水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像

DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.31109

水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像

梁淑彩*1　陈小慧2　刘衍斌1　秦蒙2　鄢国平*21(武汉大学药学院,武汉430072) 2(武汉工程大学材料科学与工程学院,武汉430074)

摘　要　报道了一种能用于活细胞双光子荧光(TPF)成像的水溶性聚合物纳米粒三首先以含双羧基的萘酰亚胺作为交联剂和荧光标记试剂,通过对聚乙烯亚胺发生交联反应制备纳米粒子,然后对其结构形态二单双光子荧光性能及细胞毒性进行测试三结果表明,获得的纳米粒为球形,粒径为5~10nm;以443或800nm 为激发波长,荧光发射波长均为536nm;在pH 4.0~9.0范围内,其荧光无明显变化;在pH 7.4的溶液中和激发光为443nm 的条件下,对其连续测定1.2万次后荧光强度变化不超过1%,说明其酸碱稳定性和光稳定性较好;浓度在15mg /L 以下及与细胞作用时间在24h 以内细胞毒性较低三最后,用双光子共聚焦荧光显微镜观察了其在Hela 细胞中的TPF 成像性能三将Hela 细胞与纳米粒共同孵育2h 后,在800nm 激光激发下,在细胞中可观察到其绿色荧光三此纳米粒可望用于靶向性双光子荧光成像探针的开发三

关键词　萘酰亚胺;聚乙烯亚胺;荧光聚合物纳米粒;双光子成像

　2013?11?14收稿;2014?01?12接受本文系国家自然科学基金(Nos.20905059,20835004)资助*E?mail:chirolab@https://www.wendangku.net/doc/3b13431072.html,;guopyan2006@https://www.wendangku.net/doc/3b13431072.html,

1　引　言

双光子荧光(TPF)成像技术具有高的系统分辨率和信噪比,能对处在自然状态的样品进行无损观察与成像,在生物医学分析领域具有极大的应用空间三TPF 成像应用的发展离不开性能优良的TPF 材料三目前,有机小分子染料作为TPF 材料的研究较多[1,2],但这些材料大多光稳定性和水溶性差,在体内清除较快,不利于生物体系的成像研究三采用纳米材料可以有效减少上述问题,最具有代表性的是无机发光量子点(QD)三QD 的光稳定性和荧光性能俱佳,是荧光成像领域研究的热点[3,4],在细胞及组织中的TPF 成像应用已有报道[5~7]三但其对人体健康与生态环境可能产生的不利影响限制了其大规模生产和应用[8,9]三

负载荧光染料的聚合物纳米材料具有好的生物相容性,并将大量染料包裹在一个纳米粒中,可大大提高检测灵敏度和材料的光稳定性,在单光子荧光成像方面已有广泛应用[10]三近年来,聚合物TPF 材料的开发也开始引起注意,目前报道的多以疏水性聚合物包裹TPF 染料形成聚合物纳米粒三这种纳米粒中TPF 染料以非共价键方式存在,容易造成染料泄漏,同时得到的纳米材料亲水性差,使用时需分散至水溶液中或表面再进行亲水性修饰[11,12]三聚乙烯亚胺(PEI)有良好的水溶性和生物相容性,是药物传递系统常用的载体材料[13,14]三萘酰亚胺衍生物具有好的荧光性能,如光稳定性,大的Stocks 位移和高的荧光强度等,已用于开发测定F -二H 2S 及H 2O 2等的TPF 探针[15~17]三本实验以含双羧基的萘酰亚胺染料对PEI 进行交联制备了一种染料与聚合物共价键合的水溶性荧光聚合物纳米材料,对其结构二荧光性质及细胞毒性进行了测试,并考察了其在Hela 细胞中的TPF 成像三研究表明,此纳米粒为球形,粒径5~10nm;具有好的pH 和光稳定性,且浓度在15mg /L 以下有较低的毒性;能够进入细胞,在800nm 的激发光下,用共聚焦显微镜可以观察到细胞内纳米粒的绿色荧光,可望用于靶向性TPF 成像探针的开发三

2　实验部分

2.1　仪器及试剂INOVA 400型核磁共振仪(美国Varian 公司);20DXB 型红外光谱仪(美国Nicolet 公司);UV?2550第42卷

2014年5月 分析化学(FENXI HUAXUE)　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期648~653

型紫外分光光度计(日本岛津公司);320?S 型pH 计(瑞士Mettler Toledo 公司);LS55型荧光分光光度计(美国Perkin Elmer 公司);JEM?100CXII 型透射电镜(日本电子株式会社)三双光子荧光光谱采用锁模飞秒钛蓝宝石激光器(美国Coherent 公司)为激发源;细胞的TPF 成像用LSM 710型双光子共聚焦激光显微镜(德国Zeiss 公司)观察三4?溴?1,8?萘酐(≥98.0%,鞍山市惠丰化工有限责任公司);PEI (平均分子量10000Da,阿拉丁试剂有限公司);3?(4,5?二甲基噻唑?2)?2,5?二苯基四氮唑溴盐(MTT,Sigma 公司),使用前用PBS 配成

