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柱层析的操作步骤和注意事项

柱层析技术

常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相

的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望

能有所帮助。

柱子可以分为:加压,常压,减压。

压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所

以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分

离,一个柱子几个月也是有的。

减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过

硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝聚),以及有些比较易分解的东西可能得

不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过

减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念

头了。

加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力

的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。非凡是在轻易分解

的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得

加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。

柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是

样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想假如柱子十厘米,而样品就有二

厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而假如样品层只

有0.5厘米,那么各组分就比较轻易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多

的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,

不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。

现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选

择要具体分析。假如所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质

相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×20cm 的柱子

);假如相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm 的,也

可以减小淋洗剂的极性等等。

关于无水无氧柱,适用于对氧,水敏感,易分解的产品。

可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅

胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,究竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。也

是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是

加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,假如样品是显

色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。假如样品无色,只好预备几十

个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。像我以

前过一根无水无氧柱,需要六个schlenk,现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,

很轻易是样品分解,非凡是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中

性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些。

听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一

照就知道产品在哪里了,没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。

--

※ 关于湿法、干法上样。

湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好

,不然溶剂就成了淋洗剂了。

很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出,这一

般都是比较大量的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和,而样品本身又是比较

好的固体才会发生,这就应该先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,假如不能重结晶

那就不管它了,直接过就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解的。

有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF,DMSO等,会随着溶剂

一起走,

显色是一个很长的脱尾),这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1:

1,我觉得是越少越好,但是要保证在旋干后,不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样

品没有吸附在硅胶上)。

溶剂的选择。

当然是最便宜,最安全,最环保的了。所以大多选用石油醚,乙酸乙酯。文献中有写用

正己烷的,太贵了,除非非凡需要不要用不然银子哗哗的,流的比淋洗剂还快,不过因

为极性很小,有时还是非它不可。乙醚也可以用,但是就是轻易睡觉,注重保持清醒别

让溶剂流干了,那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅胶的吸

附是一个放热过程,所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷的时候会好一些

。甲醇,据说能溶解部分的硅胶,所以产品假如想过元素分析的话要留神,应该经过后

继处理,比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少,要依个人的不同需要选择了。

由于某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛),我们这里是用10升或25升的塑

料桶装的,就要注重这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色

的杂质,其他的杂质就可想而知了,所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过

原料时就可以免去这一步了,反正下面还有提纯的方法。

另外溶剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点

是要消耗一定的人工。这里要注重的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和

乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋

洗时比较合适,正好极性越来越大了。在过完柱子后,溶剂最后回收要采用常压,因为

在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来,常压时就会减少这种现象,假如杂质和

你下面要过的样品有反应那就惨了。

关于操作问题。

1 装柱。

柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可以采用四氟节

门的。

干法和湿法装柱觉得没什么区别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧

密(太密了淋洗剂走的太慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写

的都是不能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响,一加压气泡就

全下来了。当然假如你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是

开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,甚至作废!

2 加样。

用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的活塞打开,待溶剂层下降至石英砂面时,再

加少量的低极性溶剂,然后俅蚩 钊 绱肆饺 危 话闶 ⑸熬突 臼前咨 牧恕?

加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2~4cm 就够了)

,再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。

3 淋洗剂的选择。

感觉上要使所需点在rf0.2~0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开,过

柱子就用那种极性,假如rf在0.6,即使相差0.2也不轻易在柱子上分开,因为柱子是一

个多次爬板的状态,可以通过公式的比较:0.6/0.8一次的分离度,肯定不如(0.2/0.3

)的三次方或四次方大。

4 样品的收集。

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以假如样品与硅胶的吸附比

较强的话,就不轻易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以

采用氧化铝作固定相。

另外,收集的试管大小要以样品量而定,非凡是小量样品,假如用大试管,可能一根就

收到了三个样品,wuwu。假如都用小试管那工作量又太大。

5 最后的处理。

柱分后的产品,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会累积到产品中,所以假如想送

分析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗基本就没

了,必要时进行重结晶。

另外,再过柱的时候,有时会出现气泡,一是

和使用的溶剂有关,假如是易挥发的溶剂,如乙醚、二氯甲烷等,在

室温稍高的情况下,很轻易出现这种现象,因此,在室温高的时候,

可以选择沸点较高,挥发相对小的溶剂。还有,使用混合溶剂时,使用

的两种溶剂的沸点应该相差不大,如:乙酸乙酯和石油醚(60~90),而

乙醚却要选择30-60的石油醚。二是:不论是用带砂板的还是塞棉花的,在装柱之前,都要将空气用加压的方法将空气排干,这样就可避免柱中有空气!过柱子需要耐心,不要着急.

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