污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法

第26卷第10期

2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006

污染土壤微生物群落结构多样性及

功能多样性测定方法

陈承利,廖　敏3

,曾路生

(污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州　310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026)

收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220

作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com

3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.wendangku.net/doc/3a8158101.html, or liaom inzju1@1631com

Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026)

R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220

Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com

摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。

关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA

文章编号:100020933(2006)1023404209　中图分类号:Q143,Q938,S154　文献标识码:A

Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils

CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412.

Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved.

The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial

communities has always depended on culturing techniques using a variety of culture media designed to maxim ize the recovery of diverse m icrobial populations.H owever ,only a small fraction (<1%)of the soil m icrobial community has been accessed w ith this approach.T o overcome these problems ,other methods such as the community 2level physiological profiling and analysis of phospholipid fatty acids have been used in an attem pt to measure a greater proportion of the soil m icrobial community.In recent years ,m olecular 2based approaches for assessing soil m icrobial community have provided a new understanding of the phylogenetic diversity of m icrobial communities in polluted soils.Am ong all the available techniques ,the PCR 2based methods are m ost useful including denaturing Πtem perature gradient gel electrophoresis (DGGE ΠTGGE ),am plified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA ),ribosomal intergenic spacer analysis (RIS A ),automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARIS A ),etc.The use of these techniques m ight provide new ways of measuring soil m icrobial diversity ,ultimately leading to a m ore com plete understanding of the potential im pacts of pollution on soil m icroorganisms.In formation obtained from such studies w ill also provide insight on the role of m icrobial processes in soil health.H owever ,although the PCR 2based m olecular techniques have been used to overcome the lim itations of culture 2based methods ,they have their own lim itations such as the lysis efficiency of cells or fungal structures variation between and w ithin m icrobial groups.S ince each group of methods (biochem ical 2based versus m olecular biological 2based )can only provide a partial picture of one aspect of soil m icrobial diversity ,a combined use of techniques from the tw o groups w ill certainly help to develop a broader ,m ore com plete profile of soil m icrobial diversity in polluted soils ,which w ill eventually enhance our know ledge on the changes in m icrobial community function caused by the changes in m icrobial community structure.

K ey w ords :polluted soils ;m icrobial diversity ;m olecular biology ;BIO LOG;P LFA ;PCR ;DNA

在陆地生态系统中,生活在土壤中数量庞大的微生物种群,与植物和动物有着明确的分工,主要扮演“分解者”的角色,几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应,担负着地球C 、N 、P 、S 等物质循环的“调节器”[1]、土壤养分植物有效性的“转化器”和污染环境的“净化器”等多方面生态功能[2]。土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标,土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。然而,随着近代工农业的发展,大面积土壤受到严重污染,导致了土壤微生物群落结构和多样性的变化,而这种变化会如何影响地上部分和地下部分生态系统的变化尚不清楚。目前,对污染土壤微生物多样性的研究已引起国内外学者的极大重视。

土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因)多样性、生态特征多样性和功能多样性[3]。目前,对污染土壤微生物多样性方面的研究仍较薄弱。一方面是由于测定微生物种类的方法和技术还

不是很成熟,不能全面地、准确地研究土壤微生物多样性状况。另一方面是由于环境的高度异质性,时间和空间上的小环境随时发生变化[4]。另外,栖息在土壤中的微生物种类繁多,生存状况复杂,而且个体微小,结构

简单,缺乏可以区分的明显特征,尤其它们的组成和活动及其引起的许多生化过程,互相交替、互相影响,给土壤微生物数量、组成和生态分布的鉴定带来了许多困难。本文回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术

[5],将它们的原理、优缺点、实用性及

其发展动态作一阐述,以利于今后的研究。

1　污染土壤微生物群落结构多样性的测定方法

111　传统微生物平板培养方法传统的微生物平板培养法就是根据目标微生物选择相应的专性固体培养基进行分离培养,然后通过各种微生物的生理生化特征、外观形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型[6]。平板计数法仍然是一个评价污染效应的有效方法[7,8]。Busse 等[9]

用平板计数法研究了草甘膦除草剂对造林土壤中微生物群落结构及其代谢特性的影响,测定结果表明,草甘膦除草剂对细菌和真菌有毒害作用,提高除草剂含量,降低了培养基中存活细菌的生长速率和代谢多样性。

该方法也存在许多不足之处[6,10]。首先,微生物对培养基具有选择性,不可能用有限的几种培养基培养504310期陈承利　等:污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法　

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获得土壤中所有的不同生理类群的微生物,同时培养基的成分也影响微生物的生长状况[11]。其次,实验室的培养条件不可能用同一种方法同时满足所有微生物对温度、pH以及通气状况等条件的要求,从而用某一种特定条件不能培养出来那些不适应条件的微生物[12]。而且,许多微生物在环境变化过程中表现出一种“存活但不能培养”(Viable but nonculturable,VBNC)的状态,在这种状态下,细胞不能在传统的培养基上生长,但仍然处于存活状态,并在一定条件下可以恢复代谢活性并转入可培养的状态[3]。因而,利用平板培养法不可能全面地获得土壤中所有微生物的全部信息,只能获得一小部分土壤微生物群落。迄今为止,只有不到1%的土壤微生物能够被培养[13],而大多数只能存在而无法被培养。因此,这种传统的平板培养方法只能作为一种辅助工具,需要结合现代生物技术方法才能更客观而全面地反映微生物群落结构的真实信息[7]。