5g /L 的溶液;高糖DMEM 培养基二胎牛血清及胰蛋白酶消化液(Hyclone 公司)三其它试剂均为市售分

析纯;实验用水均为超纯水三

2.2　荧光聚合物纳米粒(PTCN )的制备及表征2.2.1　PTCN 的制备　PTCN 纳米粒的合成路线图1所示

:图1　荧光聚合物纳米粒(PTCN)的合成线路

Fig.1　The process of synthesis of polymeric fluorescent namopatiocle (PTCN)4?溴?1,8?萘酐和过量甘氨酸于乙二醇单甲醚中在120℃加热搅拌反应,用薄层层析监测至反应完成三趁热过滤,滤液冷却后加入蒸馏水,静置过夜三次日将沉淀滤出,用无水乙醇重结晶得到产物4?氨基乙酸?N ?羧甲基?1,8?萘酰亚胺(TCN)三1H NMR (DMSO?d 6+D 2O,400MHz),δ(ppm):7.20(1H,Ar?H);7.75(1H,Ar?H);8.00(1H,Ar?H);8.23(1H,Ar?H);8.32(1H,Ar?H);4.70(2H,CH 2);4.73(2H,CH 2)三

0.41g TCN,0.345g N ?羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.576g 1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDAC)于10mL DMF 中室温下搅拌反应3h三将上述反应液缓慢滴加至含0.5g 聚乙烯亚胺的2mL 水溶液中,室温搅拌反应过夜三将反应液转入透析袋(截留分子量为3500Da)并于水中透析三常换水并用荧光光谱仪监测透析袋外溶液的荧光强度(激发和发射波长分别为443和536nm),直到透析液荧光强度为零后停止透析三冻干透析袋内液体得PTCN三冻干的PTCN 具有水溶性,溶于水中可制备1.0g /L 的储备溶液,于4℃保存三2.2.2　PTCN 的结构及形态表征　采用KBr 压片法测定IR 光谱三用水将纳米粒储备溶液稀释到适当浓度测定其紫外光谱三用乙醇溶解TCN 配制1.0g /L 的储备溶液,再用水稀释至不同浓度,在445nm 下测定吸光度并绘制标准曲线三根据PTCN 在445nm 处的吸光度和TCN 的标准曲线,利用文献[18]的方法计算荧光团的摩尔取代度三

将待测液滴在表面喷涂有Formar 膜的铜网上并进行负染,然后用滤纸吸去多余的溶剂,干燥后用

TEM 观察形态和粒径三2.3　荧光性能测试

配制磷酸盐缓冲溶液:20mmol /L Na 2HPO 4溶液与0.2mol /L HCl 或0.1mol /L NaOH 溶液混合,用pH 计测定至所需pH 值三荧光光谱测定:将PTCN 储备溶液用蒸馏水稀释为所需浓度的工作溶液三移取1.0mL 工作溶液于946第5期梁淑彩等:水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像

10.0mL比色管中,用水定容,测定单光子和双光子荧光光谱三

pH值对PTCN荧光性质的影响:移取PTCN工作溶液1.0mL加入到10.0mL比色管中,用不同pH值的缓冲溶液定容,荧光分光光度计测定荧光激发与发射光谱三

光稳定性研究:移取PTCN工作溶液1.0mL加入到10.0mL比色管中,用pH7.4的缓冲溶液定容,在激发波长443nm和发射波长536nm下,每隔0.06s测定一次荧光强度,观察2h内荧光强度的变化三

2.4　PTCN的细胞毒性检测

采用MTT方法考察PTCN的细胞毒性三Hela细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃,含5%CO2的培养箱中培育三将对数生长期的细胞配制成悬液,按每孔5000个细胞接种于96孔板中,培养过夜后,将培养液移出,换上含不同浓度纳米粒的培养液并置于培养箱中孵育24h或48h;然后加MTT溶液(5g/L,每孔20μL)继续培养4h;倒掉培养液,每孔加200μL DMSO,振摇5min,在570nm 波长下测量各孔的吸光度值三以不含纳米粒的细胞空白作对照,计算细胞成活率三

2.5　PTCN用于Hela细胞的双光子荧光成像

对数生长期的细胞接种于含有盖玻片的24孔培养板中,使细胞爬片生长;将接种好的细胞爬片用PBS清洗3次后,加入含有PTCN的培养基溶液染色2h;吸弃培养液,用PBS反复浸洗3次,再加入4%多聚甲醛固定细胞10min三取出染色后的玻片,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在双光子激光共聚焦荧光显微镜(800nm激发)下观察成像效果三

3　结果与讨论

3.1　PTCN的制备及表征

目前,荧光团共价键合的荧光聚合物纳米粒的制备常采用两步法,即先制备非荧光的聚合物纳米粒,然后再进行荧光标记三而本实验用水溶性良好的PEI作为基质材料,以含有两个羧基的萘酰亚胺荧光团与其结构中的氨基发生交联反应,生成水溶性的荧光聚合物纳米粒,未反应的荧光团通过透析除去三这种以荧光团作交联剂的策略可以同时进行纳米粒的形成与荧光标记,简化了合成路线三采用红外光谱二紫外光谱对PTCN的结构进行了表征三IR表明,PTCN在1635cm-1附近有明显的N H吸收峰,在1580cm-1处存在芳环的特征吸收峰三紫外光谱(图2)表明,在300~550nm的波长范围内,PEI无明显的吸收峰,TCN在352和445nm处有最大吸收峰,而PTCN在445nm波长处出现了最大吸收峰三由于游离的TCN已通过透析的方法除去,上述实验结果表明,萘酰亚胺荧光团已接到PEI链上三根据紫外光谱测定结果,算出TCN在PTCN中的摩尔取代度为8.8%三此结果说明,PEI中仅有部分氨基参与反应,生成的纳米粒中仍有大量氨基存在,有助于纳米粒的进一步修饰与应用三采用TEM观察了纳米粒的形态和粒径三从测试结果(图3)可以看出,PTCN具有球状结构,粒径

