鸡胚成纤维细胞制备实验

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细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离

不开细胞的培养工作。[1]

病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。

鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。由组织刚刚分离出来的细胞能够

分裂增殖,形成单层细胞。

[2]

1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚

消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。

2 操作[3]

2.1 操作前的准备

(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋

白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。

(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。

2.2 成纤维细胞制备

(1)取9-11日龄的鸡胚。先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。用pH7.2的PBS洗液冲洗二次后转移至灭菌小烧杯中,将其剪碎至1-2mm 3小块。

(2)消化。用胰蛋白酶溶液洗2-3次至上清液清亮,然后约加4ml0.25%胰酶溶液,37℃消化30min,期间15min轻摇一次。消化结束,弃掉胰酶消化液,用pH7.2的PBS冲洗两次,再用细胞生长液冲洗一次。加入适量的细胞生长液,用刻度吸管反复吹打,使细胞充分分散。将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中(过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布),加入适量培养液(40ml/胚),过滤。

(3)计数。显微镜,血球计数板计数,要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。

(4)分装培养。分装置个培养瓶中(7-8ml/瓶),置37℃培养箱培养。

整个操作过程如图1所示。

2.3 传代培养

当培养液的营养物质消耗殆尽,pH值下降,酚红指示剂由桃红

色变为透明清亮的黄色,但溶液不浑浊,且贴壁率>80%即可进行传代培养。传代培养过程如图2所示。

(1)吸去培养液,操作过程中吸管不要贴壁,以免破坏细胞;(2)在培养瓶中添加适当消化液,添加时要从无细胞面添加,使得消化液浸没整个细胞层;

(3)将培养瓶置于倒置显微镜下观察,直至细胞收缩变圆时将消化液倒出;

(4)加入培养液,然后用吸管反复吹打,使得细胞充分分散;(5)显微计数,调整细胞浓度,分装培养。

3 细胞应用

目前,由于禽胚细胞获得较容易,可用来充当病毒培养的受体,在一些禽苗的生产中也用到了鸡胚成纤维细胞,如鸡痘活疫苗等。另外由于鸡胚成纤维细胞传代相对困难,在一些生产企业主要用做外源病毒检验。参考文献

[1]刘洪斌,孙心.利用不同方法培养鸡胚成纤维细胞的研究.中国兽医杂质,2009,12.

[2]朱国坡,周晓丽.鸡胚成纤维细胞原代培养及应用.动物医学进展,2010,31(3):112-114.

[3]刘永清,孙浩.鸡胚成纤维细胞原代培养与纯化的初探.国外牧医学,2008,01,25.

鸡胚成纤维细胞制备实验

胡秋杰 黄晓峰

(黑龙江生物科技职业学院 黑龙江哈尔滨 150025)

摘要:

鸡胚成纤维细胞具有相对易得,适应能力强,增殖快,耐受性良好等特点,使其广泛应用于生物制品制备领域,如病毒培养,疫苗制备等方面,也

成为制药类高职院校常开设的基本实验之一。

关键词:鸡胚成纤维细胞 制备 实验 原代培养 传代培养

中图分类号:S852

文献标识码:

A 文章编号:

1674-2060(2015)01-0042-01

图

1 鸡胚成纤维细胞制备原理示意图

图2 消化法传代培养示意图