112　磷脂脂肪酸(P LFA)谱图分析法

磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid,P LFA)是构成活体细胞膜的重要组成部分,其含量在自然条件下是相对恒定的。不同类群的微生物能通过不同生化途径形成不同的P LFA,部分P LFA总是出现在同一类群的微生物中,而在其它类群的微生物中很少出现,细胞死亡后数分钟到数小时内细胞膜水解和释放磷脂,P LFA被降解,可以代表微生物群落中“存活”的那部分群体。不同菌群的微生物生物量和群落组成各不相同,每种样品具有独特的P LFA谱图(包括P LFA总量、组成),即具有专一性;不同样品的谱图之间差别很大,具有多样性。P LFA谱图的变化能够说明环境样品中微生物群落结构的变化。因此,磷脂脂肪酸分析十分适合于土壤微生物群落的动态监测。P LFA分析法是用氯仿2甲醇2柠檬酸缓冲液(1∶2∶018)提取土样的脂类,用柱层析法分离得到磷酸酯脂肪酸,然后经甲酯化后用气相色谱分析各种脂肪酸(C52C20)的含量。

该方法在污染土壤的微生物群落组成和种群变化方面研究得到越来越广泛的应用[14]。Pennanen等[15]模拟酸雨和重金属条件,用P LFA方法研究它们对林地土壤微生物群落结构各自作用和协同作用的影响。Frostegard等[16]用不同浓度的重金属污染林地的腐殖质土壤和农业耕地,然后检测其P LFA组成,对这两种土壤微生物群落的磷脂脂肪酸成分、生物量和活性进行了研究。表明微生物群落结构逐渐发生改变,但比生物量和活性的变化要小。K elly等[17]用P LFA方法发现Zn污染土壤中指示菌根真菌和放线菌的P LFA相对含量下降,微生物群落结构发生了变化。Suhadolc等[18]用P LFA分析了在重金属污染土壤中改变重金属有效性对土壤微生物群落结构的影响,发现用磷灰石处理降低重金属有效性和补充重金属来提高其有效性两种方式均改变了土壤微生物群落结构。

该方法不需要对土壤微生物进行培养,可以直接提取原位土壤微生物群落的脂肪酸。但其分析结果的准确性与微生物体内的磷脂脂肪酸是否提取完全、稳定以及实验过程是否造成污染等有很大关系。概括起来有以下几个:(1)温度波动,温度的增加会带来磷脂双分子层流动性的增加,这会导致形成磷脂非双分子层相,进而影响细胞膜的渗透性[19]。P LFA成分发生适应性变化以改变膜的流动性变化是生物体内消除这些影响的机制之一。(2)饥饿,营养状况的变化也有可能改变磷脂的含量,有学者对此进行了相关研究[62]。(3)标记性P LFA的非专一性,其变动会导致误差的产生[20]。而且该方法只能鉴定到微生物属,不能在种和菌株的水平上区分微生物。

213　基于PCR的分子生物学技术

21311　扩增核糖体DNA限制性分析法(ARDRA)　扩增核糖体DNA限制性分析法(Am plified ribos omal DNA restriction analysis,ARDRA),是一种DNA指纹技术,其原理是基于将保守区序列作为引物,用PCR扩增16S rRNA基因,所得片段用限制性内切酶消化,并用琼脂糖凝胶电泳分离。此方法无需进行纯培养,具备特异性强,效率高的特点,因此广泛应用于污染土壤微生物群落结构及其多样性的研究[21]。Smit等[22]用扩增的核糖体DNA限制性分析法研究了铜污染对土壤微生物群落的影响,发现微生物群落结构发生了明显的变化,与无污染土壤相比,受铜污染土壤的微生物多样性减少;还证明可培养部分的细菌只代表了总的细菌种群的一小部分;同时表明扩增的核糖体DNA限制性分析法是一种非常理想的研究土壤微生物群落的方法,能为微生物生态研究提供有价值的信息。Wenderoth等[23]用扩增的核糖体DNA限制性分析法研究了重金属Zn对自养型

细菌的影响,结果显示随着Zn 浓度的增加,各土样中细菌的代谢多样性随之减少。M offett 等[24]用扩增核糖体

DNA 限制性分析法比较了Zn 污染土壤与非污染土壤的微生物多样性,经限制性片段长度多态性分析,结果表明,Zn 毒害胁迫明显降低了细菌群落的多样性。该方法的不足之处是一组(分类群)微生物在分析中可得到几个片段,造成分辨率较低[25]。

21312　限制性片段长度多态性(RF LP )　PCR 限制性片段长度多态性分析法(PCR 2restriction fragment length polym orphisms ,PCR 2RF LP ),是将PCR 引物中的一条加以荧光标记,反应后用合适的限制酶切、电泳分析,再根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同分析群落的结构及组成多样性

[26]。该技术可以用来监测因环境改变,如污染等而引起的微生物种群的变化。Sandaa 等

[27]用PCR 2RF LP 方法评价了重金属污染对土壤中可培养细菌和总细菌群落结构的影响,结果发现增加重金属浓度会降低细菌群落的多样性,同时证明了可

培养细菌种群只代表了土壤细菌群落的一部分。21313　末端限制性片段长度多态性分析法(T 2RF LP )　末端限制性片段长度多态性分析法(T erminal restriction fragment length polym orphism ,T 2RF LP ),是对ARDRA 技术的改进。土壤细菌的16S 核糖体DNA 和真菌核糖体DNA 的ITS 区域都是研究土壤微生物多样性非常重要的目标区域。T 2RF LP 就是根据样品中的这些目标区域DNA 序列的不同或变化,进行PCR 扩增后得到目标DNA 片段,酶切后将会产生不同长度的限制性片段。根据这些特异片段的数量可以判断微生物区系的多样性,还可根据已知序列鉴定到种。通过比较不同样品间的异同,该方法能为评估土壤微生物多样性提供更敏感的数量化基础

[28]。Turpeinen 等[29]用T 2RF LP 方法研究了As 、Cr 、Cu 污染土壤的微生物群落结构,结果揭示了微生物能对土壤重金属污染产生响应作用,并通过改变微生物群落结构和产生耐性的方式来维持其代谢活性。