5~10nm三

　图2　PTCN,TCN及PEI的紫外?可见吸收光谱Fig.2　UV?vis spectra of PTCN,TCN and PEI c PTCN=0.3g/L,c TCN=0.03g/L,c PEI=0.2g/

L.　图3　PTCN的TEM成像Fig.3　TEM imaging of PTCN c PTCN=0.01g/L.

056 分析化学第42卷

3.2　PTCN 的荧光光谱

PTCN 的单二双光子荧光光谱如图4所示,以443nm 为激发波长,PTCN 在536nm 下有荧光发射三

TPF 光谱测定表明,在800nm 激发下,PTCN 在536nm 处也有荧光发射,这为其在TPF 成像中的应用提

供了条件三纳米粒的荧光发射波长大于500nm,可以有效避免生物体自发荧光(λ<500nm)的干扰三3.3　pH 和光照对PTCN 荧光的影响考察了PTCN 的荧光对pH 值和光照的敏感性三在pH 4.0~9.0的磷酸盐缓冲溶液中,PTCN

的荧　图4　PTCN 的单光子荧光光谱(c PTCN =0.01g /L)和双光子荧光光谱(c PTCN =0.5g /L)Fig.4　One?and two?photon fluorescence spectra of PTCN.The concentrations of PTCN for the detections were 0.01and 0.5g /L,respectively a.536nm 发射光下的激发光谱;b.443nm 激发光下的发射

光谱;c.800nm 激发光下的发射光谱三a.Excitation spectrum emitted at 536nm;b.Emission spectrum excited at 443nm;c.Emission spectrum excited at 800nm.光激发和发射波长没有明显位移,荧光强度也不随pH 值变化三在2h 内,对PTCN 测定1.2万次后,其荧光强度的变化在1%以内三实验表明,PTCN 有较

好的pH 稳定性和光稳定性三

3.4　细胞毒性测试理想的生物成像材料要求具有良好的生物相容

性三MTT 法检测材料的体外细胞毒性简单二快速,广

泛应用于生物医用材料的生物相容性研究[15]三图5显示了PTCN 与Hela 细胞共同孵育24h 和48h 后

细胞的存活率三从图5可见,纳米粒与细胞共同孵

育24h 后,当PTCN 浓度低于15mg /L 时,细胞存活

率均达到85%以上;浓度为20mg /L 时,细胞存活率

仍在80%以上三纳米粒与细胞共同孵育48h 后的细

胞成活率普遍低于前者,当PTCN 浓度低于

10mg /L 时,细胞存活率均达到85%以上;浓度为15mg /L 时,细胞存活率达到78%以上三结果表明,PTCN 纳米粒子在15mg /L 浓度以下及与细胞作用时间在

24h 以内时,生物相容性好,提高纳米粒浓度及延长其与细胞的接触时间,会使其细胞毒性增加三3.5　PTCN 用于Hela 细胞双光子荧光成像采用双光子共聚焦荧光显微镜观察了PTCN 在活细胞中的TPF 成像能力三

根据细胞毒性实验结　图5　PTCN 对Hela 细胞毒性的MTT 检测结果Fig.5　3,4,5?(Dimethylthiazol?2?yl)?2,5?diphenyltet?razolium bromide (MTT)assay of PTCN with Hela cells 24h;48h.

果,选择浓度为10mg /L 的PTCN 进行实验三PTCN

与Hela 细胞共孵育2h 后,洗去细胞表面附着的纳

米粒,在800nm 激光激发下观察细胞内的荧光,结

果如图6所示,PTCN 能染色Hela 细胞,显微镜下观

察细胞内有明显的绿色荧光信号,且荧光信号主要

集中在细胞浆区域,说明PTCN 可以用于细胞的TPF

成像三

4　结　论

本实验以含有两个羧基的萘酰亚胺衍生物TCN

为交联剂与PEI 中的氨基发生交联反应,得到了荧

光聚合物纳米粒三该纳米粒具有如下特点:(1)具有

水溶性,方便了其在生物体系应用;(2)荧光团以共价的方式固定于纳米粒中,避免了其泄漏,提高了纳米粒的稳定性;(3)发射波长较长,能有效地避免生物体自发荧光的干扰;(4)具有好的pH 和光稳定性;(5)能够进入细胞,并成功实现细胞的TPF 成像三这种在较长激发波长下进行的荧光成像,可以减少对细胞的损伤,提高成像质量;(6)纳米粒中存在可进行功能化修饰的氨基,在靶向性TPF 探针方面具有应用前景三

1

56第5期梁淑彩等:水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像

　图6　PTCN 的Hela 细胞TPF 成像三Hela 细胞与10mg /L 的PTCN 共同培育2h,然后用PBS 洗涤3次,再加入4%多聚甲醛固定后用于TPF 成像Fig.6　Two photon fluorescence (TPF)imaging of Hela cells stained with PTCN.Hela cells were incubated with PTCN (10mg /L)for 2h,and then washed three times with PBS prior to fixed with 4%paraformaldehyde for TPF imaging a.明场;b.800nm 激发下;c.a 与b 的叠加三a.Bright field;b.Excited at 800nm;c.Overlap of a and b.

