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牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立

牛乳铁蛋白直接竞争ELISA 检测法的建立

冯挺财,邵谱,胡珩,杨正涛*,张乃生

(吉林大学畜牧兽医学院动物营养与中毒病研究室,吉林长春130062)

摘要 [目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(L F )含量的竞争E L ISA 检测方法。[方法]制备鼠抗牛L F 单克隆抗体,采用直接竞争E L ISA 测定酶标记物效价,建立牛L F 的直接竞争E L ISA 检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛L F 单抗效价达1∶1280000,且鉴定为IgG 1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/m l 和1∶40000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH 值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2h 的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25～1000n g/m l 浓度范围内,牛乳铁蛋白的lo g it (B /B 0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y =-1.8991x +5.0433(R 2

=0.9873)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛L F 检测试剂盒奠定基础。关键词牛乳铁蛋白;cE L ISA;定量检测

中图分类号 S823.8 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)18-07650-03

E s tab lishm e n t o f D ire c t C om pe t it iv e ELISA fo r D e te c t in g B o v in e La c to fe rrin FENG T in g -c a i e t a l (L abo ra tory o f A n i m a l N u tr ition an d N o so tox ico sis ,C o llege o f A n i m a l S cien ce an d V e te r in ary o f J ilin U n ive rsity ,C h an gch un,J ili n 130062)A b s tra c t [O b je ctive]T h e re sea rch a i m ed to e stab lish a k in d o f com pe titive E L ISA m e th od fo r de te cti n g th e con ten t o f bov in e lacto fe r rin (L f ).[M e th od]R a t an ti-bov in e L

F m on oclon a l an tibody w as prepa red an d th e titer o f en zym e m a rk e rs w e re de te rm in ed by u s in g d irect com pe titiv e E L ISA.A nd a d irect co m pe titive E L ISA fo r de tectin g bov in e L F w a s e stab lish ed .[R esu lt]A fte r pu r ifica tion,th e tite r o f th e prepa red ra t an ti-bov in e L F m on oclon a l an tibody reach ed 1∶1280000an d it w as ifden tified a s Ig

G 1.T h e m on oc lon a l an tibody h ad s tron ge r specificity to bov in e L F.T h e tite r o f th e p repa red en -zym e -labe lled m on o clon a l an ti body w as 1∶640000.T h e op ti m um w o rk i n g con cn.o f an tigen co a tin g sub stan ce an d en zym e -labe lled m on oclon a l an tibody w e re 1.0u g/m l an d 1:40000re sp.T h e e ffect o f u sin g co a ti n g an tigen w ith ca rbon a te bu ffe r w ith pHva lu e o f 9.6to stay ove r a n igh t a t 4℃first andth en lay a t 37℃fo r 2h w a s be st .T h e e ffect o f u s i n g 2%bov in e se ruma l bum inas sea lan t w a s be st .Inth e co cn.ran ge o f 31.25～1000n g/m l ,log it(B /B 0)o f bov in e L F sh ow ed a sign ifican t li n e a r re la tion sh i p w ith th e loga r ithmva l u e o f bov in e L F con cn.an d its reg re ss ion equ a tion w a s y =-1.8991x +5.0433(R 2=0.9873).[C on clu s ion]T h is re se archla i dth e fou n da tionfo r deve lopin g bov in e L F de te ction k it u sed fo r th e m as titis diagn os is o f da iry ca t-tle.K e y w o rd s B ov in e la cto fe rr in ;D irect com pe titive E L ISA ;Q u an tita tiv e de tection

基金项目国家自然基金(CO 2030603)资助。

作者简介冯挺财(1982-),男,江西万载人,硕士研究生,研究方向:

兽医内科学。*通讯作者,讲师。

收稿日期 2008-03-31

牛乳铁蛋白(B ov ine L actoferr in ,B L f)是一种相对分子质量约为80000D 的铁结合性糖蛋白,主要存在于哺乳动物的乳汁、眼泪、唾液等各种外分泌物中。L F 具有增强铁的传递和吸收,广谱的抗菌性,免疫调节作用,抗氧化作用,促进肠道菌群的平衡,作为生长因子,抗炎症、抗病毒、抗癌症作用等多种独特的生物学功能。当机体发生炎症、感染病毒或者有其他变化时,体内LF 含量随之发生变化,因此,可通过检测体内LF 含量达到诊断疾病的目的。目前通常采用的检测乳铁蛋白(L a cto ferrin ,LF)的方法有高效液相色谱法、免疫扩散法、分光光度法、电泳法、放射免疫测定以及酶联免疫吸附试验(E L IS A)等,其中E L ISA 检测方法具有灵敏度高、最小检测限低的优点,且一次能处理多个样本。直接竞争E L ISA 是一种较为灵敏的检测抗原的方法,使用该方法只需一种结合有标记物的抗体,笔者以吉林大学畜牧兽医学院动物营养与中毒病实验室制备的鼠抗牛L F 细胞株为基础,建立LF 的直接竞争E L ISA 检测方法,旨在为相关研究提供试验依据。1 材料与方法1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备。高速离心机、精密电子天平、磁力搅拌器、pH 计、冷冻干燥机(AL PH L 1-4)、酶标仪为美国B io -T EK 产品,型号为E LX 800,96孔可拆及不可拆酶标板均为cos ta r 公司产品,酶标仪为美国B io-TE K 产品,型号为E LX 800,电子天平为SH I M AD ZU (日本)产品,P ro tein G 层析柱(通用集团生产)。

1.1.2 试验动物。6～8周龄雄性B a bL/C 小鼠,购自长春生物制品研究所。

1.1.3 主要试剂。标准牛乳铁蛋白(la cto fe rrin ,L F)(s igm a),辣根过氧化物酶(H R P)(s igm a),T w een-20(P rom eg e),鼠抗牛LF 单克隆抗体(吉林大学畜牧兽医学院动物营养与中毒病实验室自制),B SA (北京鼎国公司),TM B (s igm a),其他试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂,试验用水为去离子水。1.2 方法

1.2.1 单抗的制备及生物学性能鉴定。腹水的制备参考文献[1]。按照P ro te in G 层析柱说明书进行腹水的纯化操作。以最佳抗原包被浓度包被酶标板,间接E L ISA 方法测定纯化后的M c A b 效价。以纯化后M c A b 包被酶标板,按照亚类鉴定试剂盒的操作说明进行操作,鉴定M c A b 的亚类。取乳中其他几种主要蛋白质:酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白,用间接竞争E L ISA 法测定单抗与这些蛋白的特异性。抗体M cA b 的特异性以交叉反应率来表示,即抑制抗体与固相化抗原结合达50%时,标准品所需克分子数与上述几种蛋白所需克分子数之比。