该方法也存在一些缺陷:(1)在T 2RF LP 的峰值图上,一个峰代表的有可能不只是一个种

[30];(2)样品中的总DNA 的提取和限制性内切酶的选择是影响到分析结果的关键因素

[21];(3)随着片段长度的增加,测序仪检测分辨率降低等[31]。

21314　核糖体基因间隔区分析法(RIS A )　核糖体基因间隔区分析(ribos omal intergenic spacer analysis ,RIS A )方法是利用细菌群落概览图谱间的相似度对生态系统的空间异质程度进行定量分析。RIS A 以细菌16S 和23S rDNA 间隔片段(ITS )为研究对象,ITS 片段的PCR 扩增混合物用普通电泳即可分离并获得特异性的长度多态性图谱,这就是利用RIS A 概览图谱描述细菌群落的基本原理[32]。Ranjard 等[33]用PCR 2RIS A 分析法研究了Hg 对细菌群落结构的影响,发现在Hg 污染胁迫下,优势细菌种群的组成发生了变化,耐Hg 细菌变多,细菌群落多样性减少。该方法的一些不足之处也是不能忽视的。如普通PAGE 只能分离大小相差十几个bp 的DNA 片段,对于差别小到几个甚至一个bp 的DNA 片段则很难分辨。因此该方法在精度上受到一定限制[34]。21315　变性Π温度梯度凝胶电泳技术(DGGE 或TGGE )　同样大小的DNA 序列由于含有的碱基不同,各片段的T m 也就不同,甚至一个碱基对的不同,都会引起T m 很大的差异。变性梯度凝胶电泳(DGGE )技术是通过不同序列的DNA 片段在各自相应的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,最后在其相应的变性剂梯度位置停滞,经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带[35]。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异,可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR 扩增DNA 片段的多态性。温度梯度凝胶电泳(TGGE )技术的基本原理与DGGE 技术相似,含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加,这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCR 产物及目的片段。根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的种类多少,可以分析土壤样品中微生物的多样性

[35]。该技术最先由Muyzer [36]等人引入研究土壤微生物基因多样性,现已被证实能够精确地反映出土壤微生

物多样性,并广泛地应用于污染土壤微生物多样性的研究[37]。K ozdroj 等[38]用PCR 2DGGE 结合传统培养方法

研究了根系分泌物对受不同程度重金属污染土壤的细菌群落结构多样性的影响,结果显示根系分泌物对重金属污染土壤的细菌种群发展具有显著的刺激作用;同时发现,淹水会促进优势种细菌的快速生长,降低群落结构的多样性。Renella 等[39]用PCR 2DGGE 方法研究了Cd 污染对土壤微生物群落结构的影响,在高浓度Cd 污

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染下,细菌群落也只发生了微小的变化,是由于有效Cd浓度过低,表明高浓度但低有效态Cd污染主要诱导微生物生理上的适应,而非群落结构的变化,一些生化指标对胁迫更加敏感。滕应等[40]用PCR2DGGE技术分析了重金属污染农田土壤细菌群落的多样性,其电泳图谱表明,PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好,可以明显反映出重金属复合污染导致了农田土壤微生物在基因上的损伤,影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度,改变了土壤环境的优势菌群,从而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。Brim 等[41]用PCR2TGGE方法研究了Zn污染土壤的细菌群落,指出TGGE方法所显示的细菌群落多样性要高于用培养方法所获得的多样性。

该方法也有一些不足之处,如易受腐殖酸、不同DNA萃取效率的干扰[42],而且花费时间较多、费用昂贵,还有代表性不强[43]等。

3　污染土壤微生物功能多样性的测定方法

由于微生物群落在污染土壤的有机质分解、N、C物质循环以及生物修复等方面扮演着非常重要的角色,微生物功能多样性因此成为与分类学、基因多样性一样重要的研究因素。目前,对土壤微生物多样性的研究主要集中于微生物群落结构多样性的研究,而对微生物功能多样性的研究则相对偏少,绝大多数对微生物功能多样性的研究主要采用基于碳素利用的BI O LOG微平板分析方法。

BI O LOG微平板分析方法是由美国BI O LOG公司于1989年发展起来的,最初应用于纯种微生物鉴定。1991年,G arland和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究,并认为BI O LOG碳素利用法是一种较为先进的研究不同环境下的土壤微生物群落结构和多样性的方法[44]。该方法是根据土壤微生物对95种碳源的利用能力及其代谢差异情况来对化能异养细菌进行鉴定的系统。BI O LOG微平板是一种多底物的酶联反应平板,由一个对照孔(仅有指示剂)和95个反应孔组成,每个反应孔装有不同的单一碳源底物和氧化还原染料四氮唑蓝作为指示剂,将土壤溶液接种到每一个微平板孔中,各孔中微生物利用碳源底物,呼吸作用产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,引起四氮唑蓝发生氧化还原变色反应,根据反应孔中颜色变化的吸光值来指示微生物对95种不同碳源的利用方式差别,从而来判定微生物群落的功能代谢能力差异情况。

从国内外近几年研究来看,该方法在研究污染土壤的微生物群落结构及其多样性方面发挥了越来越重要的作用[45,46]。德国的Engelen等[47]用BI O LOG研究了除草剂对土壤中微生物群落及其代谢特性的影响,测定结果表明,使用除草剂降低了土壤中微生物的代谢活性,还定量显示了微生物群落对不同碳源的利用能力及代谢功能多样性的变化。Banerjee等[48]用BI O LOG分析了灌溉污水污泥对土壤微生物群落结构和功能多样性的影响,发现高浓度污水污泥降低了土壤微生物多样性,但总的土壤微生物量和N的矿化速率并没有变化或增加。杨永华等[49]利用BI O LOG方法对农药污染土壤中的微生物群落进行了研究,测定结果显示,农药污染导致了土壤中微生物代谢功能多样性的下降,同时也导致了微生物种类的减少。姚斌等[50]利用BI O LOG方法研究了甲磺隆除草剂对土壤微生物多样性的影响,发现甲磺隆除草剂在使用浓度较高时(10mg kg-1)明显降低土壤微生物多样性,并且这种抑制效果随时间而变化,培养初期影响不显著,随培养时间的推移甲磺隆对土壤微生物多样性的影响加剧。滕应等[51]利用BI O LOG方法研究了铅锌银尾矿区土壤微生物活性及其群落功能多样性,BI O LOG测试结果显示,随着重金属污染程度的加剧其土壤微生物群落结构发生了相应变化,尾矿区土壤微生物群落代谢剖面(AWC D)及群落丰富度、多样性指数均显著低于非矿区土壤,表明尾矿区重金属污染引起了土壤微生物群落功能多样性的下降。