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Preparation and Two?Photon Imaging of a Water?Soluble Fluorescent Nanoparticle

LIANG Shu?Cai 1,CHEN Xiao?Hui 2,LIU Yan?Bin 1,QIN Meng 2,YAN Guo?Ping *2

1

(College of Pharmacy ,Wuhan University ,Wuhan 430072,China )

2(School of Materials Science and Engineering ,Wuhan Institute of Technology ,Wuhan 430074,China )Abstract A water?soluble polymeric fluorescent nanoparticle (PTCN)has been proposed for two?photon fluorescence (TPF )imaging of living cells.PTCN was firstly prepared by chemical crosslinking of polyethyleneimine using a dual carboxyl 1,8?naphthalimide derivative as the crosslinker.Subsequently,the investigations on its structure,morphology,one?and two?photon fluorescence properties and cytotoxicity were carried out.It was found that PTCN was spherical with the diameters of 5-10nm.It could emit fluorescence at 536nm with the excitation wavelengths of 443nm and 800nm,respectively.PTCN possessed good pH stability and photostability.Its fluorescence did not change in the pH range of 4.0-9.0.In pH 7.4buffer solution,when it was detected at λex /λem =443nm /536nm for 12000times,the decrease in fluorescence intensity was less than 1%.Cytotoxic assays indicated it was low toxic upon interactions with Hela cells for 24h at a concentration of 15.0mg /L.Finally,the application of PTCN for imaging live cells was assessed by TPF microscopy technique.After Hela cells were incubated with PTCN for 2h,the green fluorescence was observed in the cellsap at the excitation wavelength of 800nm.The proposed nanoparticle is potential in the development of targeting TPF probes.Keywords Naphthalimide;Polyethyleneimine;Fluorescent polymeric nanoparticles;Two?photon imaging

(Received 14November 2013;accepted 12January 2014)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.20905059,20835004

)‘实用地质分析标准物质手册“(第二版汉英对照)

编者收集整理了当今地质分析所用的标准物质647个,按其特征和不同应用分成6个部分介绍,即元素整体分析标准物质二超细粒度标准物质二化学物相和元素形态分析标准物质二微区原位分析标准物质二同位素及地质年代学分析标准物质二有机污染物分析标准物质三为了适应不同的查找方式,手册中有4种表格提供查找(综合信息表二定值信息表二定值数据简表二特性量值索引)三

该书信息量大,是从事地质分析二环境监测二食品安全监督检验人员的重要工具书三

该书由王毅民二顾铁新二王晓红二高玉淑二K P Jochum 二W E G Müller 编著,地质出版社出版,定价100.00元三3

56第5期梁淑彩等:水溶性荧光聚合物纳米粒的制备及双光子成像

双光子探针原理

我今天讲解的文献题目是对生物组织中过氧化氢进行比率成像的一种双光子荧光探针。 背景知识：过氧化氢是活性氧族中的重要一员，活性氧族包括（超氧阴离子自由基、过氧氢自由基、羟基自由基、过氧自由基、单线态氧、次氯酸等）在生物组织的生理衰老及病理方面有着重要的作用。但是超过细胞正常水平的过氧化氢会引起DNA损伤、突变以及遗传的不稳定性。 1.与其他探针作比较：主要讲了采用硼酸盐机理保护的探针对过氧化氢具有较高的选择性，并在细胞中稳定成像，但是这些探针大多用于单光子显微镜并要求短波长激发，以上这些都限制了它在深入组织中的成像的应用。 与单光子探针比较。双光子显微镜比单光子显微镜具有穿透力强、定位激发以及延长观察时间等大量优点而在检测活细胞组织中的过氧化氢方面具有很好的应用前景。 2.探针设计要求：对过氧化氢高效的双光子探针应具有以下特点：在水溶液缓冲剂中具有足够大的溶解性、对过氧化氢具有较高的选择性、有较高的双光子活性横截面和在生物PH范围内有较稳定的光谱性质。 探针的合成：通过过氧萘引入含有硼酸基的氨基甲酸酯合成了AN1。与过氧化氢相连的硼酸盐与缺电子的氨基甲酸酯分离会得到富电的AN1，引起更多红移荧光散射。并在模拟生理环境下表征它的光学特性以及AN1的光学特性，而且PN1相对AN1发生了50nm的蓝移。AN1相对PN1有较大的位移是因为更稳定的电荷转移激发前荧光团的形态包括给电子基和吸电子基。 荧光性能测定：PN1与过氧化氢的反应主要通过发射荧光和液相色谱-质谱仪检测，产物AN1是主要的荧光物。 其他性能测定：1然后我们估测PN1在双光子模式下对过氧化氢的探测能力。 2PN1要比其他活性氧类对过氧化氢有更高的选择性。 2接下来力图利用PN1做双光子探针来检测细胞环境里过氧化氢含量的变化。 为了进一步建立PN1在生物成像领域的应用，我们也做了这个新探针在检测活的组织中过氧化氢含量变化的能力。 结论：最后我们得出结论，我们研究的这种新型双光子探针PN1具有大的荧光活性面、对过氧化氢有一个很明显的有蓝变绿的一个颜色变化过程、对活性氧类具有较好的选择性、低细胞毒性、对生物活性体内PH的变化不敏感等优点。这个新的探针可以对活细胞以及活组织中的过氧化氢深度范围成像而不受其他生物活性氧类的干扰。当前的努力主要是利用PN1以及对过氧化氢在复杂生物样本内的荧光成像化学过程的研究。

