实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释， 并尽快用完。 感染目的细胞 2
pLVX-DsRed-Monomer-N1慢病毒载体使用说明
pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1载体基本信息： pLVX-DsRed-Monomer-N1载体质粒图谱和多克隆位点信息： 载体名称: pLVX-DsRed-Monomer-N1 质粒类型: 慢病毒表达载体；荧光报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8751 bp 5' 测序引物及序列: CMV-F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (Invitrogen) 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: DsRed-Monomer（C-端） 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin) 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系，293、CV-1、CHO等 备注: pLVX-DsRed-Monomer-N1载体表达C端DsRed-Monomer 融合蛋白； DsRed-Monomer是DsRed的单体突变体，与DsRed相比， 编码序列经过了人工优化，适用于在哺乳动物细胞中的 高水平表达； CMV启动子是过表达启动子。 稳定性: 稳表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 慢病毒
pLVX-DsRed-Monomer-N1载体简介： Description pLVX-DsRed-Monomer-N1 is an HIV-1-based, lentiviral expression vector that allows you to express your gene of interest fused to DsRed-Monomer, a monomeric mutant of the Discosoma sp. red fluorescent protein. Genes cloned into the multiple cloning site (MCS),located upstream of the DsRed-Monomer coding sequence, are expressed as N-terminal fusions of the DsRed-Monomer protein. Expression of the fusion protein is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE) located just upstream of the MCS. Lentiviral particles derived from the vector allow the expression of DsRed-Monomer fusion proteins in virtually any cell type, including primary cells. The unmodified vector expresses DsRed-Monomer, and may be used to produce marker virus to optimize infection protocols. pLVX-DsRed-Monomer-N1 contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and nhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-DsRed-Monomer-N1 also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and