酵母双杂交原理、操作方法

酵母双杂交系统

1．原理

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

2．试验流程

酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。

2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。

2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。

3．特点

优点

蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。

缺点

尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。

使用酵母双杂交技术应注意的问题

真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是，一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的

产品不断更新换代，要认真阅读实验指导手册，以防出现失误。

4．应用

研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。

酵母双杂交技术

酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点

酵母双杂(共转)

酵母双杂交的原理及实验步骤 吴健2015.12.25 一酵母双杂交的原理 在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1 的转录。GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结 合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在 重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。酵母双杂交系统就是在 这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。除了 将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。 Fig1. 酵母双杂原理图

Fig2. 常用两种酵母菌的基因型 Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因

Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图

二酵母双杂交的基本步骤 1 酵母感受态的制备 配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。 1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌 落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种； 2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的 YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h； 3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震 荡培养20 h，直到OD 600 =0.3； 4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5； 5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块； 6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块； 7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec； 8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。制好的 感受态细胞应该立即使用（2 h 以内），不能长时间保存。 2 酵母小规模转化 2) 在预冷无菌的1.5 ml 的离心管中依次加入： 质粒DNA 0.5 μg herring testes carrier DNA（10mg/ml） 5 μl （使用前沸水煮5min，立刻放入冰上）感受态细胞50 μl 轻轻震荡混匀； 3) 加入0.5 ml 的PEG/LiAc 溶液，轻轻在振荡器上震荡混匀； 4) 在30℃水浴中孵育30 min，每隔10 min 混匀一次； 5) 加入20 μl 的DMSO（Dimethyl sulfoxide），42℃水浴热休克15 min，每隔5 min 混 匀一次； 6) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml YPD plus 液体培养基悬浮细胞块； 7) 30℃震荡培养90 min； 8) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml 的0.9%的NaCl 溶液悬浮； 9) 取1:10, 1:100, 1:1000 的稀释度涂皿；或者直接取100 μl涂于相应的SD平板上， 10) 30℃倒置培养直到单克隆长出，统计转化效率。挑取单克隆检测以及保存菌种， 备用。

酵母双杂交操作步骤

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) 各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四 缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度%的YNB中再加入%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为的YNB与硫酸铵。

酵母双杂交

酵母双杂交 随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成, 基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述, 尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。系统综合分析蛋白- 蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息。酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术, 可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的 研究中已被广泛的得到证实。随着人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序的完成, 酵母双杂交及其衍生的相关技术将在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。 一、酵母双杂交原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转

录反应。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。 二、酵母双杂交的系统 酵母双杂交常用的有两种系统，第一种为LexA系统：DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 第二种为Gal4系统：BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GAL UAS结合，只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GAL UAS结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个 蛋白之间是否存在相互作用。 三、操作流程 1、配制转化溶液

酵母双杂交原理及步骤

酵母双杂交原理及步骤 以酵母双杂交原理及步骤为标题，本文将探讨酵母双杂交的原理和步骤。酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用、信号转导和基因调控等生物学过程。 酵母双杂交是一种基于酵母菌的遗传系统的实验方法，通过检测两个蛋白质是否相互作用，从而揭示它们之间的相互作用关系。这种方法的核心原理是将两个感兴趣的蛋白质分别与DNA结合域和激活域相连，当这两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域会靠近，从而激活报告基因的表达。 酵母双杂交实验的步骤如下： 1. 构建融合基因：首先需要选取两个感兴趣的蛋白质，并将它们的编码序列分别克隆到酵母双杂交载体的DNA结合域和激活域上。DNA结合域和激活域是两个功能区域，当两个蛋白质相互作用时，这两个功能区域会靠近并激活报告基因的表达。 2. 转化酵母菌：将构建好的酵母双杂交载体导入酵母菌中。酵母菌是双杂交实验中常用的宿主，因为它具有简单的遗传系统和易于生长的特点。 3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母菌分别接种在缺失报告基因所需的营养物的培养基上。只有当两个蛋白质相互作用时，DNA结合域

和激活域才能靠近并激活报告基因的表达，从而使酵母菌能够在缺失营养物的培养基上生长。 4. 验证相互作用：通过进一步的实验证实阳性克隆的相互作用。常用的方法包括酵母菌营养物补充实验、酵母菌生长曲线分析和蛋白质互聚实验等。 酵母双杂交技术的优点在于它能够直接在真核细胞中研究蛋白质相互作用，同时具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等特点。然而，也需要注意到酵母双杂交实验存在一定的局限性，如假阳性和假阴性结果的可能性，以及蛋白质结构和功能的局限性等。 酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，通过构建融合基因、转化酵母菌、筛选阳性克隆和验证相互作用等步骤，可以研究蛋白质相互作用等生物学过程。在实际应用中，需要综合考虑实验设计、阳性和阴性对照、验证方法等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息