活体动物光学成像系统在活体荧光成像中的应用

活体动物光学成像系统在活体荧光成像中的应用 第一部分技术原理 一、技术简介 随着活体动物光学成像技术在国内外的普及和应用，越来越多的科研人员希望能通过该技术来观察活体动物体内肿瘤细胞的生长以及对药物治疗的反应，希望能观察到荧光标记的多肽、抗体、小分子药物在体内的分布和代谢情况。NightOWL ⅡLB 983 NC320活体动物光学成像系统正是为满足这样的应用需求而设计的。该系统通过荧光光路的特殊设计，实现了对激发光的能量控制和调节，提高了活体荧光成像的稳定性和灵敏度，并且该系统操作简单、费用低廉、不涉及放射性，是不错的进行活体荧光成像的仪器。与传统技术相比，活体荧光成像技术不需要杀死动物，可以对同一个动物进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的影响。更重要的是，该技术可以得到直观的成像图片，了解标记物在动物体内的分布和代谢情况，避免了传统的体外实验方法的诸多缺点，特别是在药物制剂学、药物临床前研究中有不可估量的应用前景。 NightOWL ⅡLB 983 NC320活体荧光体内成像技术的基本原理是激发光源通过特殊的光路设计使其能量稳定、强度合适的激发光使荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的散射光，该散射光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器cooling slow scaning CCD以光子数量化检测到光强度，同时反应出标记物的数量。 二、标记原理 活体荧光成像技术有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可

【CN209946009U】光学相干层析和双光子荧光同步成像系统【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920375721.9 (22)申请日 2019.03.22 (73)专利权人 中国科学院苏州生物医学工程技 术研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城 科灵路88号 (72)发明人 徐欣　高峰　张欣　金幸杰　 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 韩飞 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) (ESM)同样的发明创造已同日申请发明专利 (54)实用新型名称 光学相干层析和双光子荧光同步成像系统 (57)摘要 本实用新型公开了一种光学相干层析和双 光子荧光同步成像系统，包括双光子光源、快轴 扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫 描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光 子荧光成像模块以及成像显微物镜。本实用新型 的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，通 过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像 技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方 法有效减少了系统硬件，实现了光学相干层析技 术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用， 达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 209946009 U 2020.01.14 C N 209946009 U

权　利　要　求　书1/2页CN 209946009 U 1.一种光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜； 所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。 2.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。 3.根据权利要求2所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。 4.根据权利要求3所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。 5.根据权利要求4所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。 6.根据权利要求5所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置。 7.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析系统或者扫频源光学相干层析系统。 8.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。 9.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、 2

荧光成像的原理和方法

荧光成像的原理与方法 荧光成像在基因组学和蛋白质组学等生物学领域应用中的独特优势： 高灱敏度：灱敏度进超比色法，在大部分应用中其灱敏度近乎放射性同素。 多组样品一次成像：将不同样品（如：对照、处理）通过不同发射波长的荧光素标记（如 Cy3或 Cy5等）可以同时检测多样品荧光信号。 稳定性高：较放射性同位素相比，荧光素标记的抗体、杂交探针、PCR引物等的信号稳定性优势明显，可稳定存在数月以上，这使需要大规模标记并多阵列之间的标准化比较成为了可能。 低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护。易于运输和实验后处理，多数情况下实验成本低于放射性同位素。 商业可获得性：许多重要的荧光标记型生物大分子如各种单抗、多抗、CAT等及荧光标记用试剂盒都可以方便获得,同时一些公司提供荧光标记的外包服务。 荧光信号的产生及信号捕获原理： 荧光物质被特定外界能量激发（如激光等高能射线），引起其电子轨道向高能轨道跃迁， 并最终释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号。当然不是所有的物质都能被激发产生荧光，只有当该物质与激发光具有相同的频率并在吸收该能量后具有高的荧光效率而非将能量消耗于分子间碰撞过程中，其荧光信号才可被光学设备所检测（Fig.1）。 Fig.1 ①激发能②无辐射弛豫能③荧光发射能。三种荧光素（绿色：fluorescein；黄色：DNA-bound TOTO TM；红色：DNA-bound EB）的激发光波长(a)和发射光波长(b)。 荧光成像系统的组件和工作原理： 荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础，激光扫描系统的性能指标主要有：系统分辨率、线性范围、均一性、灱敏度。 为了实现荧光信号的激发、捕获和放大的检测过程，按照顺序荧光成像系统主要包括以下组件：激发源（Excitation resource）、激光传输组件（Light delivery optics）、荧光收集组件（Light collection optics）、发射滤镜（Emission filter）和信号检测放大组件（Detection and amplification）（Fig.2）。在荧光成像系统工作的过程中，每个组件的性能都关系着最终荧光信号的收集和检测结果。

双光子显微镜的独特优势.