BI O LOG方法不仅灵敏度高,分辨力强,测定简便,而且无需分离培养纯种微生物,是监测污染土壤微生物群落结构的快速、可靠方法[52,53]。但是该方法也有一些不足之处,首先,BI O LOG方法中所使用的微平板具有一定的选择性,比如BI O LOG G N微平板只适用于革兰氏阴性菌,而BI O LOG G P微平板只适用于革兰氏阳性菌[54]。其次,影响平板微孔显色的因素较多,除了培养液中微生物的种群组成、数量与活性外,样品的预处理,培养时间和温度,培养液含有干扰物质等因素都会影响平板显色结果[54]。因此,今后要结合其他方法,更深入地研究环境微生物群落结构与功能及其相互关系,从而获得更全面的结果。

4　结合方法

生物化学技术和分子生物学技术都能很好地描述污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的变化情况。各种方法的综合使用可起到互补作用,避免由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差,将提供更加全面的群落组成、变化方面的信息,必将成为今后研究的有力工具。

Muller 等[55]用琼脂培养基平板计法、PCR 2DGGE 以及BI O LOG 方法研究了Hg 污染对土壤微生物群落,特别是细菌群落结构的影响。平板计数法发现,在高浓度Hg 重污染土壤的细菌以及原生动物种群数量明显降低,但真菌数量并没有明显变化。经PCR 2DGGE 方法分析,也反映出Hg 污染改变了细菌群落结构以及降低了其多样性,同时耐Hg 速生细菌明显变多。结果证明了多样性的减少会降低生态系统稳定性,甚至导致生态系统机能的衰退。然而,BI O LOG 板并没有显示细菌群落结构有任何变化。在所有描述细菌群落的不同方法中,PCR 2DGGE 分析方法能提供最明显的结果。为了获得更为详细的微生物群落蓝图,需要结合使用各种方法。Widmer 等[56]用DNA 2,P LFA 2,BI O LOG 2法分析杀虫剂降解土壤的微生物性质变化,发现3种方法都有很好

的重复性,能分辨出不同处理土壤,但通过聚类分析,3种方法对同个处理土壤微生物性质测定结果相似性不太一致。因此,在选用测试方法时要谨慎。E llis 等[57]用平板计数,BI O LOG 2,FAME 等方法分析了长期重金属

污染对土壤微生物群落的影响,结果显示各方法表现出一定程度的一致性,即可培养细菌的数量在重金属污染土壤受到了显著的抑制,重金属浓度越高其数量就越少;并得出BI O LOG 与平板计数法在测定重金属对微生物群落的影响上是有效的方法。Lawlor 等[58]用平板计数,BI O LOG 2,FAME 2法比较分析了长期灌溉污泥土

壤的微生物群落结构,3种方法结果均显示土壤微生物群落结构发生了变化。K elly 等[59]用P LFA 和BI O LOG

方法研究了施用污水污泥对土壤微生物群落结构的影响,结果表明,施用污泥使得BI O LOG 板中的吸光值速率变慢,指示菌根真菌和放线菌的P LFA 相对含量下降,均说明了污泥影响了土壤微生物群落结构的变化。Baath 等[60]用P LFA 分析法发现长期重金属污染(Zn 、Cu 、Ni )改变了土壤微生物群落结构,但在同一实验,用

BI O LOG 法分析并没有发现群落结构有明显的变化。T orsvik 等[61]用DNA 重组技术和PCR 2DGGE 分析方法研

究了重金属污染土壤的微生物群落结构和多样性,结果表明,重金属污染导致土壤微生物群落结构发生明显的变化、细菌多样性的降低以及一些细菌种群成为优势种,同时证明了DNA 重组技术结合PCR 2DGGE 分析方法能提供整个多样性以及群落结构变化的信息。因此,在选用测定方法时要谨慎,有条件的话最好结合使用各种方法。

5　展望

土壤微生物“黑箱”已经打开,问题是有多少新的土壤微生物分析方法可以揭示微生物种群结构和活性。我们现在仅仅才刚开始知道土壤微生物多样性远比仅用培养方法所了解的要复杂得多。污染物进入土壤后,对污染物有耐性响应的物种变多,微生物多样性降低,并促使群落结构发生实质性变化,这些都能够通过生化和分子技术方法分析而清晰地显示出来。而这些方法应该互相补充、结合使用,因为只有这样才能获得完整的微生物群落信息。然而,在分析污染土壤微生物群落结构多样性的同时,也应该关注它们的生理学多样性以及代谢活性的差异。同时,也应该注意到一个区域内微生物群落多样性的改变并不意味着其受到毒害作用,因此有必要对微生物群落结构的变化是如何影响微生物群落多样性进行研究[5]。

总之,现代微生物群落分析技术,尽管都有它们各自的局限性和偏差,但还是能很好地测定群落结构因污染影响而发生的真实变化。目前,对微生物群落遗传和功能多样性的认识过程中产生了越来越多的问题,而这些问题又促进我们对新方法的探索。从而,对“Who is there ”、“What are they doing ”等的无知也会逐渐减少[22],并对多样性和功能之间关系的认识也会逐渐清晰起来。