酵母双杂交实验原理及具体步骤

酵母双杂交 原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。 方法：

酵母双杂交实验步骤

LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4. 对照质粒： 质粒用途 pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照 pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物： pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 三、酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒选择培养基克隆生长情况说明

酵母双杂技术的原理和应用

酵母双杂技术的原理和应用 一、酵母双杂技术的原理 酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面： 1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂 交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。 2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基 因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。 3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补 DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补 DNA库中的DNA发生相互作用。然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。 二、酵母双杂技术的应用 酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面： 1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标 蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。 2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互 作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。 3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作 用的蛋白，从而推断目标基因的功能。这有助于揭示基因的调控机制和功能。 4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关 的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。 5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关 的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。

酵母双杂交鉴别

酵母双杂交鉴别 酵母双杂交鉴别是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和酵母细胞中的信号转导通路。本文将介绍酵母双杂交鉴别的原理、操作步骤和应用，并探讨其优缺点及未来发展方向。 一、原理 酵母双杂交鉴别是基于酵母细胞中的转录激活子-蛋白质相互作用的原理。该技术利用酵母细胞内的转录激活子（activation domain，AD）和DNA结合域（DNA-binding domain，BD）的相互作用，实现对蛋白质相互作用的鉴定。在酵母双杂交系统中，AD和BD分别与待测蛋白质的两个亚单位相连，形成一个复合物。当两个蛋白质相互作用时，AD和BD也会相互作用，激活报告基因的表达，从而产生可观察的表型。 二、操作步骤 酵母双杂交鉴别的操作步骤主要包括以下几个方面： 1. 构建酵母表达载体：将待测蛋白质的AD和BD亚单位分别克隆到酵母表达载体中，构建AD和BD融合蛋白的表达载体。 2. 转化酵母细胞：将构建好的表达载体转化到酵母细胞中，使其表达AD和BD融合蛋白。 3. 交配：将含有不同AD和BD融合蛋白的酵母细胞进行交配，使

其杂交。 4. 筛选：通过对交配后的酵母细胞进行选择培养基的筛选，筛选出能够表达报告基因的阳性克隆。 5. 验证：通过进一步的实验证实，确定阳性克隆中的相互作用是否真实可靠。 三、应用 酵母双杂交鉴别在蛋白质相互作用研究中有着广泛的应用。它可以用于鉴定蛋白质间的直接相互作用、建立蛋白质相互作用网络、研究蛋白质的功能和信号通路等。此外，酵母双杂交鉴别还可以用于药物筛选和疾病相关蛋白质相互作用的研究。 四、优缺点 酵母双杂交鉴别有以下优点：操作简便、高通量、适用于大规模蛋白质相互作用筛选，可以筛选出潜在的蛋白质相互作用对。然而，酵母双杂交鉴别也存在一定的局限性：可能存在假阳性和假阴性结果，无法鉴定动态和间接的蛋白质相互作用。 五、未来发展方向 随着技术的不断发展，酵母双杂交鉴别也在不断改进和完善。未来的发展方向主要包括以下几个方面： 1. 提高鉴定准确性：通过改进酵母双杂交鉴别的实验设计和筛选条

酵母单双杂交原理

酵母单双杂交原理 酵母单双杂交是一种常用的遗传学实验方法，用于研究酵母细胞中基因的功能和相互作用。该方法基于酵母细胞的性别特性和遗传特性，通过交配产生单倍体和双倍体的酵母细胞，从而实现对基因的分离和分析。 酵母菌是一种单细胞真核生物，其遗传特性与其他真核生物类似，具有两个性别类型：雌性和雄性。雌性细胞称为a型细胞，雄性细胞称为α型细胞。在酵母的生命周期中，单倍体细胞可以通过有丝分裂不断繁殖，也可以通过配子体形成双倍体细胞。 酵母单双杂交的基本原理是将a型和α型的酵母细胞进行交配，形成双倍体细胞。具体步骤如下： 1. 培养酵母细胞：首先，分别培养纯合的a型和α型酵母细胞。培养条件包括适当的培养基和温度，以及适当的培养时间，使酵母细胞处于最佳生长状态。 2. 交配：将纯合的a型和α型酵母细胞混合在一起，通过搅拌或震荡等方式使其充分接触。在一定条件下，a型和α型酵母细胞会发生交配，并形成双倍体细胞。 3. 选择双倍体细胞：将混合后的酵母细胞接种在含有特定抗生素的培养基中。抗生素可以选择性地杀死单倍体细胞，而对双倍体细胞