相关技术指标与进口必要性 双光子显微镜的独特优势有以下几点： 1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。 2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。更加适合活体 下微弱荧光信号的观察。 3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。 4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。 主要技术指标： 1 显微镜 1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm； 1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式 对样品进行定位和观察； 1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm； 1.4 配备长寿命落射荧光光源； 1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块； 1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直

小动物活体成像技术

小动物活体成像技术 关键词：动物成像分子影像学光学成像2010-04-20 00:00来源：互联网点击次数：5089 1、背景和原理 1999年，美国哈佛大学Weissleder等人提出了分子影像学（molecular imaging）的概念——应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。 传统成像大多依赖于肉眼可见的身体、生理和代谢过程在疾病状态下的变化，而不是了解疾病的特异性分子事件。分子成像则是利用特异性分子探针追踪靶目标并成像。这种从非特异性成像到特异性成像的变化，为疾病生物学、疾病早期检测、定性、评估和治疗带来了重大的影响。 分子成像技术使活体动物体内成像成为可能，它的出现，归功于分子生物学和细胞生物学的发展、转基因动物模型的使用、新的成像药物的运用、高特异性的探针、小动物成像设备的发展等诸多因素。目前，分子成像技术可用于研究观测特异性细胞、基因和分子的表达或互作过程，同时检测多种分子事件，追踪靶细胞，药物和基因治疗最优化，从分子和细胞水平对药物疗效进行成像，从分子病理水平评估疾病发展过程，对同一个动物或病人进行时间、环境、发展和治疗影响跟踪。 2、分子成像的优点 分子成像和传统的体外成像或细胞培养相比有着显著优点。首先，分子成像能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。第二，由于可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的可影响，又不需要杀死模式动物，节省了大笔科研费用。第三，尤其在药物开发方面，分子成像更是具有划时代的意义。根据目前的统计结果，由于进入临床研究的药物中大部分因为安全问题而终止，导致了在临床研究中大量的资金浪费，而分子成像技术的问世，为解决这一难题提供了广阔的空间，将使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更详细的分子或基因述水平的数据，这是用传统的方法无法了解的领域，所以分子成像将对新药研究的模式带来革命性变革。其次，在转基因动物、动物基因打靶或制药研究过程中，分子成像能对动物的性状进行跟踪检测，对表型进行直接观测和（定量）分析； 3、分类 分子成像技术主要分为光学成像、核素成像、磁共振成像和超声成像、CT成像五大类。 (1) 光学成像 活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。

双光子荧光显微镜的原理特点

双光子荧光显微镜的原理特点 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理是： 在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。 双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。 这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。 为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。 1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限: 1)一是光毒性现象： 因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得

足够的信噪比; 而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。 在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器? 双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。 例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。 3.双光子显微镜的激光器有何特别之处? 双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。 因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。

双光子显微镜

双光子显微镜 https://www.wendangku.net/doc/3b13431072.html,/view/1428311.htm?fr=ala0_1 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新 技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题： 一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。

双光子荧光探针的研究进展

有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。

Xenics红外相机在第二近红外小动物活体荧光成像方面的应用-4

Xenics液氮制冷相机在第二近红外小动物活体荧光成像方面的应用 1、应用背景介绍 癌症作为四大不治症之一，一直以来都是全球各国希望攻克的难题。World Cancer2014报告指出：全球范围内每年癌症新增病例高达1400万，死亡病例高达820万，而2010年全球在癌症上投入的资金为1.16万亿美金，为全球生产总值的2%。 影像方法一直以来都是癌症研究、药物开发，以及一般医疗行业重要的辅助研究手段；传统的获取影像的方法主要包括X-Ray成像、可见光成像以及核磁成像。X-Ray 成像主要是通过X光探测器来探测穿透人体组织后的X光影像，主要包括DR、CT、PET 等设备，但是X光成像由于有辐射，对人体有伤害，且这些成像技术的空间分辨率有限，很难实现微小病灶的早期检测，进而影响早期治疗。同样，由于这些设备的时间分辨率有限，不适合外科医生长期手术使用；可见光成像主要通过探测400nm—700nm范围内的可见光来获取影像信息，但是可见光无法获得被探测人和物内部的信息；MRI也是医疗行业一个有力的手段，但是MRI设备拍摄时间长、费用昂贵，无法在术中使用。 图1：CT、PET探测设备 基于上述背景，越来越多的生命科学工作者开始了其他影像方法对癌症检测价值的研究。近红外成像由于能够获得更高的空间分辨率和更高的时间分辨率，获得了越来越多研究者的喜爱。同时，由于更深的探测深度，以斯坦福大学为首的众多科研院所和高

校开始了第二近红外成像的研究。 图2：红外成像探测深度VS 可见光成像探测深度 2、第二近红外荧光成像研究原理 近红外成像，由于时空分辨率都比Micro-CT和PET高，又没有辐射，同时可以在手术中使用等，被广泛研究。近红外成像主要分为第1近红外（0.75um—0.9um）成像和第2近红外（1.1um--1.4um）成像，而第2近红外成像由于可以获得更深的探测深度（1 - 3毫米），更高的空间分辨率（~ 30毫米），更高的时间分辨率（< 200 ms 每帧），更受期待。 图3：可见光成像、红外成像，以及可见光和红外成像融合图 小动物体内的荧光基团，在激光的照射下，会辐射出比激发光波长更长的光子信号，辐射出来的光子穿透组织到达体表，被能够探测到900nm-1700nm近红外谱段的InGaAs材料的液氮制冷相机获取并成像，通过对荧光信息成像的分析，进而获取小动物体内血管、肿瘤等信息；

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

1.设备名称 双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜 2.数量 1套 3.设备用途说明 4.工作条件 电源220V±10%，50HZ 室温：20~25℃ 其他：防尘，除湿，抗震动 工作台：牢固，稳定，防震 5.规格、技术要求及参数 5.1 双光子飞秒激光器部分 5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW 5.1.2HeNe激光：543nm，1mW 5.1.3HeNe激光：633nm，5mW 5.1.4405激光：405nm，30mW 5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能 5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。 5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5 微秒。AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。 5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。 5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。 5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。 5.2扫描器 1