1.2.2 酶标单抗的制备及性能鉴定。酶标单抗的制备参考文献[2](简易过碘酸钠法),直接E L ISA 测定酶标记物效价并用紫外分光光度仪测定其OD 280nm 及OD 403nm 值,按以下公式计算克分子比值:

克分子比值=

酶量(m g/m l)40000÷IgG 量(m g /m l)160000=酶量

IgG 量

×4

1.2.3 直接竞争E L IS A 的反应程序。

(1)抗原包被。用包被稀释液对检测抗原进行稀释,每孔加入200μl ,置4℃冰箱过夜。

(2)封闭。封闭液每孔280μl ,37℃水浴2h 。

安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i .S c i .2008,36(18):7650-7652,7761 责任编辑张杨林责任校对卢瑶

(3)洗涤。洗涤液300μl/孔,每次3m in,洗3次。加入一定浓度的待检样品(或牛乳铁蛋白标准品)100μl及一定稀释

度的酶标单克隆抗体100μl,混匀后湿盒37℃作用1h。

(4)洗涤。同前。加底物TM B-H2O2。200μl/孔,37℃避光反应15m in。

(5)终止反应。加入浓度2m o l/L H2SO450μl/孔。用酶联仪读出OD450nm值。

1.2.4 抗原最佳包被浓度及酶标单抗最佳工作浓度的确定。采用棋盘方阵滴定法,同时确定包被抗原和酶标抗体的最适工作浓度,具体方法如下:以pH值9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原分别稀释为2.50、2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.75、0.50μg/m l,200μl/孔包被酶标板,4℃过夜。洗涤后封闭液封闭2h。洗涤后加入稀释倍数分别为20000、40000、80000、120000、160000、200000、250000倍的酶标抗体,200μl/孔,37℃温育1h。洗涤后加底物显色,终止反应,测定OD450nm值。选取OD450nm值最接近2.0的孔所对应的抗体包被浓度和酶标抗体浓度为最适包被抗体和酶标抗体的工作浓度。

1.2.5 抗原包被条件的确定。以最适抗原包被浓度包被酶标板,分别用磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)、T ris盐缓冲液(pH 值为7.4)、碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)、柠檬酸盐缓冲液(pH 值为5.0)作包被液分成4组,每组再分别按包被时间分为以下6组:①37℃包被2h,4℃包被过夜;②4℃包被过夜;③4℃包被过夜,37℃包被2h;④37℃包被1h;⑤37℃包被2h;

⑥37℃包被3h。按直接E L ISA步骤操作,比较各组阴阳性对照孔OD

450nm

值和P/N值,以确定最佳包被条件。

1.2.6 封闭剂的确定。以最适单抗包被浓度和最佳包被条件包被酶标板,洗涤后,分别用山羊血清、兔血清、牛血清白蛋白、明胶的不同浓度溶液作封闭剂,同时分别设0μg/m l抗原包被空白对照孔,均为37℃反应2h,按直接E L ISA步骤操

作,比较各组的OD

450nm

值和P/N值,以选择合适的封闭液。

1.2.7 标准曲线的制作。以试验所得的抗原最佳包被浓

度、最佳包被条件、最佳封闭液及封闭时间、最佳酶标抗体工作浓度进行直接竞争E L ISA,制作标准曲线。标准曲线以系列稀释浓度的B L f标准液建立测定梯度,并以各浓度(包括0 n g/m l)的OD450nm值转换成L og it(B/B0)值,其中无B L f抑制时的OD450nm值为B0,各相应浓度的B L f抑制时的OD450nm值为B,L og it(B/B0)=Ln[(B/B0)/(1-B/B0)]。因为L og it (B/B0)值与L g[B L f]成线性回归关系,从而可以计算回归曲线的方程和相关系数。

1.2.8 精确度分析。用批间差异和批内差异来表示该检测方法的精确度。批内误差:每一标准样品浓度作4次重复,以其批内变异系数表示批内误差。批间误差:重复制作标准曲线,连续4次,以其批间变异系数表示批间误差。

2结果与分析

2.1单抗的生物学性能鉴定结果间接E L ISA法测得纯化后单抗的效价达1∶1280000;亚类鉴定结果为IgG1;单抗特异性结果表明,如果以单抗对B L f的交叉反应率为100%,该单抗与酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白(B SA)的交叉反应率都小于0.01%,说明该单抗的特异性很好,这样可保证对样品中B L f测定结果的可靠性。

2.2 酶标单抗的制备及性能鉴定结果参照参考文献[2]制得酶标单抗2.0m l,直接E L ISA法测得其效价为1∶640000, 100倍稀释后紫外分光光度仪测得其OD280nm及OD403nm值分别为0.0606、0.0343。

酶量(m g/m l)=OD403nm×0.43×稀释倍数=1.475m g/m l IgG量(m g/m l)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62×稀释倍数=3.119m g/m l。

根据公式计算得克分子比值为1.89。

2.3抗原最佳包被浓度及单抗最佳工作浓度试验结果表明,抗原包被物的最适工作浓度为1.0μg/m l,酶标单抗的最适工作浓度为1∶40000。

2.4抗原包被条件表1表明,抗原以碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被,先4℃过夜,再37℃放置2h的效果最好。

表1 不同包被缓冲液及不同包被条件下的P/N值

T a b le1 T h e re s u lt s o f P/N v a lu e in d iffe re n t c o a t in g bu ffe r so lu t io n s un d e r d iffe re n t c o a t in g c o n d it ion s

包被缓冲液

C o a tin g bu ffe r so lu tion s

37℃包被2h,

4℃包被过夜

C o a tin g fo r2h a t37℃,

co a tin g o ve rn igh t a t4℃

4℃包被过夜

C oa tin g

ov e rn igh t a t4℃

4℃包被过夜,

37℃包被2h

C oa tin g o ve rn igh t a t4℃,

co a t in g fo r2h a t37℃

37℃包被1h

C o a t in g fo r

1h a t37℃

37℃包被2h

C oa tin gfo r

2ha t37℃

37℃包被3h

C oa tin gfo r

3h a t37℃

磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)9.08.59.87.28.89.2 P h o sph a te bu ffe r(pHva lu e o f7.4)

T ris盐缓冲液(pH值为7.4)12.511.313.89.511.612.4 T ris bu ffe r(pHv a lu e o f7.4)

碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)16.715.818.515.116.817.0 C a rbo n a te bu ffe r(pHv a lu e o f9.6)

柠檬酸盐缓冲液(pH值为5.0)8.97.89.07.68.18.6 C itra te bu f fe r(pHv a lu e o f5.0)

2.5封闭剂的确定结果表2表明,综合考虑标准品OD450nm、空白对照OD450nm及P/N值,浓度2%的牛血清白蛋白的用作该试验的封闭剂效果最好。

2.6 标准曲线的制作结果表3及图1表明,B L f在31.25～1000ng/m l范围内,L og it(B/B0)与B L f浓度的对数值呈显著

的线性关系,回归方程为y=-1.8991x+5.0433,相关系数R2=0.9873。用B0-2SD外推法[3],从标准曲线上查得检测的灵敏度为4.72ng/m l。