不起作用。这样就可以通过选择性培养，筛选出双倍体细胞。 4. 分离双倍体细胞：将筛选出的双倍体细胞进行分离，分别培养成单倍体细胞。这可以通过稀释培养、染色体分离或其他方法实现。通过酵母单双杂交实验，可以研究基因的功能和相互作用。通过将感兴趣的基因与报告基因或标签基因相连，可以观察其在双倍体细胞中的表达情况。此外，还可以通过检测特定基因在双倍体细胞中的相互作用，探索基因网络和信号传导途径。 酵母单双杂交方法具有以下优点： 1. 快速：酵母细胞繁殖快速，培养周期短，可以在短时间内获得大量的杂交细胞。 2. 简单：酵母单双杂交实验步骤简单，操作相对容易，不需要昂贵的设备和材料。 3. 灵活性：酵母单双杂交方法可以用于不同的研究目的，包括研究基因的功能、相互作用、信号传导途径等。 4. 可靠性：酵母单双杂交方法已被广泛应用于许多研究领域，具有较高的可靠性和重复性。 总结起来，酵母单双杂交是一种常用的遗传学实验方法，通过交配和选择分离，可以获得双倍体酵母细胞，用于研究基因的功能和相

酵母双杂交的原理和应用

酵母双杂交的原理和应用 前言 酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。 一、酵母双杂交原理 酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。 该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。 1.酵母杂交库的构建 –首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。 –这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。当目标蛋白与与之相互作 用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。 2.蛋白质相互作用的检测 –将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。 –利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。 二、酵母双杂交的应用 酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面： 1.蛋白质相互作用的筛选 –酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白， 从而探索蛋白质间的相互作用网络。 2.功能区域的鉴定 –通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与 其他蛋白质相互作用的功能区域。 3.药物靶点的鉴定 –酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进 而确定药物的作用机制和潜在靶点。

酵母双杂交技术

酵母双杂交技术 引言 酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究 蛋白质-蛋白质相互作用。该技术能够检测和分析细胞内发生 的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、 代谢途径和疾病发生机制。本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。 原理 酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表 达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋 白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。 具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤： 1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的 编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化 域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。

2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。 3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交 剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。 4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表 达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达 结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。应用 1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮 助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白 质之间的相互关系和调控机制。 2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛 选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了 解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。 3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物 靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研 发过程。

酵母双杂交-孔德晶

酵母转化 (一)原理： 我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态，此时它们能够摄取外源性DNA。PEG是一种高分子聚合物，只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最 大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350，实验结果表明转化效果可以 达到103～105cfu/μg。PEG在酵母转化中起到在高浓度LiAc环境中保护细胞膜， 减少LiAc对细胞膜结构的过渡损伤，同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的 浓度是务必适宜，这一点很重要。 鲑鱼精DNA为短的线形单链DNA，在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解。另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。在每 次使用前务必进行热变性，使可能结合的双链DNA打开，保证鲑鱼精DNA在转 化实验体系中以单链形式存在。 (二)材料、仪器设备及试剂： 1.SD 培养基： ●YNB：1.6g/L ●硫酸铵：5g/L ●氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加 ●调节pH=5.8，121°灭菌20min。 2.YPDA培养基 ●胰蛋白胨：20g/L ●酵母浸膏：10g/L ●琼脂：20g/L(固体) ●腺嘌呤：15ml 0.2%腺嘌呤/L ●调节pH =7.5，121°灭菌20min。 3.100%DMSO 4.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） ●Tris-HCl：1.211g/100ml ●EDTA：0.37g/100ml ●调节pH=7.5，121°灭菌20min。 5.10×LiAc（pH=7.5） ●1M LiAc：10.202g/100ml ●用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min。 6.1×TE/1×LiAc 现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中 终浓度10ml H2O 8ml

!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

!!酵母双杂交操作步骤（中文翻译）（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念： 1.次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA- BD/baitplamid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfuionlibrary）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2.共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin(氨苄西林)？ 各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-hi（组氨酸）(1000ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g; -ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.60g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%) 2)SD/-leu/-trp/-hi(1000ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g; -leu/-trp/-hiDOupplement0.62g;（购买来就配好的）葡萄糖 20g.(即2%) 3)SD/-leu/-trp(1000ml)（？“二缺”）

酵母氮源（YNB）：6.7g; -ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.64g（购买来就配好的）;葡萄糖 20g(即2%) 4)SD/-leu(1000ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g; -leuDOupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%) 5)SD/-trp(1000ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g; -ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.74g;（购买来就配好的） 葡萄糖20g(即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这 用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在 终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000ml溶液中加 入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌 的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DOupplement在920ml水中溶解， 调PH至5.8（李博士的经验大约加10MNaOH200ul即可），之后补水至 950ml。