重要纳米材料的生物效应机制与安全性评价研究
项目名称：重要纳米材料的生物效应机制与安全性
评价研究
首席科学家：赵宇亮中国科学院高能物理研究所起止年限：2011.1至2015.8
依托部门：中国科学院
二、预期目标
总体目标
本项目将围绕与工作场所和纳米产品相关，已经规模化生产或使用的重要纳米材料的生物效应与安全性展开研究，在学术上取得重大突破的同时，抓住机遇，提升我国纳米产业所面临的国际竞争力，为我国纳米科技可持续发展的重大国家需求，提供保障。
在科学上：重点揭示：生产车间纳米颗粒的释放与团聚行为，工人暴露限量以及健康效应，食品纳米颗粒进入胃肠道后的行为和命运；在细胞、分子水平上揭示这些纳米材料与呼吸系统、心血管系统、胃肠道以及皮肤相互作用机理；力争率先揭示影响工作场所和消费品中纳米颗粒生物安全性的关键因素和共性规律；揭示纳米颗粒与产品添加剂的复合－协同效应关系；获得具有重大国际影响力的研究成果。培养一批能够进行原创性研究的高水平人才。
在应用上：筛选出能够用于评价纳米材料安全性的生物学或毒理学的指标；提出我国自主知识产权的与工作场所和消费产品相关的纳米材料安全性评价方法和评估程序；向国家提出相关纳米材料的职业接触限值OELs；为国家建立相应的安全评价体系提供科学依据，提高我国纳米产业的国际竞争力，支撑国家纳米科技可持续发展。
五年预期目标
1.揭示工作场所中重要纳米材料（TiO2、ZnO、SiO2、Al2O3、富勒烯、碳纳米管的健康效应；建立工作场所吸入纳米颗粒特性与生物效应和安全性的关系；阐明释放空气中的纳米颗粒吸附2－3种重金属和1-2种重要有机污染物的复合－协同效应对生物安全性的影响；阐明工作场所纳米颗粒健康效应的分子机制；
2.科学客观阐述食品相关5种重要纳米颗粒（如Ag、TiO2、ZnO、SiO2、Al2O3）的生物效应，以及与2-3种添加剂的复合－协同效应；阐述这些纳米颗粒对胃肠道、皮肤的作用规律；发现这些纳米颗粒生物学效应的分子机制；
3.建立针对食品相关5种重要纳米颗粒的释放与性质检测方法；建立这类复杂成分纳米产品中纳米颗粒生物效应研究的实验方法学；
4.综合上述成果，从10-15种复杂因素中力争筛选出3-5种决定产品中纳米颗粒的毒理学效应的关键因素；阐明它们影响细胞或生物分子的基本过程；在此基础上，提出1种适合纳米生物效应的高通量筛选方法（包括细胞模型、检测参数、检测方法，以及集成的技术体系等）；进一步结合理论模拟和上述研究结果，建立纳米材料生物效应的定量构效关系，发展相关的分析预测模型；探索纳米技术相关的社会伦理学现象，为提高公众的接受度和理解度出谋划策。
5.取得一批具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物包括Science 或Nature系列期刊上发表高质量论文100篇以上，申请国际国内专利10项以上。向国家提出经实验验证过的纳米安全性评价方法1种，纳米安全性评价程序草案1部；向国家提出1-2种重要纳米材料的职业接触限值。培养一批有国际影响力的中、青年学术带头人，培养研究生40名，博士后10-15名。
三、研究方案
学术思路