2.7精确度

(1)批内误差。以标准曲线的批内变异系数(CV)表示。

567

36卷18期冯挺财等牛乳铁蛋白直接竞争E L IS A检测法的建立

CV=SD的平均值/平均批内结合率×100%=1.70/69.33×100%=2.45%(表4)。

表2 不同封闭剂的效果

T a b le2 T h e re su lt s o f d iffe re n t s e a la n t s

封闭剂S e a la n t

浓度∥%

C o n cen tra tion

标准品S ta n da rd

O D450nm

空白C K

OD450nm

P/N值

P/Nv a lu e

明胶G e la tin0.50.9590.07812.290

1.00.9020.0741

2.180

2.00.9060.07212.580

牛血清白蛋白 1.00.9890.06116.210

B o v in e se rum 2.0 1.0110.05717.740

a lbum in 5.00.9810.06016.350

山羊血清 1.00.9040.07112.730

G o a t se rum 3.00.8780.07411.860

5.00.9150.07512.200

兔血清 1.00.8840.08011.050

R a bb it se rum 3.00.8960.08111.060

5.00.8470.07910.720

表3 B L f cE LISA结果

T ab le3 R e su lts o f cEL ISAfo r B L f

[B L f]∥n g/m l L g[B L f]OD450nm B/B0∥%L o g it(B/B0)

2000.00 3.300.52526.370.358

1000.00 3.000.67633.950.514

500.00 2.700.85442.890.751

250.00 2.40 1.18159.32 1.457

125.00 2.10 1.45773.18 2.729

62.50 1.80 1.70185.43 5.863

31.25 1.49 1.80290.519.540

0 1.00 1.991100.00 1.000

(2)批间误差。以4次测定的结合率进行平均,求出各浓度的批间变异系数,再平均求其总的批间变异系数(CV)(表4)。4次测定结果中各浓度的批间变异系数在2.31%～

5.93%,平均为3.71%。

由批内和批间误差可知

,该法重复性好。

图1 牛乳铁蛋白直接竞争E LISA的标准曲线

F ig.1 S tan d a rd c u rv e fo r th e d e te c t io n o f BL f b y d ire c t c om p e t it iv e

E L ISA

3讨论

(1)奶牛乳腺炎是奶牛乳腺发生的一种炎症,是影响乳牛业发展最严重的疾病之一,对于该病特别是隐性乳腺炎的诊断问题目前仍未得到彻底解决。奶牛乳腺发炎时,LF可增加20～30倍,患乳腺炎的奶牛乳汁中L F含量高达1～8 m g/m l。正常情况下,血清中LF含量低于1μg/m l,感染时L F 合成明显增加,每天可高达30g。这些都表明,LF和奶牛乳腺炎存在一定关系。研究还发现,不同类型的感染,奶牛乳汁中L F变化也不相同。

(2)K aw a i等研究了奶牛发生临床型乳腺炎时乳汁中L F 浓度的变化。结果表明,患临床型奶牛乳腺炎的奶牛乳汁中,LF浓度明显高于正常奶牛乳汁中LF浓度[4]。牛支原体感染和金黄色葡萄球菌感染时乳汁中L F浓度明显高于凝固酶阴性葡萄球菌感染时浓度。发生大肠杆菌感染时,过急性乳腺炎类型中的L F浓度明显低于急性乳腺炎类型的浓度。

表4 cE L ISA标准曲线的批内和批间误差

T a b le4 T h ein ta r-a s s a y a n din te r-a s s a y e rro rs o f th e s ta n da rd c u rv e bycEL ISA%

B L f∥n g/m l

批内误差In ta r-a ssa ye e r ro r

平均结合率±标准差

M e an b in d in g ra te±S ta n da rd de v ia tio n

批间误差In te r-a s sa y e rro r

平均结合率±标准差(变异系数)

M ea n b in d in g ra te±S tan da rd de v ia tion(va r ia tion coe ffic ien t)

1000.032.12±1.4531.87±1.89(5.93) 500.041.98±1.5642.15±2.05(4.86) 250.060.01±1.8761.48±2.42(3.94) 125.074.15±1.5675.26±1.98(2.63)

62.585.97±1.4885.17±2.84(3.33)

31.291.13±2.0192.01±2.75(2.99)

0 99.96±1.97100.05±2.31(2.31)平均值A v e rag e69.33±1.7069.71±2.32(3.71)

大肠杆菌型过急性乳腺炎相比环境链球菌和凝固酶阴性葡萄球菌,其乳汁中LF浓度明显偏低。

(3)H a g i w a ra等研究了正常奶牛与患奶牛隐性乳腺炎奶牛乳汁中LF浓度变化,发现患隐性乳腺炎奶牛LF浓度明显高于正常奶牛,泌乳后期明显高于泌乳中期和泌乳高峰期, LF水平随乳汁中体细胞计数值变化而变化,患金黄色葡萄球菌和链球菌型隐性乳腺炎奶牛明显高于患凝固酶阴性葡萄球菌和牛棒状杆菌隐性乳腺炎奶牛[5]。

(4)LF是牛乳中正常存在的一种糖蛋白,当奶牛患乳腺

炎时,其在牛乳中含量与炎症发生的程度呈正相关,且不同的病源感染时,其含量变化也不相同,因此可以通过检测牛乳中LF含量的变化来诊断奶牛乳腺炎,该试验利用抗牛乳铁蛋白细胞株制备抗LF的单克隆抗体,旨在建立一种检测牛乳中LF含量的竞争E L ISA检测方法,并为下一步研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。

参考文献

[1]H E D D Y ZO L A.单克隆抗体技术手册[M].南京:南京大学出版社,1991:

68-74.(下转第7761页)

256

7安徽农业科学2008年

着照射时间延长,致死率逐渐提高,当照射时间达到60s 时,致死率已超过90%,再延长照射时间,致死率变化不大。故选用60s 作为该试验的诱变剂量。

2.2 链霉素对孢子的最小致死浓度测定试验表明,当培养基中的链霉素浓度达到8μg /m l 时,平板上未见菌落生长,已达到完全抑制,该浓度即为链霉素对该菌的最小致死浓度。

2.3 链霉素抗性突变株的筛选在进行抗生素抗性筛选过程中一般采用链霉素最小致死浓度[6]筛选法,但在该试验过程中发现,当采用该致死浓度时,平板上很难获得再生菌落,故将筛选范围扩大到90

%以上致死率对应的链霉素浓度。

图1 紫外线诱变的致死曲线F ig.1 Le th a l c u rv e o f UV m u ta g e n e s is

将经紫外照射的孢子悬液分别涂布于不同浓度即4、5、6、8μg /m l 的链霉素抗性平板上,28℃倒置培养10d 后,共计挑取平板上的62个单菌落以小麦赤霉菌为指示菌,采用琼脂块法进行初筛。24℃条件下培养48h 后测量抑菌圈,并以出发菌株作阳性对照,共得到7株正变菌株,结果见表1。

表1链霉素抗性突变株的初筛结果T a b le 1 Pre l i m in a ry s c re e n in g re su lt o f s tre p tom y c in re s is ta n t m u ta n t

编号N o.