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《土壤里地微生物》教学设计课题

《土壤里的微生物》教学设计（第1课时） “土壤里的微生物”是科版七年级下册第13章第2节的容。是上一节课容的基础上，让学生进一步认识到土壤里生物的多样性，以及它们对生物圈的平衡和稳定起着非常重要的作用，从而对本单元环境中生物的多样性具有全面的认识。同时为下一章引导学生对生物进行分类奠定基础。因此本节课的意义十分重要，是本章的重点和难点。 教材分析 课标对本节的要“描述细菌的主要特征以及与人类生活的关系”。本节从单细胞细菌到多细胞的真菌、从肉眼看不见的细菌到大型真菌，带领学生走进丰富多彩的微生物世界。土壤中的微生物，学生平时不易见到，细菌需要用高倍显微镜才能更好地观察到形态，细菌的结构更难观察，而初中又不要求使用高倍显微镜，教材呈现了细菌的形态结构图片，所以只能通过图片、视频引导学生观察、比较认识细菌的基本特征。 学情分析 七年级学生通过小学科学课和上一学期生物课的学习，对生物学科有了初步的了解，具有一定的生物基础知识和学习经验，能够通过观察图片、阅读材料、对比分析、合作讨论等方式获取有关信息。但在学习上仍以感性认识为主，好奇心强、注意力容易转移,但他们活泼好动，喜欢直观形象的事物，喜欢动手实践。 有关微生物的相关知识在上学期在生态系统的组成学习过程中及学生日常生活经验中对微生物的类型和作用从总体上有了一个初步的了解，特别是在生活过程中家长或者教师从卫生角度常常提到细菌这个概念，学生对这一概念还是比较熟悉，对细菌与人类的关系也有不同程度的了解。但在生活中微生物是肉眼看不见的生物，只有用高倍或电子显微镜才能观察到，与人类的关系和对生物圈的作用又是隐性和潜在的，很少有机会引起学生的关注，容易被学生忽视和轻视，学生缺乏相应的感性知识和学习兴趣。对土壤中的微生物的类型、形态特征，生殖、营养方式、分布以及与人类生活的关系，学生比较陌生，这些是课程标准的明确要求，也是学生学习的终极目标。教材中只用文字表述，学生不容易理解，在教学中一是通过组织学生阅读教材在自主学习中从理论上了解细菌、放线菌的有关知识。二是通过播放有关细菌、放线菌形态、结构等视频资料及图片引导学生观察分析细菌和放线菌的形态、结构。三是利用小组

土壤微生物测定方法

土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算

高通量测序：环境微生物群落多样性分析

(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群

落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微

土壤微生物的分类、多样性及作用 王悦 1521011188

土壤微生物的分类及作用 摘要：土壤是生态系统中岩石圈、大气圈、水圈和生物圈的交界面，而土壤微生物分布广、数量大、种类多，是土壤的重要组成部分，也是土壤生物中最活跃的部分。其在地球生境中数量最多、生物多样性最复杂、生物量最大。土壤微生物能够参与土壤有机质的分解、腐殖质的合成、养分的转化和推动土壤的发育和形成，同时它也是土壤肥力水平的活性指标。因此研究土壤微生物的分类、多样性以及其在土壤中的作用有重要意义。 关键词：土壤微生物分类；土壤微生物多样性；土壤微生物作用 Abstract:The soil is the interface of lithosphere, atmosphere, hydrosphere, and biosphere in the ecosystem.There are many kinds of soil microbial,their havel wide distribution and large quantity and, they are an important component of the soil, as well as the most active part of soil organisms. In the earth's habitats, their biodiversity is the most complex and the biomass is the largest. Soil microorganisms can participate in soil organic matter decomposition, synthesis of humus, nutrient transformation and promote the development and form of the soil, it is also the activity indicators of soil fertility level .So research the classification, the diversity of soil microorganisms and its role in the soil have important significance. Key words: the classification of soil microorganisms, the diversity of soil microorganisms, the role of soil microorganisms. 1 引言 土壤微生物是从19世纪中叶发展起来的一支生命科学的分支学科[1]，这时学术界己经将土壤内部的三大过程(土壤有机质的分解、硝化和固氮作用)清晰界定为生物过程，对这些土壤内部过程的机理探索直接催生了土壤微生物学，并导致20世纪初土壤微生物学的空前繁荣。土壤微生物是土壤生物的重要组成部分，参与了土壤发生、发展和发育的全过程。其群落结构组成和生物量等可以反映土壤的肥力状况。土壤微生物可以分解土壤有机质和促进腐殖质形成，吸收、固定并释放养分, 对植物营养状况的改善和调节有重要作用。有些微生物可以和植物形成共生系统，促进植物的生长发育。同时土壤微生物在降解土壤污染物方面也有重要作用。 2 土壤微生物的组成及分类[2] 土壤微生物的生物量通常以生物量碳表示。它是指土壤中体积小于5x103um3的生物总量，包括细菌、放线菌、真菌和小型动物，不包括植物根系。测量土壤微生物生物量的方法包括传统镜检法、成分分析法、底物诱导呼吸法和熏蒸法。 土壤微生物按形态可以分为真核微生物，原核微生物和分子微生物。其中真核微生物包括真菌和藻类。原核微生物有细菌、放线菌和蓝细菌。分子生物则无

七年级：土壤里的微生物

初中生物新课程标准教材 生物教案( 2019 — 2020学年度第二学期 ) 学校： 年级： 任课教师： 生物教案 / 初中生物 / 七年级生物教案 编订：XX文讯教育机构

土壤里的微生物 教材简介:本教材主要用途为通过学习生物这门课程，可以让学生打开对世界的认识，提高自身的见识，本教学设计资料适用于初中七年级生物科目, 学习后学生能得到全面的发展和提高。本内容是按照教材的内容进行的编写，可以放心修改调整或直接进行教学使用。 一、教学目标 (一)认知目标 1．介绍细菌、放线菌和真菌的形态结构、营养方式和生殖方式。 2．介绍微生物在自然界里的作用 (二)技能目标 培养学生的观察能力、分析问题的能力 (三)情感目标 1．通过对微生物在生产生活中应用的学习，培养理论与实践相结合的习惯。 2．通过介绍我国人民利用微生物造福社会的事例，激发学生的民族自豪感。 二、教学重点与难点 1．教学重点：微生物的形态、结构、营养方式。 2．教学难点：微生物的营养方式和生殖。