已有的纳米毒理学研究结果存在三个突出的问题，发现了一系列复杂的毒理学现象，但是机制不清；研究在大剂量，急性暴露下引起的毒性反应，虽然可用于“突发事故”的安全性评估，但对纳米材料含量低的纳米产品并不适用；缺乏实际工作现场的研究，导致无法对生产场所的安全评价做出正确的结论。因此，本项目的基本学术思路：（1）从观察现象转移到揭示机制，在细胞和分子水平上，系统揭示纳米生物效应尤其是纳米毒理学过程的分子机制；（2）从单一组分纳米材料研究发展到研究复杂成分的纳米产品。直接研究消费产品如食品等中的纳米颗粒，才能建立科学客观评价方法，扭转目前认为纳米产品不安全的误区；（3）从实验室模拟研究深入到工作现场研究。由于有前期实验室模拟研究成果的积累，使针对更为复杂的现场研究成为可能（对国家建立安全性评估体系而言，现场研究结果比实验室模拟结果更为真实可靠；（4）建立纳米毒理学效应快速筛选方法学至关重要，传统材料一般3-5个因素就可以决定其毒理学行为。然而由于纳米特性，纳米材料通常需要研究10-15个不同因素。因此，探索高通量筛选方法，快速筛选出决定纳米材料或产品安全性的关键因素，才能实际指导纳米产品和纳米技术的研发。
因此，本项目的研究思路将与实际应用紧密结合起来，从生物整体、组织器官，重点是生物分子，逐层选择，逐层深入，综合考虑各种相关成分的协同效应，系统地揭示纳米尺度下物质的毒理学效应的重要机制，阐明纳米尺度颗粒与生物体系相互作用的过程；建立纳米产品与生产现场中的纳米颗粒的生物效应、与纳米特性、以及与环境因素之间的相关性；建立产品中纳米颗粒的毒理学分析、测试方法和评估流程。
研究方案
考虑同时兼顾科学探索和国家需求，我们的研究方案将从纳米材料和相关产品的整个生命周期的四个阶段入手：一是纳米材料的生产，二是含纳米材料的产品的生产，三是消费者使用纳米产品，四是废弃处理（图1）。
保管运输
废弃物
污水排放
图1. 纳米材料与相关产品的生命周期
前期的研究，主要集中在第一阶段生产的纳米材料的生物效应与安全性。本项目重点针对第二和第三阶段所释放的纳米颗粒展开研究。欧洲不断出现的反对纳米技术的大规模游行（见“研究背景”中的介绍和文献），其实是因为人们不清楚纳米材料毒理学效应和纳米产品的安全性所导致的误解。建立科学客观评价纳米产品安全性的方法，是扭转目前一提到纳米产品就认为不安全的误区的唯一办法。因此，直接选择与消费产品密切相关的阶段进行研究，尽管难度大，但是具有紧迫性，一方面它对保障纳米科技的顺利发展至关重要，另一方面，针对这个阶段的科学研究也接近空白。
根据上述的整体设臵和布局，结合拟研究的关键科学问题，我们设计了如图2 A所示的总体研究方案。围绕纳米材料在生物体内的过程与行为，阐明纳米材料对生物作用的分子机理及安全性这个中心目标。
我们首先开展工作场所纳米颗粒的研究，包括释放，职业暴露与安全性等（由课题1分工承担）：研究纳米材料生产过程中释放的纳米颗粒在空气中的行为，
安全性的指标。
纳米毒理学的知识体系是建立科学客观评价纳米产品安全性的基石为此，我们设计了相应学术方案（图2B）。针对食品而言，我们将重点研究食品纳米颗粒
在胃肠道微环境中的纳米特性变化，食品纳米颗粒对胃肠道中菌群的影响等；为了保障产品中纳米颗粒的长期安全，产品添加剂至关重要，因此，食品中纳米颗粒与产品添加剂，相关纳米颗粒与空气污染物的复合－协同效应，也将是研究的重点。
图2B. 总体研究方案（学术方案）