抑菌圈直径∥m m

D iam e te r o f a n tiba cte r ia l circ le 链霉素浓度∥μg/m l

S trep tom yc in con cen tra tio n

S 6-7 8.0 0

513.547156813619175201952314524

由表1可见,当培养基中添加链霉素浓度为5μg /m l 时,所得到的正实变菌株较多,且抑菌圈直径也较大。说明采用5μg/m l 的链霉素进行抗性筛选更加适宜。

2.4 高产菌株的复筛结果将上述8株初筛菌株在斜面培养基上连续传代3次,进行摇瓶发酵复筛,对初筛结果进行

进一步确证。以小麦赤霉菌为指示菌株,测定发酵液的效价,并将结果与出发菌株进行对比,结果见表2。

表2链霉素抗性突变株的复筛结果

T ab le 2 S econ da ry sc reen in g re su lt o f s trep tom y cinre s is tan t m u tan t 编号N o.菌斑直径∥m m B a cte r ia d iam e te l 抑制率∥%

In h ib i tionra te

提高率∥%

In cre a sin g ra te 指示菌 48.33

- -

In d ica t ive ba cte r ia S 6-715.2668.43 -59.1081.17 15.69717.3364.11-6.74813.0073.10 6.3919 5.0289.6123.642042.1712.75-436.7123 4.5090.6924.5524

4.17

91.38

25.11

注:表中数据均为3次测定的平均值。

N o te :D a ta in the tab le a re th e m ean of th ree repea ts.

由表2可见,复筛中7号和20号菌株的效价明显低于出发菌株(应视为突变未能有效遗传),24号菌株的提高率最明显(达到25.11%)。2次筛查结果表明,在挑选的62株菌株中,共有5株菌株具有明显的正突变,正突变率为8.06%;在得到的5株较好菌株中,3株提高率最高的菌株均来自5

μg/m l 的诱变浓度。3 讨论

紫外诱变是菌种选育过程中最常用的诱变方法之一,但该法导致的菌种突变是随机的,正突变株的出现频率很低,需要进行大量的筛选工作。通过将链霉素抗性筛选法与传统紫外诱变法结合,可快速、有效的获得理想的抗生素高产突变株[7]。该试验利用紫外诱变对出发菌株的孢子进行处理后,通过亚致死浓度的链霉素进行定向筛选,不仅使菌株的产素能力有较大提高,而且极大提高了菌种正向突变的筛选效率,同时为解决常规育种手段紫外照射带来的“疲劳效应”提供了新思路。参考文献

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(上接第7652页)

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fromn o rm a l a n d su bc lin ica l m a s tit ic cow s.V e t M ed S c i ,2003,65(3):319-323.

67736卷18期彭等链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株研究

血清铁浓度检测试剂盒说明书

货号：MS2802 规格：100管/96样血清铁浓度检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：血清铁是指血液中转铁蛋白所结合的铁，该指标常用于鉴别缺铁性与非缺铁性贫血。测定原理：亚硫酸钠还原血清Fe3+生成成Fe2+，Fe2+进一步与2, 2’- 联吡啶显色，在520nm处有吸收峰，测定该波长光吸收值即可计算血清铁含量。自备实验用品及仪器：离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、冰醋酸、氯仿和蒸馏水。试剂组成和配置：试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前配制，加入15mL蒸馏水充分溶解。试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前配制，加入469μL冰醋酸，加入15mL蒸馏水充分溶解。标准液：液体×1 支（EP管），100μmol/L Fe3+标准液，4℃保存。测定： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到520nm，蒸馏水调零。 2. 标准液解冻：提前取出标准液，置于室温下充分解冻后混匀。 3. 空白管：取EP管，依次加入125μL蒸馏水，125μL试剂一，125μL试剂二，混匀后盖紧，置于沸水浴5min，自来水冷却。加入62μL氯仿（自备），充分震荡混匀；室温10000rpm，离心10min，小心吸取上层液210μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于520nm 测定吸光度，记为A空白管。 4. 标准管：取EP管，依次加入125μL标准液，125μL试剂一，125μL试剂二，混匀后盖紧，置于沸水浴5min，自来水冷却。加入62μL氯仿，充分震荡混匀；室温10000rpm，离心10min，小心吸取上层液210μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于520nm测定吸光度，记为A标准管。 5. 测定管：取EP管，依次加入125μL血清，125μL试剂一，125μL试剂二，混匀后盖紧，置于沸水浴5min，自来水冷却。加入62μL氯仿，充分震荡混匀；室温10000rpm，离心10min，小心吸取上层液210μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于520nm测定吸光度，记为A测定管。注意：空白管和标准管只需测定一次。血清铁浓度计算公式：血清铁含量(μmol/dL)=[C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总=10× (A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) C 标准液：100 μmol/L Fe 3+ 标准液；V 总：1 dL=0.1 L。注意事项： 1、血清铁含量少，所用器皿（EP 管）需要注意，避免被铁污染。 2、试剂一和试剂二溶液不稳定，需现配现用，新配制的试剂只能当天使用。 3. 最低检出限为1μmol/L。第1页，共1页

铁蛋白测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)产品技术要求wtkr

铁蛋白测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人血清中铁蛋白的含量。 1.1包装规格 1)试剂1：45mL×1、试剂2：15mL×1； 2)试剂1：45mL×3、试剂2：15mL×3； 3)试剂1：48mL×1、试剂2：12mL×1； 4)试剂1：48mL×3、试剂2：12mL×3；校准品：0.5mL×5(选配)；质控品水平1：0.5mL×1（选配）；质控品水平2：0.5mL×1（选配）。 1.2组成成分试剂1：磷酸缓冲液50mmol/L 聚乙二醇 2% 吐温-20 0.05% 氯化钠100mmol/L 试剂2：磷酸缓冲液 200mmol/L 抗人铁蛋白抗体包裹的聚苯乙烯颗粒按效价确定氯化钠100mmol/L 校准品：磷酸缓冲液，人血清(含量≥5%)，铁蛋白，铁蛋白目标浓度：水平1：0μg/L，水平2：100μg/L，水平3：250μg/L，水平4：500μg/L，水平5：1000μg/L，批特异，具体浓度见瓶签；质控品：磷酸缓冲液，人血清(含量≥5%)，铁蛋白，质控品靶值范围：水平1：85μg/L～115μg/L，水平2：322μg/L～438μg/L），批特异，具体浓度见瓶签。 2.1外观试剂1：无色或淡黄色澄清液体；试剂2：无色或乳白色液体；校准品：无色或淡黄色澄清液体；质控品：无色或淡黄色澄清液体。 2.2试剂装量