四、教学过程 （一）导入 一、认识细菌： 引入新课，教师接着指出：细菌分布广泛，无论是空气、水、土壤还是每个人身上都有细菌生活。但它是单细胞生物，个体十分微小，所以我们用眼睛看不到，下面我们就要了解一下细菌的形态和结构特点。 细菌形态①用高倍显微镜演示细菌的三种形态；②可以用显微投影仪投影放大细菌的三种形态。③播放细菌显微结构和亚显微结构的录像片段。细菌三种形态的示意图。接着教师总结出细菌的形态：单细胞个体，从形态上分为：球菌、杆菌和螺旋菌三类。 （3）细菌的结构特点，让学生与前面所学过的植物细胞结构进行比较找出相同点和不同点。注意强调：细菌细胞没有成形的细胞核是细菌细胞与植物细胞在结构上的重要区别，所以细菌不属于植物范围。另外，有些细菌具有特殊结构如：①有的细菌具有鞭毛可在水中游动。②有的细菌在细胞壁外有荚膜、具有保护作用。 关于芽孢，教师应该指出：能否形成芽孢是细菌总的特征，不是所有细菌都能形成芽孢。芽孢是该菌种的休眠状态，称休眠体。注意说明芽孢的形成不是细菌的繁殖方式，一个细菌只能生成一个芽孢，在适宜条件下，一个芽孢萌发形成一个菌体。芽孢对恶劣环境有很强的

微生物多样性研究—β多样性分析概述

微生物多样研究中的—β多样性分析概述

一、β-多样性分析介绍 1. β（Beta）Diversity： 是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。 ?β多样性分析前的数据“来源”： 1）OTUs的丰度信息表； 2）OTUs之间的系统发生关系， 计算Unweighted Unifrac及Weighted Unifrac距离。 ?通过多变量统计学方法主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)等分析方法，从中发现不同样品（组）间的差异。

2. PCA & PCoA分析 ?主成分分析（PCA）是多变量统计学中最为人熟知的分析方法，它通过线性变换，将原始的高维数据投影至少量新合成的变量（即主成分），从而简化数据结构，展现样品的自然分布。 ?主成分分析不考虑原始变量之间可能存在的相互关系，并且是基于欧式距离评价样品之间的相似度。 ?多维尺度分析与主成分分析类似，但是它可以采用任何距离评价样品之间的相似度。主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）是经典的多维尺度分析方法。

3.UniFrac距离 ?由于微生物极其多样，不同微生物彼此之间的系统发育关系往往千差万别，仅仅将群落中不同微生物成员视为相互独立的变量显然并不合理。 ?因此，在比较不同群落样品之间的差异时，需要考虑两个群落成员之间的系统发育关系是否相似。 ?基于这个思想，计算微生物群落样品间距离的UniFrac距离应运而生，通过比较两个群落各自独有的微生物成员之间系统发育关系的远近，更为客观地反映两个群落样品之间的相似程度。

《土壤里的微生物》教学设计

《土壤里的微生物》教学设计（第1课时） 教材分析 “土壤里的微生物”是苏科版七年级下册第13章第2节的内容。是上一节课内容的基础上，让学生进一步认识到土壤里生物的多样性，以及它们对生物圈的平衡和稳定起着非常重要的作用，从而对本单元环境中生物的多样性具有全面的认识。同时为下一章引导学生对生物进行分类奠定基础。因此本节课的意义十分重要，是本章的重点和难点。 课标对本节的要求是“描述细菌的主要特征以及与人类生活的关系”。本节从单细胞细菌到多细胞的真菌、从肉眼看不见的细菌到大型真菌，带领学生走进丰富多彩的微生物世界。土壤中的微生物，学生平时不易见到，细菌需要用高倍显微镜才能更好地观察到形态，细菌的结构更难观察，而初中又不要求使用高倍显微镜，教材呈现了细菌的形态结构图片，所以只能通过图片、视频引导学生观察、比较认识细菌的基本特征。 学情分析 七年级学生通过小学科学课和上一学期生物课的学习，对生物学科有了初步的了解，具有一定的生物基础知识和学习经验，能够通过观察图片、阅读材料、对比分析、合作讨论等方式获取有关信息。但在学习上仍以感性认识为主，好奇心强、注意力容易转移,但他们活泼好动，喜欢直观形象的事物，喜欢动手实践。 有关微生物的相关知识在上学期在生态系统的组成学习过程中及学生日常生活经验中对微生物的类型和作用从总体上有了一个初步的了解，特别是在生活过程中家长或者教师从卫生角度常常提到细菌这个概念，学生对这一概念还是比较熟悉，对细菌与人类的关系也有不同程度的了解。但在生活中微生物是肉眼看不见的生物，只有用高倍或电子显微镜才能观察到，与人类的关系和对生物圈的作用又是隐性和潜在的，很少有机会引起学生的关注，容易被学生忽视和轻视，学生缺乏相应的感性知识和学习兴趣。对土壤中的微生物的类型、形态特征，生殖、营养方式、分布以及与人类生活的关系，学生比较陌生，这些是课程标准的明确要求，也是学生学习的终极目标。教材中只用文字表述，学生不容易理解，在教学中一是通过组织学生阅读教材在自主学习中从理论上了解细菌、放线菌的有关知识。二是通过播放有关细菌、放线菌形态、结构等视频资料及图片引导学生观察分析细菌和放线菌的形态、结构。三是利用小组合作学习并结合观察、对比的方法，引导学生主动获取知识。四是注重发掘生活资源，