结合上述研究结果，针对工作场所吸入纳米颗粒引起呼吸系统与心血管系统损伤的分子机制，以及消费产品摄入纳米颗粒引起胃肠道与皮肤损伤的分子机制，开展系统的研究（图2B ）。选择重点靶细胞，研究不同物理化学性质的纳米颗粒对肺上皮细胞、免疫细胞、血液细胞、血管内皮细胞等的作用，对细胞结构和功能的影响。研究纳米材料对细胞凋亡信号转导的影响，通过形态学观察、显微电镜、DNA 凝胶电泳、酶联免疫（ELISA ）和TUNEL 法等检测细胞凋亡，测定细胞凋亡信号通路及相关蛋白（Bcl-2/Bcl-XL 、Fas/FasL 、TNFR/TNF- 、TRAILR/TRAIL 等）及编码基因的表达，探讨不同纳米材料、不同纳米参数对细胞信号转导途径的关系。应用代谢组学方法寻找特异性生物标志物。应用基因组学或功能基因组学技术寻找典型纳米颗粒作用的效应基因。研究它们与前面筛选的重要生物大分子的结合或作用对蛋白分子构象、功能、自组装过程的异常调控作用，以及对蛋白分子间相互识别和相互作用的干扰或影响；在细胞和分子水平 分子响应
细胞响应 脏器响应 个体响应 受体/配体作用 结合DNA 蛋白质氧化 纳米颗粒/ 小分子代谢物 -基因活化 -蛋白质合成 -改变信号 -蛋白质耗竭 -生理变化 -平衡扰动 -组织发育 -器官功能 -致死剂量 -体征变化 -繁殖影响 -致癌作用 纳米
颗粒 物理化
学特性 纳米颗粒/ 小分子间作用
上总结共性规律和作用机理，揭示决定纳米颗粒生物学效应的机理（这部分内容由课题3
承担）。
图3. 建立Nano-QSAR 数学模型探索纳米特性与生物活性的相关性 目前国内外还没有建立出合适的纳米材料生物效应的评价方法，这也是目前发展纳米技术的最大瓶颈之一。尤其是生物微环境中纳米颗粒的检测方法，细胞环境中纳米颗粒的检测方法，组织环境中纳米颗粒的检测方法，体内纳米颗粒的检测方法；在此基础上我们进一步集成上述三个方面研究结果以及所建立的实验方法，从不同的层次探索纳米颗粒生物安全性的评价原理，并筛选出一套最佳方案。第一是利用理论模拟，发展纳米材料的定量构效关系，建立数学模型以及纳米颗粒特性与生物活性的相关性（图3）；第二是建立纳米颗粒靶器官筛选的细胞系统、和基于细胞氧化应激的纳米生物安全性评价方法，建立细胞水平上的in vitro 高通量评价体系（图2B ）；第三是基于斑马鱼或线虫的纳米颗粒生物安全性评价快速检验方法，筛选出适合纳米产品毒性化验的生化指标（这部分内容由课题4承担）。
N N a a n n o o --Q Q S S A A R R 毒 毒毒性性 Y Y 纳米结构 纳纳米米颗颗粒粒特特性性 X X
项目的创新点和研究特色
1．首次开展纳米材料生产场所的系统研究：前人主要研究大剂量，急性暴露下的纳米颗粒在实验室模拟体系下引起的毒性反应，可用于“突发事故”的安全性评估，而实际生产场所中的纳米颗粒具有低剂量、长期暴露的特征。在人体暴露剂量低的情况，纳米颗粒吸入引起的机体反应是否具有可逆转性（被生物体修复）？它们与纳米特性的关系？效应逆转的临界时间与人暴露周期（如吸入时间，剂量与频度等）之间的关系？都是本项目提出的创新课题。
2．首次开展成分复杂的纳米产品的生物效应与安全性研究：本项目直接研究关乎民生的食品等消费品中纳米颗粒的生物效应，和单纯纳米材料相比，难度大，实验设计复杂，相关纳米产品安全性评估方法和预测模型，至今还是空白。
3. 研究目标直接为纳米技术面临的两大难题之一提供解决方案：目前有两大瓶颈限制了纳米技术的发展和应用：“缺乏纳米安全性知识体系与评价方法”，与“缺乏纳米尺度上的可控加工与大规模生产技术”。本研究结果将建立“相关材料的纳米安全性评价方法”，并首次为国家提出纳米材料的职业接触限值，这些目前在国际国内都还是空白。为纳米技术面临的两大难题之一提供解决方案。
取得重大突破的可行性分析
本项目依托的国内优势科研机构，研究团队在此领域已有长期合作研究的基础。在前期研究中，不仅建立了一系列已经被国际同行认可的研究方法，也取得了一系列有重要国际影响的阶段性研究结果。为本项目的实施提供了坚实基础。由于各承担单位之间优势互补、强强联合，从多种角度和多个层次上开展联合攻关，具有在这一领域取得创新性突破的良好机遇。具体如下：