试剂盒内液体装量应不低于瓶签标示装量。 2.3试剂空白吸光度在37℃、570nm波长、1cm光径条件下，试剂空白吸光度应不大于1.80。 2.4分析灵敏度测试20μg/L的铁蛋白样本吸光度差值应在0.0005≤△A≤0.2000范围内。 2.5准确度测定国家标准物质150540，测试结果相对偏差不超过±10%。 2.6线性在[10,1000]μg/L范围内，线性回归的相关系数应不低于0.990；[10,200]μg/L 浓度线性绝对偏差不超过±30μg/L，(200,1000]μg/L浓度线性相对偏差应不超过±15%。 2.7精密度 2.7.1 重复性重复测试高、中、低三个浓度水平的血清样品或质控样品，其结果的变异系数应不超过10%。 2.7.2 批间差重复测试高、低两个浓度水平的血清样品或质控样品，其结果相对极差（R）应不超过10%。 2.8质控品赋值有效性用本公司生产的铁蛋白测定试剂盒（胶乳免疫比浊法），测定两个水平的质控品，检测结果均在质控品质控范围内。 2.9校准品/质控品重复性测试试剂盒内校准品（0点除外）、质控品，其结果的变异系数（CV）应不超过10%。 2.10校准品溯源性按照GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样本中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》要求，该试剂盒内校准品溯源至国家标准物质150540。 2.11检出限

ELISA检测方法有哪些

ELISA检测方法有哪些？酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图：直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法：双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，

转铁蛋白试验(长征医院)

便隐血转铁蛋白临床实验应用体会宓庆梅上海市长征医院粪便隐血试验是检测消化道出血的一个重要指标，检测方法选择的不同会直接影响判断消化道是否出血和出血的程度。目前，常规的检测方法有化学法（邻甲联苯胺法）和血红蛋白法（单克隆免疫法）。化学检测法中，易产生假阳性，并且敏感性偏底，对于消化道内的微量出血不易测出；血红蛋白法中，敏感性强，可以检测出很微量的出血情况，但是，消化道内大量出血反而会导致假阴性的结果。便隐血检测是美国最常使用的结肠癌和直肠癌普查初筛试验，也是目前唯一通过随机临床试验证实的，可以降低结肠癌和直肠癌所致死亡的检查，实施每年粪便隐血检测可以早期发现结肠癌和直肠癌的发生，可以降低30%的结肠癌和直肠癌患者的死亡率。本文对化学法、血红蛋白法和转铁蛋白法三种便潜血检测方法抗体法进行了比对试验。用单克隆胶体金显色技术，以试纸条一步法检测粪便中血红蛋白，有较高的敏感性和特异性。转铁蛋白单克隆抗体法试纸是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、抗转铁蛋白单抗金标垫、玻璃纤维样品吸液层组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条转铁蛋白单抗反应线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水板，另一端端头为玻璃纤维样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和抗转铁蛋白单抗金标垫相互交叠连接，在抗转铁蛋白单抗金标垫上压有玻璃纤维样品吸液层。当人尿液、粪便中带有转铁蛋白抗原时，样品中转铁蛋白抗原可与抗转铁蛋白单克隆抗体金标探针发生特异结合而被抗转铁蛋白单克隆抗体识别，即发生双抗夹心特异结合，因而可测定尿液、粪便中的转铁蛋白含量。 1.材料和方法 1.1试剂： 1.1.1邻甲联苯胺试剂：邻甲联苯胺1g，溶于50ml冰醋酸和50ml无水乙醇的混合液中，置于4℃冰箱中，避光保存；3%过氧化氢液。 1.1.2粪便血红蛋白胶体金试剂盒（简称WH试纸条）：万华普曼生物工程有限公司提供的万华牌“消康保”试纸条。 1.1.3转铁蛋白单克隆抗体法试剂盒：万华普曼生物工程有限公司提供的万华牌“消康保”试纸条。 1.2标本来源：本院2008年1月至3月的住院患者随机132例粪便，男81例，女51例，年龄为27岁至71岁。 1.3方法：

铁蛋白测定试剂盒(化学发光免疫分析法)产品技术要求furuirunkang

铁蛋白测定试剂盒（化学发光免疫分析法）适用范围：用于体外定量测定人血清中铁蛋白的浓度水平。 1.1规格 96T。 1.2 组成

2.1 外观 a)包装标签应清晰、无磨损; b)试剂盒各组份应齐全、包装完好，液体无渗漏。 2.2 线性本试剂盒线性范围为：[0.1 ,600] ng/mL。线性相关系数r≥0.9900。 2.3空白限不大于0.1ng/mL。 2.4准确度将参考物质作为样本进行检测，其测量结果的相对偏差应在±10%范围内。 2.5重复性重复检测质控品Q1和 Q2各10次，其批内变异系数（CV）应不大于10%。 2.6批间差用三个批号的试剂盒检测质控品Q1和 Q2，三批号试剂盒之间的批间变异系数（CV）应不大于15%。 2.7质控品赋值有效性质控品测量值应在质控范围内。 2.8特异性 2.8.1与甲胎蛋白的交叉反应检测浓度为600 ng/mL的甲胎蛋白, 交叉反应率应小于1%。 2.8.2与转铁蛋白的交叉反应检测浓度为600 ng/mL的转铁蛋白, 交叉反应率应小于1%。 2.8.3与尿微量白蛋白的交叉反应检测浓度为600 ng/mL的尿微量白蛋白，交叉反应率应小于1%。 2.9稳定性规定产品2℃～8℃储存，有效期6个月。取到效期后的样品检测准确度、空白限、线性、重复性，应符合2.2～2.5的要求。 2.10溯源性

根据《GB/T 21415—2008 体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》及有关规定提供校准品的来源，赋值过程以及不确定度等内容，校准品溯源至中国食品药品检定研究院标准品（150540）。