土壤微生物群落多样性研究方法及进展_1

第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。

土壤里的微生物

第2节土壤里的微生物 一、教学目标： 1．知识目标： （1）概述土壤里主要的微生物种类。 （2）说出细菌的三种形态和基本结构，并与植物细胞和动物细胞比较细胞结构的异同点。 （3）说出放线菌的结构特点。 （4）识别青霉和匍枝根霉，并说出它们的繁殖方式和营养方式。 2．能力目标： （1）学会培养和观察青霉、匍枝根霉。 （2）探究土壤里的微生物。 3．情感态度与价值观目标： 体验培养霉菌的过程，并交流成功或失败的感受。 二、教学重点和教学难点： 教学重点：细菌、放线菌和真菌（青霉和匍枝根霉）的主要特征。 教学难点：细菌与植物细胞、动物细胞比较细胞结构的异同点。 三、教学方法：观察、讨论、比较等 四、教学过程： 引言：土壤里除了生活着一些小动物外，还有一些我们肉眼看不见或看不清的小生物，我们通常把这些小生物叫做微生物。那么土壤里都有哪些微生物呢？（学生讨论，教师小结。） 土壤里微生物主要有细菌、真菌、放线菌等，它们能分解植物的枯枝烂叶，动物的遗骸等，将土壤中的有机物分解成无机物，增加了土壤的肥力。 这些微生物到底是什么形态？它们有那些特征呢？这节课就让我们一起来认识它们。 一、认识细菌： 1．细菌的分布范围： 细菌在生物圈中数量最多，占土壤微生物总量的70%～90%，你认为在生物圈中哪些地方会分布有细菌？ 学生：土壤、水里、空气，人、动物、植物体内、体表等。

教师：由此可见，细菌的分布非常广泛。 2．形态特征： （1）大小： 资料：细菌的直径一般只有1um左右，电子显微镜才能观察到细菌的形态和结构。 学生阅读资料，发现细菌个体十分微小。 （2）形状： 教师：展示图片：三种细菌 人们在电子显微镜下观察到细菌，请根据图片描述细菌有哪三种形态。 学生：球形、杆形、螺旋形。 教师：根据它们的形态，我们可以分别称它们为：球菌、杆菌、螺旋菌。3．结构特征： 不同种类的细菌虽然形态不同，但它们的基本结构却是相同的。 学生看图12-5：细菌细胞的结构示意图。观察讨论： 细菌有哪些结构？细菌的结构与动植物细胞的结构有何异同？ 4．生活方式：

污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法

第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖　敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州　310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.wendangku.net/doc/3a8158101.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209　中图分类号:Q143,Q938,S154　文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial

微生物多样性研究进展

姓名：崔靖璞学号：2010212802 专业：生物科学 微生物多样性研究进展 摘要：微生物资源丰富,开发潜力巨大,是生命科学发展的主要动力之一.本文介绍了几种常用的研究微生物多样性的分子生物学技术,主要包括:16SrDNA测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等,并对微生物多样性研究技术的未来发展进行了展望，同时本文也介绍几种微生物多样性的研究实验方法。 关键词:微生物多样性聚合酶链式反应基因芯片平板纯培养 微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源,微生物资源的开发,是21世纪生命科学发展的主要动力之一.由于微生物的微观性,微生物多样性与其他高等生物相比有许多独特之处,包括:生存环境多样;生长、繁殖速度多样;营养、代谢类型多样;生活方式多样.微生物多样性的揭示与研究技术的发展和创新是密不可分的,研究技术的进步是微生物多样性研究向前发展的重要推动力量.近年来,随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等技术的发展,微生物多样性研究技术也在吸收其他学科先进技术的基础上不断向前发展.各种研究方法的发展使得这种状况有了很大改观.现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性.目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:16SrDNA 测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。 1核酸探针杂交技术 核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术.该技术快速、灵敏、具有高度特异性,近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中.用于微生物多样性研究的探针主要有三类:双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针,杂交方式主要有荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、全细胞杂交(whole-cell hybridization)、数量印迹杂交(quantitative dot blot)及生物芯片(biochip).对于环境微生物样品解析而言,最有意义的核酸杂交技术是原位杂交技术,在原位杂交技术中,应用最广泛的是荧光原位杂交技术。

土壤微生物多样性的主要影响因素

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/3a8158101.html, 土壤微生物多样性的主要影响因素 作者：汪海静 来源：《北方环境》2011年第02期 摘要：土壤微生物是土壤生态系统的主要组成部分，而且不同的土壤具有不同的土壤微生物群落。影响土壤微生物多样性的因素很多，主要可以分为自然因素和人为因素。本文将从土壤微生物多样性的影响因素的两个方面阐述目前国内外土壤微生物多样性的研究现状。 关键词：土壤微生物；微生物多样性；影响因素 中图分类号：X53文献标识码：A文章编号：1007-0370(2011)1，2-0090-02 土壤微生物系统作为稳定生态系统，是保证动植物生存、农业健康、持续发展的基础。在一定程度上地球生态系统的变化与土壤微生物群落的变化密切相关。研究土壤微生物多样性的变化情况对评价生态系统、维护生态平衡有着十分重要的意义，因此土壤多样性的研究得到了广泛学者的关注。 影响土壤微生物群落的结构组成和多样性的因素可大体分成自然因素和人为因素两大类。自然因素包括土壤类型、温度、水分、植被等；人为因素包括土壤的耕作方式、农药的施用、施肥的施用等。本文将分别对几种有代表性的土壤微生物多样性影响因素加以阐述。 1、自然因素 1.1土壤类型 地球上土壤类型是多种多样的，不同土壤类型中的微生物群落结构及组成也是千差万别的。目前来许多的研究都表明土壤类型是土壤微生物群落结构的主要影响因素之一。例如：Gelsomino等通过比较不同地理位置的16种土壤微生物DGGE图谱发现土壤类型是决定土壤 微生物群落结构的主要因素。杨超等研究了我国皖南烟区四种不同植烟土壤类型在烟叶生长期内的微生物种类、数量变化情况。其结果表明了在不同的土壤环境下土壤微生物的数量和土壤养分含量呈正相关关系。这同时也说明了土壤类型在土壤微生物多样性方面具有一定的影响力。 1.2植被情况