5.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设 计，一体化像差及色差校正。 5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。 5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。 5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。 5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。 5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检 测器。 5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和 1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果） 5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪 器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。 5.2.9一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。 5.2.10*两个独立的电动的10位滤光片转轮，通过滤光片导入激发光、透过荧光并阻 断从样品反射回的激光，可提供多至50种激发光波长组合。其中一个转轮可由用户自由更换滤光片，满足系统升级扩展的需要。 5.2.11可对荧光光谱进行分析，拆分光谱重叠的不同标记的信号，可以解决同时使用 多种荧光标记时，如GFP/YFP双标记，激发光或发射光波长重叠造成的串色问题。 5.2.12具有实时计算机系统（Real time computer ）监控扫描过程、同步及数据采 集，可选择使用16位、12位和8位A/D转换的动态范围。 5.2.13采用X、Y轴独立的双镜扫描，扫描为线性扫描。 5.2.14*扫描分辨率：可以在4 x 1至6144 x 6144之间自由选择。所有通道同时使 1

小动物活体成像技术_浙江大学汇总

小动物活体成像技术 李冬梅万春丽李继承 摘要：随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。本文围绕五种小动物成像专用设备，综述其特点及主要应用，比较各种设备的优势和劣势，总结小动物活体成像设备的发展趋势。 关键词：小动物；活体；成像技术 Small living animal imaging technology LI Dong-Mei1 WAN Chun-li 2 LI Ji-Cheng 1 （1Medical college of Zhejiang university，2Shanghai sciencelight biology sci&tech Co.,Ltd.）Abstract: With the development of small animal imaging technology, non-invasive imaging in small living animal models has gained increasing importance in pre-clinical research. Based on five kinds of small animal imaging special equipments, this article reviews their characteristics and illustrates their main applications. Meanwhile, this article also compares the advantages and limitations of these equipments and summarizes the trends of small living animal imaging equipments. Key words: small animal;living; imaging technology 动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施，同时大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物由于诸多优势在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域应用日益增多。近年来各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。 动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。动物活体成像技术主要分为光学成像(optical imaging)、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、计算机断层摄影（computed tomography，CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。 活体成像技术是在不损伤动物的前提下对其进行长期纵向研究的技术之一。成像技术可以提供的数据有绝对定量和相对定量两种。在样本中位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI和PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范畴，但可以通过严格设计实验来定量[1]。其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI介于两者之间。 1 可见光成像 体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术[2]。生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号；而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP）或荧光染料（包括荧光量子点）等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发[3]。 1.1 生物发光：哺乳动物生物发光，一般是将萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达[4]。标记后的荧光素酶

在活体成像中荧光色素标记细胞的方法举例

本实验技术来源于SciMall科学在线 在活体成像中荧光色素标记细胞的方法举例 活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluores cence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RF P, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。 该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。 但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health 等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代 下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，以供参考。 一、用荧光色素DiD标记间充质干细胞 1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液； 2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记； 3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS，钙镁离子会影响胰蛋白

金纳米棒用于双光子荧光成像

金纳米棒用于双光子荧光成像 2016-04-18 12:31来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部 金纳米棒受激发后光物理过程 对活体生物组织的实时成像是人们一直追求的目标。实现活体成像的一个难点是如何提高深层组织的检测信号强度。由于一般激光和发射光很难透过组织，自身背景荧光的干扰及光在体内组织上的散射等因素都会降低活体深层组织成像的灵敏度，而加大激发光的强度又会对生物体产生伤害。因此，具有在近红外区光学性质可调控的金纳米棒可以在一定程度上解决这一问题。 新型荧光成像技术探索的道路上面临着两个难题：一是细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是对所研究分子很难进行长期荧光标记观察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。 目前，双光子激发有以下优点： (1) 由于用近红外光激发，所需能量低于破坏活体细胞能量阀值几个数量级，对活细胞的损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小； (2) 在组织中由于600～900 nm近红外光比可见光的透过率高，可达几个厘米，因此可观察样品中更深层的荧光像, 能够进行体外或在体内的非破坏、非介入性分析； (3) 许多原本只能在可见区甚至是紫外区使用的荧光探测试剂也可以应用在近红外区域。 (4) TPL信号能很好的与组织自发荧光区分。 Boyd等人最早于1986年报道了金纳米结构的双光子荧光性质(TPL)，但金膜的光电发射效率很低。金纳米棒在受到激光脉冲激发后能发出强烈的TPL, 特别适合做基于TPL的成像试剂。图为金纳米棒受激发后光物理示意图。近红外激光照射金纳米棒，诱导纵向等离子体共振激发，导致大部分光被吸收，少量散射。吸收双光子后，d轨道电子跃迁到sp轨道，形成空穴-电子对，空穴和电子分别再结合后发出双光子荧光。发热也是由电子振荡造成的。