HIV实验室ELISA检测方法

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。

5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）

血红蛋白转铁蛋白检测试剂盒(胶体金免疫层析法)产品技术要求wanhuapuman

血红蛋白/转铁蛋白检测试剂盒（胶体金免疫层析法）适用范围：该产品用于体外定性检测人体粪便样本中的血红蛋白和转铁蛋白的含量。 1.1包装规格 24人份/盒。 1.2 主要组成成分在血红蛋白检测条和转铁蛋白检测条的基础上外加筒形状的聚苯乙烯塑料外壳制成。血红蛋白检测条主要由塑料板，吸水板，硝酸纤维素膜，胶体金，吸水纸组成；硝酸纤维素膜由包被有羊抗鼠多克隆抗体的控制线（C线）和包被有鼠抗人血红蛋白单克隆抗体的反应线1（T线）组成；胶体金由鼠抗人血红蛋白单克隆抗体2标记制成；转铁蛋白检测条主要由塑料板，吸水板，硝酸纤维素膜，胶体金，吸水纸组成；硝酸纤维素膜由包被有羊抗鼠多克隆抗体的控制线（C线）和包被有鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体的反应线1（T线）组成；胶体金由鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体2标记制成。 2.1 外观外观整洁完整、无破损、无污染；材料附着牢固、内容物齐全。包装完整、标签清晰。 2.2 宽度膜条应宽于2.5mm。 2.3 移行速度液体移行速度应不低于10mm/min。 2.4 临界值及重复性 2.4.1 分别检测含被测物相应检出限浓度（见表1）的阳性质控品各20次，其结果阳性率≥95%。 2.4.2 分别检测含被测物相应阴性检测浓度（见表1）的阴性质控品各20次，其结果阴性率≥95%。表1 被测物检出限检测浓度点

2.5 分析特异性检测含有宣称不产生交叉反应的最高浓度/水平的干扰物质（详见表2）结果应不出现阳性。表2 常见的交叉反应源 2.6 批间差抽取三个批次的试纸条各20人份，分别按临界值及重复性检测方法检测，阴性结果符合率应≥95%，阳性结果符合率应≥95%。 2.7 HOOK效应检测2000μg/ml的人血红蛋白阳性质控品及400μg/ml的转铁蛋白阳性质控品，结果应均不出现阴性。 2.8 稳定性检测试纸条在4℃-30℃避光保存36个月后，产品的性能应符合2.4,2.5,2.7的要求。

铁蛋白(FER)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)产品技术要求sainuopu

铁蛋白（FER）测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人体血清中的铁蛋白的含量。 1.1试剂盒包装规格试剂1：1×20ml，试剂2：1×10ml；试剂1：2×36ml，试剂2：2×18ml；试剂1：1×400ml，试剂2：1×200ml。校准品（可选）：4×0.5ml（四水平），4×1ml（四水平）。 1.2试剂盒主要组成成分

2.1 外观液体双试剂：试剂1无色澄清液体；试剂2 乳白色悬浊液。校准品：浅黄至棕红色液体。 2.2 净含量液体试剂的净含量不得低于标示体积。 2.3 试剂空白吸光度在37℃、660nm波长、1cm光径条件下，试剂空白吸光度应不大于2.0。 2.4 分析灵敏度测定浓度为400ng/ml样本时，吸光度变化绝对值（|ΔA|）应不小于0.03。2.5 线性范围在（6，450）ng/ml范围内，线性相关系数r不小于0.996，在（50，450）ng/ml 区间内线性相对偏差不大于±15%，（6，50]ng/ml区间内线性绝对偏差不大于±7.5ng/ml。 2.6 重复性重复测试两份高低浓度的样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于8%。 2.7 批间差不同批号试剂测试同一份样本，测定结果的批间相对极差应不大于10%。 2.8 准确度相对偏差：相对偏差应不超过±10%。 2.9 校准品溯源性依据GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，校准品溯源至NIBSC生产的有证参考物质（WHO 94/572）。

2.10 稳定性效期稳定性：试剂盒在2℃～8℃下有效期为12个月。取失效期的试剂盒进行检测试验结果满足2.3、2.4、2.5、2.6、2.8的要求。

竞争法案例分析

例一：甲旅行社的欧洲部副经理李某，在劳动合同未到期时提出辞职，未办移交手续即到了乙旅行社，并将甲旅行社的欧洲合作伙伴情况、旅行路线设计、报价方案和客户资料等信息带到乙社。乙社原无欧洲业务，自李某加入后欧洲业务猛增，成为甲社的有力竞争对手。现甲社向人民法院起诉乙社和李某侵犯商业秘密。问题1：法院如认定乙社和李某侵犯甲社的商业秘密，须审查什么事实？答案：甲社所称的“商业秘密”是否属于从公开渠道不能获得；乙社的欧洲客户资料是否有合法来源；乙社在聘用李某时是否明知或应知其掌握甲社的上述业务信息。问题2：如法院判定乙社和李某侵权成立，确定其赔偿责任可以采用何种办法？答案：两种，一、按照甲社在侵权期间的利润损失进行赔偿，乙社和李某承担连带赔偿责任。二、甲社在侵权期间的利润损失无法计算时，按照乙社所获利润进行赔偿，李某承担连带赔偿责任。例二：安徽省知名制药企业华佗国药厂以吉林一家药业公司使用的“华佗银屑王”商标与其申请注册的“华佗”商标相近似为由，将该企业告上法庭。11月6日,安徽省亳州市中级人民法院一审判决银诺克药业公司销毁全部的华佗银屑王产品，并赔偿原告经济损失10万元。原告华佗国药厂在安徽省享有一定的知名度，主营中、成药及保健品制造、销售,经营本企业自产产品及相关技术出口业务等。2005年12月, “华佗”商标被安徽省工商行政管理局认定为著名商标。华佗国药厂称，被告银诺克公司在其商品的外包装上使用与“华佗”商标相近似的“华佗银屑王”五个字,误导了相关公众,侵犯了“华佗”注册商标专用权。同时，使公众误认为“华佗银屑王”是华佗国药厂产品,其行为构成了不正当竞争，请求法院确认原告注册的“华佗”药品商标为驰名商标，判令被告立即停止侵权行为，并赔偿经济损失40万元。问题1：这起案件的纠纷性质是什么？答案：应是商标名称的侵权纠纷。问题2：如果你是法官，你会如何审理？答案：我认为，“华佗”二字是原告注册的，是按照商标法落入保护范围的二字，被告并未正当使用“华佗”二字，构成了对原告注册商标的侵权。由于商标法在调整商标侵权方面属于市场竞争的行为，而反不正当竞争法是专门法，按照专门法优于普通法的法律适用原则，本案不能对同一行为再适用反不正当竞争法,故对原告要求认定被告行为构成不正当竞争的诉讼请求不再支持。