1. 科学目标明确，研究起点高：本项目不仅结合了项目组成员的长期研究积累，也包含项目组成员的原创性研究思想。项目内容紧紧抓住纳米材料生物效应的核心和前沿问题，经过各承担单位的共同调研，长期跟踪分析国际发展态势，和前期研究所发现的重要共性问题，提出了明确的研究目标。在该领域，项目组是国际上具有较大影响力的研究团队，在某些方面具有引领地位，因此，本项目的研究起点高，在继承具有重大意义的前期研究结果的基础上，力攻新的突破点。
2. 研究设施齐全，实验条件具备：本项目依托单位中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室，拥有设备优良的实验室和相关大型设施。如国家纳米科学中心拥有纳米特性表征实验平台，以及纳米检测与标准化中国科学院重点实验室；中国科学院高能物理研究所具有同步辐射国家实验室各相关实验站。承担单位还拥有本项目研究所需要的实验室和各种大型设施，如：细胞和分子生物学实验室、动物实验室、专门的同位素标记实验室、透射电镜、原子力显微镜、红外光谱、拉曼光谱、核磁共振、X射线衍射仪、圆二色光谱仪、共聚焦荧光显微镜及活细胞工作站、生物质谱、小动物活体成像设备等。
3. 研究基础扎实，前期积累丰厚：由北京大学，国家纳米科学中心，高能物理研究所，上海大学，东南大学等单位组成的项目组，包括了国内最早开展纳米生物效应与安全性研究及其纳米材料生物医学应用的优势单位，在纳米材料设计与合成、纳米材料的生物效应与机理的研究、纳米材料的生物标记与检测等方面具有较深厚的积累，取得了一批重要的成果，研究基础坚实，前期积累丰厚，在国内外产生了较大的学术影响（参见“研究基础”和“国内研究现状”）。
4. 把握动态迅速，有利重大突破：项目申请人担任本领域多个国际学术组织的专家，易于把握国际最新发展动态，具备确保项目顺利实施并取得重大突破性的有利条件：本项目申请人和部分组成人员，目前应邀担任多个与纳米安全相关的国际学术组织的重要职务。如担任学术刊物Particle & Fiber Toxicology (IF-
5.4)的副主编；从2008年开始每年代表中国政府参加国际标准化组织（ISO）有关纳米安全标准的制定工作；从2005年开始，应邀担任世界经济合作组织OECD的“纳米安全工作组”专家；2006年担任联合国环境与发展署“纳米技术与环境健康专家组”专家；2007年担任欧盟科技委员会国际评审专家组专家（负责欧盟纳米毒理学与安全性方面的研究计划评审）；2008年应邀担任加拿大科学院Nanosafety Program 顾问；2009年应邀担任欧盟“纳米器件安全性专家组”专家。2010年担任美国化学会在夏威夷召开的“纳米材料健康效应”会议主席。
课题设臵
我们将项目分解成四个课题，各课题紧扣中心目标，紧密衔接形成有机整体。课题1：工作场所中纳米颗粒的释放，职业暴露与安全性研究
主要研究内容：研究工作场所纳米颗粒的释放行为和团聚行为；研究工作场所纳米颗粒的采集方法和表征方法；研究工作场所纳米颗粒经呼吸暴露的动物模型；研究低剂量长期暴露纳米颗粒与呼吸系统、心血管系统的相互作用；研究低剂量长期暴露纳米颗粒相关生物安全性评价指标。
预期目标：建立工作场所中重要纳米材料环境释放与暴露水平的检测和表征方法，发现颗粒物的动态变化规律；分析不同组成和理化性质的纳米颗粒暴露对呼吸系统、心血管系统作用的差别，探索影响其生物安全性的关键因素和共性规律。为职业场所环境卫生标准的建立提供理论基础。