土壤中的微生物

1．土壤是微生物生长和栖息的良好基地 土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地：其原因在于土壤舍有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤台有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其问的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的pH值范围。3．5～10．0之间，多数在5.5～8．5之间，而大多数微生物的适宜生长pH也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中．也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢．夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高，这一特性极有利于微生物的生长。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。 因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌就是分离自土壤。 2．土壤中的微生物数量与分布 土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种埴状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。lg肥沃的菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103～107个微生物，甚至更低。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数量较少，影响也小。 (1)细菌 土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的 1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类群，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。 细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化； (2)放线菌 土壤中放线菌的数量仅次于细菌．它们以分枝丝状营养体缠绕于有机物或土粒表面，并伸是于土壤孔隙中。1g土壤中的放线菌孢子可达107～108个．占土壤微生物总数的5％～30%．在有机物含量丰富和偏碱性土壤中这个比例更高。

土壤微生物研究进展

哈尔滨师范大学 学年论文 题目植物与微生物关系研究进展 学生李春葳 指导教师王全伟副教授 年级 2009级 专业生物科学 系别生物科学系 学院生命科学与技术学院 哈尔滨师范大学 2012年5月

论文提要 植物与其生长环境中的微生物关系密切，两者形成了植物—微生物共生体系统。植物影响着其周围及体内的微生物的群落结构，这些微生物又通过其生命活动影响植物的生长发育。了解与认识植物与微生物的相互作用对于农业生产具有重要意义。本文就植物类型及植物根系分泌物对微生物群落结构及多样性的影响,植物根际微生物、叶围微生物和内生菌(包括内生真菌、内生细菌以及内生放线菌)对植物生长发育的影响等进行综述，并就其将来的研究方向做了展望。

植物与微生物关系研究进展 李春葳 摘要:植物与其生长环境中的微生物关系密切,两者形成了植物—微生物共生体系统。植物影响着其周围及体内的微生物的群落结构,这些微生物又通过其生命活动影响植物的生长发育。了解与认识植物与微生物的相互作用对于农业生产具有重要意义。本文就植物类型及植物根系分泌物对微生物群落及其多样性的影响,植物根际微生物、叶围微生物和内生菌(包括内生真菌、内生细菌以及内生放线菌)对植物生长发育的影响等进行综述,并就其将来的研究方向做了展望。 关键词:植物植物根际微生物内生菌叶围微生物 植物与微生物的相互作用主要包括植物与根际微生物的互作、植物与叶围微生物的互作、植物与内生菌的互作及植物对微生物多样性的影响等。植物与周围环境生物的相互作用在自然界中普遍存在,其中以植物与微生物的互作为重要形式之一。本文就植物类型及植物根系分泌物对微生物群落及其多样性的影响,植物根际微生物、叶围微生物和内生菌(包括内生真菌、内生细菌以及内生放线菌)对植物生长发育的影响等进行综述,并就其将来的研究方向做了展望。 １植物根际有益微生生物与植物的关系 植物根际有益微生物主要指对植物生长和健康具有促进作用的土壤微生物。这些微生物可以通过一些途径，促进植物定植、生长和发育[1、2]。根据根际有益微生物主要作用可以将其分为植物根际促生微生物PGPM（plant growth promoting micribiology）和生防微生物BCA（biological control agents）2大类。 1.1植物促生微生物 植物促生微生物主要包括根瘤菌（Rhizobium）、菌根菌等。固氮微生物（自生固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌）可以通过固定大气中的Ｎ 从而增加植物对氮素的吸收。ＷｕＦ ２ Ｂ发现，苗期海岛棉(Gossypium barbadense)接种自生固氮菌（Azotobacter sp.）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、多糖芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）和根瘤菌后，其功能叶中氮、磷、叶绿素含量以及生物学产量均明显提高[3]。尽管固氮微生物在非豆科植物以外的其他植物根际所占比例很小（1％），但对某些植物来说其根际固氮微生物所固定的氮素对其生长来说仍是重要氮源[1]。有些植物根际促生微生物（主要是菌根真菌）可以通过影响植物根系形态及生理特征，如增加植物根系吸收面积、改变植物根系通透性从而影响植物对N、P、K的吸收[4]。陈洁敏等[5]研究表明，分别接种3种AMF（泡囊丛枝菌根真菌）的玉米（Zeamays）对氮和磷的吸收比未接种的玉米增加了41.14％～78.29％。一些植物根际促生微生物可以通过产生有机酸或酶一类的代谢产物作用于土壤中以螯合形式存在的营养元素，从而使其活化，特别是许多AM真菌对P直接进行活化，从而增加了土壤中植物可利用的P。也有研究表明，菌根可以增加植物对水分的吸收，从而提高植物的抗旱能力。

从土壤中分离微生物

从土壤中分离微生物 环境工程（1）班 一、试验目的 1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。 二、实验原理 土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。 三、实验器材 (—)培养基 肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌） 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌） 查氏培养基（培养霉菌） (二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 (三)土壤样品、天平、称旦纸。 （四）恒温箱、气体流量计 四、试验程序 1、倒平板 将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板； 2、制备土壤稀释液 准确称取土样10g，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液

3、涂布 将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，更换稀释度时需将玻璃涂棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换涂棒。 4、培养 在28℃条件下倒置培养3—5天。 5、挑菌落 将培养后生长出的单个菌落分别挑取少量细胞划线接种到平板上。28℃条件下培养3—5天后，再次挑单菌落划线并培养，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，如果发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，直到获得纯培养。 五、注意事项 1.制备混合液平板时，不要再注入培养基前让链霉素液与土壤稀释液相混。 2.制备混合液平板时，倾注的培养基温度不能太高，过高的温度会烫死微生物。 六、培养过程及革兰氏染色观察成果 1.培养24h后的情况：马铃薯葡萄糖培养基长出菌种，经判断为细菌，马铃薯蔗糖培养基长出菌种，为酵母菌。其他培养基没长菌种，拍照如下