ELISA检测

ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其

转铁蛋白检测试剂盒(胶体金免疫层析法)产品技术要求wanhuapuman

转铁蛋白检测试剂盒（胶体金免疫层析法）适用范围：该产品用于体外定性检测人粪便样本中转铁蛋白的含量。 1.1规格和型号条型：1.筒装： 1）25人份/筒，12筒/盒 2）25人份/筒，24筒/盒 2.袋装： 1人份/袋；100人份/盒板型：1）1人份/袋，25人份/盒 2）1人份/袋，40人份/盒 1.2主要组成成分转铁蛋白检测试纸条主要由塑料板，吸水板，硝酸纤维素膜，胶体金，吸水纸组成；硝酸纤维素膜由包被有羊抗鼠多克隆抗体的控制线（C线）和包被有鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体1的反应线（T线）组成；胶体金由鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体2标记制成。板型产品主要由卡塞和转铁蛋白检测试纸条组成。 2.1外观外观整洁完整、无破损、无污染；材料附着牢固、内容物齐全。包装完整、标签清晰。 2.2物理检查膜条应宽于2.5mm，液体移行速度应不低于20mm/min。 2.3临界值及重复性本产品临界值为10ng/mL。检测浓度为40ng/mL的转铁蛋白质控品（配制方法见附录A），平行检测20次，检测结果应一致，显色度均一，结果的阳性率应≥95%。检测浓度为5ng/mL的转铁蛋白质控品（配制方法见附录A）平行检测20次，检测结果应一致，显色度均一，结果的阴性率应≥95% 2.4特异性

检测浓度为200μg/mL的牛转铁蛋白和200μg/mL的狗转铁蛋白，检测结果应为阴性。 2.5批间差取3个批号的产品，各40人份，按照2.3的方法检测，结果应符合要求。 2.6 HOOK效应检测浓度为400μg/mL的转铁蛋白质控品（配制方法见附录A），检测结果应为阳性。 2.7稳定性产品有效期为24个月，在4℃～30℃条件下放置有效期后2个月，产品性能应符合2.1 ～2.3的要求。

ELISA检测方法

ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。双抗夹心法夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。间接法间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。

②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。

人转铁蛋白(TF)

人转铁蛋白(TF)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用检测范围：0.023nmol/L –1.5nmol/L 最低检测限：0.006nmol/L 特异性：本试剂盒可检测人TF，且与其他相关蛋白无交叉反应。有效期：6 个月预期应用：ELISA 法定量测定人血清、血浆中TF 含量。说明 1. 试剂盒保存：2-8℃。 2. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 3. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗TF 抗体的微孔中加入标本或标准品、HRP 标记的抗TF 抗体，经过彻底洗涤后用底物显色。底物在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TF 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板(Assay plate )：一块（96 孔）。 2. 标准品（Standard）：2 瓶(冻干品)。 3. 酶结合物（HRP-conjugate）: 1 x 120μl /瓶。 4. 酶结合物稀释液(HRP-conjugate Diluent) : 1×20ml/瓶。 5. 样品稀释液(Sample Diluent)：2×20ml/瓶。 6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 7. 浓洗涤液（Wash Buffer）1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。 8. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶。需要而未提供的试剂和器材 1. 标准规格酶标仪 2. 高速离心机 3. 电热恒温培养箱 4. 干净的试管和Eppendof 管 5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存 1. 血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃过夜后于1000 x g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8° C1000 x g 离心15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则：血清，血浆样本用样本稀释液进行1:20000 倍稀释后进行检测，具体操作如下：取1μl 样本加入到99μl 的样本稀释液（1:100 稀释）中混匀，再从上述稀释液中取1μl 加入到

铁蛋白测定试剂盒(胶体金免疫层析法)产品技术要求dekangrun

铁蛋白测定试剂盒（胶体金免疫层析法）组成：该产品由对应人份数量的检测试纸、干燥剂、稀释液和1个ID卡组成。检测试纸：由胶体金垫（胶体金标记鼠抗人铁蛋白单克隆抗体）、硝酸纤维素膜（C线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体、T线包被鼠抗人铁蛋白单克隆抗体）、样品垫、吸样垫和PVC板组成。稀释液：由140μl的0.01M（pH7.4）磷酸盐缓冲液组成。ID卡：内含校准曲线。适用范围：适用于体外定量检测人全血、血清或血浆样本中铁蛋白（FER）的浓度。 1.1 包装规格：10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒。 1.2 主要组成成分：该产品由对应人份数量的检测试纸、干燥剂、稀释液和1 个ID卡组成。检测试纸：由胶体金垫（胶体金标记鼠抗人铁蛋白单克隆抗体）、硝酸纤维素膜（C线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体、T线包被鼠抗人铁蛋白单克隆抗体）、样品垫、吸样垫和PVC板组成。稀释液：由140μl的0.01M（pH7.4）磷酸盐缓冲液组成。ID卡：内含校准曲线。 2.1 外观试剂盒组分应齐全，内外包装均应完整，标签清晰；检测试纸应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染，材料附着牢固。 2.2 膜条宽度膜条宽度为4.0mm±0.1mm。 2.3 液体移行速度液体移行速度应不低于10mm/min。 2.4 空白限空白限应不高于10ng/ml。 2.5 线性范围线性区间[10，900]ng/ml，相关系数（r）≥0.990。 2.6 准确度相对偏差应不超过±15%。 2.7 重复性

重复检测高、中、低3个浓度的样本各10次，各浓度所得结果的变异系数（CV）应均不大于20%。 2.8 特异性检测35mg/ml的人血白蛋白各3次，检测结果应均不高于10ng/ml。2.9 批间差随机抽取三批检测试剂，每批分别检测高、中、低3个浓度的样本各3次，各浓度所得结果的批间相对极差（R）应均不大于15%。 2.10 稳定性 4℃～30℃避光保存18个月后，分别检测2.1～2.8各项，结果应符合各项要求。 2.11 校准信息溯源性试剂盒校准信息按照GB/T 21415-2008 《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，溯源到国家标准物质。

铁蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)产品技术要求baiding

铁蛋白测定试剂盒（免疫比浊法）适用范围：用于体外定量测定人血清中铁蛋白的含量。 1.1规格校准品（选配）：1×3ml。 1.2主要组成成分

靶值批特异，详见瓶标签。 2.1 外观 2.1.1 试剂1为无色透明液体，无混浊，无未溶解物。 2.1.2 试剂2为白色或微黄色胶乳液体。 2.1.3 校准品为白色冻干粉，溶解后为无色或淡黄色液体，无未溶解物。 2.1.4 标签内容清晰，字迹牢固不易脱落。 2.2 试剂装量液体试剂的净含量应不少于标示值。 2.3 试剂空白吸光度 A≤1.400（光径1.0cm，540nm±20nm 波长）。 2.4 分析灵敏度测定100μg/L 被测物，吸光度变化在0.04～0.40区间内。 2.5 线性 2.5.1 [4，300]μg/L。在规定的线性区间内，线性测定值与样本浓度值的相关系数（r）应不低于0.9900。 2.5.2 [4，50]μg/L区间内，线性偏差应不超过±5μg/L；（50，300]μg/L 区间内，线性相对偏差应不超过±10%。 2.6 精密度