课题承担单位：国家纳米科学中心，中国科学院高能物理研究所
课题负责人：陈春英，研究员，国家纳米科学中心
主要承担人员：
刘宇研究员中国科学院高能物理研究所
王国豫教授中国科学院高能物理研究所
李玉锋副研究员中国科学院高能物理研究所
宫建茹副研究员国家纳米科学中心
研究经费比例：21%
课题2：消费品中纳米颗粒的健康效应研究
主要研究内容：研究食品相关纳米颗粒的释放、转移与表征；研究食品中纳米颗粒与胃肠道系统的相互作用，在体内的动力学过程包括吸收、分布、蓄积、转运、代谢和排泄；研究食品相关纳米颗粒的健康效应，建立适合于消费品纳米材料一般毒性、致畸性、致敏性、免疫毒性等的检测方法。
预期目标：建立食品/化妆品中重要纳米颗粒的动态分布与理化性质表征，发展消费品如食品这类复杂体系中纳米颗粒进入生物体后的吸收与转运过程，揭示食品相关纳米颗粒产生的健康效应，为公众纳米食品安全使用提供指导，为国家食品消费品工业的安全健康发展提供重要数据。
课题承担单位：上海大学，北京大学
课题负责人：王海芳，教授，上海大学
主要承担人员：
刘元方院士北京大学/上海大学
曹傲能教授上海大学
贾光教授北京大学
潘登余副教授上海大学
研究经费比例：22%
课题3：纳米颗粒的生物效应与安全性分子作用机制研究
主要研究内容：研究食品纳米颗粒在胃肠道微环境中的特性变化；研究食品纳米颗粒对胃肠道中菌群的影响；研究纳米颗粒的免疫原性；研究纳米颗粒与产品添加剂以及空气污染物的复合－协同效应；研究工作场所吸入纳米颗粒引起呼吸系统与心血管系统损伤的分子机制；研究消费产品纳米颗粒摄入引起胃肠道与皮肤损伤的分子机制。
研究目标：阐明生产场所与消费品中纳米材料纳米特性与生物体交互作用的机理，揭示决定纳米颗粒生物效应的主要因素，阐明纳米颗粒的细胞生物效应的基本规律；阐明纳米颗粒与生物分子相互作用的基本过程；初步揭示决定纳米颗粒的靶分子选择性规律，阐明纳米生物学效应的分子机理。
课题承担单位：中国科学院高能物理研究所，南京大学
课题负责人：赵宇亮，研究员，中国科学院高能物理研究所
主要承担人员：
丰伟悦研究员中国科学院高能物理研究所
顾民教授南京大学
汪冰副研究员中国科学院高能物理研究所
研究经费比例：31%
课题4：纳米颗粒安全性高通量筛选方法、评价方法与评价程序研究主要研究内容：研究细胞、组织和活体等生物微环境中纳米颗粒的检测方法；研究基于细胞水平的纳米颗粒生物安全性评价方法，研究纳米颗粒理化特性与生
物活性的相关性。研究纳米颗粒靶器官筛选的细胞系统以及细胞毒性筛选的生化指标和方法。发展快速高通量纳米颗粒生物安全性评价方法：研究基于斑马鱼胚胎发育模型的纳米颗粒毒性快速检验方法；研究基于线虫模型的纳米颗粒毒性快速检验方法；研究基于氧化应激(ROS) 的纳米颗粒生物安全性评价的高通量筛选方法。理论研究纳米材料的定量构效关系；研究人造纳米材料安全性评价程序和方法。
预期目标：建立纳米产品及相关纳米材料安全性评价的研究方法；建立相关纳米材料安全性的高通量快速筛选方法；揭示纳米材料构效关系；阐明纳米颗粒与生物体、细胞、生物分子相互作用的基本过程与规律；建立人造纳米材料安全性评价程序（草案）框架。
课题承担单位：东南大学，中国科学院高能物理研究所
课题负责人：唐萌，教授，东南大学
主要承担人员：
浦跃朴教授东南大学
薛玉英教授东南大学
王大勇教授东南大学
柴之芳院士中国科学院高能物理研究所
张智勇研究员中国科学院高能物理研究所
研究经费比例：26％
四、年度计划