多功能荧光成像仪

多功能荧光成像仪 一、技术参数 1.设备用途： 采集化学发光（chemiluminescence）、比色（colorimetric）、荧光（fluorescence）及Stain-Free免染成像等核酸凝胶、蛋白凝胶、印迹膜等的数字图像，并对获得的图像进行数据分析。 2.技术规格： 2.1硬件功能 *2.1.1:功能涵盖：化学发光，光密度成像，荧光成像，Stain-Free免染成像等， 2.1.2：CCD检测器：增强型超冷CCD检测器，分辨率6.1M pixel（2,758x2,208） 2.1.3:12.1英寸触摸屏控制，支持多点触控功能（2点） 2.1.4:425nm处绝对Q/E（光电转化率）值：70％，绝对Q/E峰值：75%@525nm 2.1.5:CCD暗电流：0.002 e/p/s；CCD读出噪音：6 e-rms，提供弱光成像所 需 2.1.6:使用f/0.95快速对焦镜头，提高进光量的同时完成自动聚焦 2.1.7:自动优化曝光功能，所有成像过程均保持自动对焦 2.1.8:16bit数据采集（65,536灰度级，4.8OD），所有样品动力学范围>4个 数量级 2.1.9智能样品托盘技术，自动识别插入的样品盘类型，选择成像功能 2.1.10三种样品托盘设计：Chemi/UV/Stain-Free样品盘（化学发光、紫外和 免染样品成像）；白光样品盘（将透射紫外转换为透射白光，考染、银染及其他蛋白成像）；蓝光样品盘（SYBR?等荧光染料） 2.1.11:光源：反射白光，透射紫外，透射白光（可选），透射蓝光（可选） 2.1.12:滤光片转轮位置：8位（5色荧光、标准滤光片、平场校正、化学发 光） 2.1.13:紫外光源：302nm *2.1.14:最大成像面积16.8 x 21 cm

小动物活体成像技术的原理及操作方法

活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因（Luciferase）标记细胞或DNA，而荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和FITC、Cy5、C

2. 生物发光成像 活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。 生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560 nm(460—630 nm)，这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600 nm的红光虽然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。 生物发光成像的优点可以非侵入性，实时连续动态监测体内的各种生物学过程，从而可以减少实验动物数量，及降低个体间差异的影响；由于背景噪声低，所以具有较高的敏感性；不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察；此外还有无放射性等其他优点。 然而生物发光也有自身的不足之处：例如波长依赖性的组织穿透能力，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性也不尽相同，其中血红蛋白是吸收光子的主要物质；由于是在体外检测体内发出的信号，因而受到体内发光源位置及深度影响；另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物，且底物在体内的分布与药动力学也会影响信号的产生；由于荧光素酶催化的生化反应需要氧气、镁离子及ATP等物质的参与，受到体内环境状态的影响。 二、小动物活体成像 1. 制作动物模型 可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。在建模时应认真考虑实验目的和选择荧光标记，如标记荧光波长短，则穿透效率不高，建模时不宜接种深部脏器和观察体内转移，但可以观察皮下瘤和解剖后脏器直接成像。深部脏器和体内转移的观察大多选用荧光素酶标记。 2. 活体成像 小鼠经过常规麻醉（气麻、针麻皆可）后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯（明场）拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下（暗场）拍摄由小鼠体内发出的特异光子。明场与暗场的背景图叠加后可以直观的显示动物体内特异光子的部位和强度，完成成像操作。值得注意的是荧光成像应选择合适的激发和发射滤片，生物发光则需要成像前体内注射底物激发发光。

FMT小动物活体荧光断层成像技术的特点及优势

FMT 小动物活体荧光断层成像技术的特点及优势 小动物活体光学成像技术已出现近10年时间，并已被应用于生物及医学研究的诸多领域。然而，随着各项研究的深入，传统的小动物活体成像系统已在诸多方面无法满足研究的需求，主要表现于：1、无法实现深层信号的观测；2、无法进行绝对精确定量；3、无法获取真实的3D 重建信息；4、无法与其它分子成像系统（如CT 、PET 、MRI 等）进行联合使用；5、无法应用于临床研究。Perkinelmer 公司全新推出的FMT （Fluorescence Molecular Tomography ）小动物活体荧光断层成像技术是小动物活体成像领域的新一代技术，该技术由哈佛大学医学院分子影像中心历经10年时间而研发成熟，是对现有活体光学成像技术的革新与完善，与现有技术相比，FMT 成像技术的主要特点及优势如下： 1. 真正的绝对精确定量 现有活体光学成像系统的技术瓶颈之一是定量问题，目前所有成像系统的定量方法都是基于对小动物体表发光强度的测定，以体表发光强度来量化研究对象（如左下图），然而，分子影像学中对于定量的详细定义为“Molecular imaging quantification is the determination of regional concentrations of molecular imaging agents and biological parameters.” (MICoE and SNM Boards, The Journal of Nuclear Medicine. V ol. 48, No. 6, June 2007)，因此给出标记探针在体内的浓度、体积等具体参数才是真正意义上的绝对定量。FMT 应用其专利的荧光分子断层技术对体内信号进行探测及定量分析，最终的定量结果以探针浓度表示，并可精确量化至皮摩尔级别（如右下图），因此是真正意义上的绝对精确定量。 另外，现有技术的定量算法均是基于小鼠体内组织为均质模型而建立。这一方面导致数据的非真实性，因为在真实小鼠体内各种组织并非均质，不同组织对于可见光的发散和吸收程度均不相同（如左下图），在定量运算时，如果不考虑这些因素，则结果将于实际情况出现很大偏差；另一方面，如果不考虑以上因素，那么对于不同深度位置的信号定量将无法进行，因为对于同一深度的信号，小鼠体位摆放不同将导致不同的体表定量结果。而FMT 的 体表光强 浓度信息 传统技术采用体表光强作为定量单位，为相对定量；