2.6.1 批内精密度用高、中、低3个浓度的样本测试试剂盒，各重复测试10次，其变异系数（CV）应不大于5%。 2.6.2 批内瓶间差校准品批内瓶间差CV≤5.0%。 2.6.3 批间差用样本分别测试3个不同批次的试剂盒，每个批次测试3次，其相对极差（R）应不大于6%。 2.7 准确度相对偏差在±10%范围内（测试国家标准物质150540）。 2.8 溯源性根据GB/T21415及有关规定提供校准品的来源、赋值过程及测量不确定度等内容，溯源至国际参考物质94/572（NIBSC）。 2.9 稳定性 2.9.1 校准品冻干粉复溶后在2℃～8℃避光保存稳定30天，测定结果应符合2.8要求。 2.9.2 原装试剂盒2℃～8℃保存，有效期12个月，有效期满后2个月内测定结果应符合2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.6.2和2.7要求。

ELISA 直接法与间接法的区别

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固

铁蛋白(FERRITIN)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)产品技术要求beiaikang

铁蛋白（FERRITIN）测定试剂盒（磁微粒化学发光免疫分析法）适用范围：用于体外定量测定人血清或血浆中铁蛋白（FERRITIN）的含量。 1.1产品规格 100管份/盒。 1. 1.2主要组成成分

校准品靶值批特异，详见标签。质控品质控范围批特异，详见标签。 2.1 外观 a）试剂盒中的组份应澄清，应无沉淀和絮状物，内外标签、标识清晰，易识别； b）分离试剂摇匀后，应为均匀悬浊液，无明显凝集。 2.2 校准品溯源根据GB/T21415及有关规定提供校准品的来源、赋值过程及测量不确定度等内容，溯源至国家标准品（编号：150540）。 2.3 净含量试剂盒各液体组份的体积不得少于标称体积。 2.4 最低检出限最低检出限不高于1ng/ml。 2.5 线性在（0，1000ng/ml）范围内剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应≥0.9900。 2.6 重复性和批间差 2.6.1重复性：用一定浓度水平的样本，重复检测10次其变异系数（CV）应不大于10%。 2.6.2批间差：用三个批号试剂盒检测同一样本，则三个批号试剂盒试剂盒之间的变异系数（CV）应不大于15%。 2.7 准确度使用试剂盒校准品校准后测定国家标准品（品种编号：150540），国家标准品的实测浓度与标示浓度的偏差在±10%之间。

2.8 质控品测定值质控品的测定结果应在质控范围内。 2.9 特异性试剂盒与表中有关潜在交叉反应物应无显著的交叉反应。 2.10 稳定性试剂盒在规定的贮存条件2℃～8℃下保存，有效期12个月，效期后两个月内应符合2.1、2.4、2.5、2.6.1、2.7的要求。

反垄断法案例解析及分析

反垄断法案例 1、两拓结盟 2009年6月5日，力拓宣布与竞争对手必和必拓达成合作协议，双方将合并各自的西澳大利亚矿石业务，成立一家合资公司，并各持股50%。由于两者的铁矿石出口量之和占到了澳大利亚的８０％以上，已构成了实质性的垄断。而作为对进口澳矿依赖度超过４０％的中国，如何应对成为业界关注的焦点。国际钢协、中钢协、欧洲钢铁工业联盟、日本钢铁联盟对此表示强烈反对。商务部称，至今未收到两拓的反垄断申报。 2、北京首起反垄断诉讼案宣判界定“相关市场”概念原告唐山人人公司诉称，由于其降低了对百度搜索竞价排名的投入，被告即对全民医药网在自然排名结果中进行了全面屏蔽，从而导致了全民医药网访问量的大幅度降低。而被告这种利用中国搜索引擎市场的支配地位对原告的网站进行屏蔽的行为，违反了我国《反垄断法》的规定，构成滥用市场支配地位强迫原告进行竞价排名交易的行为。故请求法院判令被告赔偿原告经济损失1106000元，解除对全民医药网的屏蔽并恢复全面收录。被告百度公司辩称，被告确实对原告所拥有的全民医药网采取了减少收录的措施，实施该措施的原因是原告的网站设置了大量垃圾外链、搜索引擎自动对其进行了作弊处罚。但是，该项处罚措施针对的仅仅是百度搜索中的自然排名结果，与原告所称的竞价排名的投入毫无关系，亦不会影响原告竞价排名的结果。其次，原告称被告具有《反垄断法》所称的市场支配地位缺乏事实依据。被告提供的搜索引擎服务对于广大网民来说是免费的，故与搜索引擎有关的服务不能构成《反垄断法》所称的相关市场。因此，请求人民法院判决驳回原告的诉讼请求。法院经审理认为，首先，认定经营者是否具有市场支配地位，原则上应当根据《反垄断法》第十八条所规定的市场份额、竞争状况、控制销售市场和原材料市场的能力等因素进行判断。当然，在经营者的市场份额能够予以准确确定的情况下，也可以根据《反垄断法》第十九条的规定进行市场支配地位的推定。但当反垄断民事诉讼中的原告选择适用上述推定条款来证明被告具有市场支配地位时，应当就其对被告市场份额的计算或者证明方式提供充分的证据予以支持。本案中的相关市场是中国搜索引擎服务市场，原告仅提交了两篇有关被告市场地位的新闻报道，未提供具体的计算方式、方法及有关基础性数据的证据能够使本院确信该市场份额的确定源于科学、客观的分析，因此原告未能举证证明被告在“中国搜索引擎服务市场”中占据了支配地位。其次，《反垄断法》并不禁止企业通过自身的发展形成规模经济，从而占据一定的市场支配地位，《反垄断法》禁止的是占据市场支配地位的企业所实施的，能够影响市场结构，破坏市场竞争秩序的行为和措施。如果经营者所实施的行为具有正当理由，也没有产生破坏市场竞争秩序的后果，即不构成《反垄断法》所禁止的滥用行为。本案中，被告虽然对全民医药网的自然排名结果实施了减少收录数量的技术措施，但其行为是对全民医药网存在“垃圾外链”行为进行的处罚。被告在其网站的相关页面上向社会公众公布了百度搜索引擎的算法规则及针对作弊行为的处罚方式，原告完全有途径了解百度搜索反对网站设置“垃圾外链”的行为，并会对这种行为实施处罚。而且，其处罚措施针对的是所有设置了“垃圾外链”的被搜索网站而非单独指向全民医药网。庭审过程中，原告也承认其经营的全民医药网确实存在“垃圾外链”。上述反作弊机制的实施是为了使搜索结果更为真实和可靠，从而保证广大搜索引擎用户的利益，同时，现有证据亦无法证明被告采取的上述措施对原告而言存在歧视性或者胁迫性，故被告基于全民医药网存在大量“垃圾外链”的事实而对其实施了减少自然排名部分收录数量的技术措施是正当的，不构成滥用市场支配地位的行为。综上，原告既未能举证证明被告在“中国搜索引擎服务市场”中占据了支配地位，也未能证