高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法
一、开机
1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相B瓶：为有机相。
2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。
3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。
4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。
该页面主要由以下几部分组成：
——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等；
——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等；
——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告；
——中下部为动态监测信号；
——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。
4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。
二、编辑参数及方法
1、开始编辑完整方法：
从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。
2、方法信息：
在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。
3、泵参数设定：
进入“Setup pump”画面，在“Flow” 处输入流量，如1ml/min；在“Solvent B”处输入有机相的比例如70.0，（A=100-B），也可在Insert 一行“Timetable”，编辑梯度；输入保留时间；在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。单击OK，进入下一画面。
4、DAD检测器参数设定：
进入“DAD signals”画面，输入样品波长及其带宽、参比波长及其带宽（参比波长带宽默认值为100nm）；选择Stoptime：as Pupm；
在“Spectrum”中输入采集光谱方式“store”：选All；如只进行正常检测，则可选None；范围Range：可选范围为190~950nm；步长Step可选2.0nm；
阀值：选择需要的灯；
Peak width（Response time）即响应值应尽可能接近要测的窄峰峰宽，可选“2s”或4s；
Slit-：狭窄缝，光谱分辨率高；宽时，噪音低。可选4nm
单击OK，进入下一画面。
5、进入“Signal Details”画面，单击OK，进入下一画面。
6、进入“Edit Integration Events”（编辑积分结果）画面，单击OK，进入下一画面。
7、进入“Specify report”（积分参数）画面，单击OK，进入下一画面。
8、进入“Instrument curves”画面，单击OK，进入下一画面。
9、进入“Run Time checklist”（运行时间表）画面，选择“Date Acquistition”和“Standard Date Analsis”，单击OK，完成参数设定，回到工作站画面。
10、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入文件名，单击OK。（路径：e\HPCHEM\1\methods\***）
注：如果调用一个方法，则在“Method”菜单，选中“Load method”，选方法名，单击OK。
11、从菜单“View”中选择“Online signal”，选中Window 1 ，然后单击Change 钮，将所要绘图的信号移到右边的框中，点OK。（如同时检测二个信号，则重复11，选中Window 2）。
三、运行样品
1、单击泵（Pump）图标下面的小瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积，并且选停泵体积。单击OK。
2、手动打开Purge阀：逆时针转2~3圈。
3、单击泵（Pump）图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。设Flow：5ml/min，单击OK。
4、开泵：直接点Pump图标下面的泵开关小图标，或单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump contrlo选项，选中On，单击OK。
5、系统开始排液（Purge），直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续排液，直到所有通道无气泡为止。（每个管线内液体约20ml，在5ml/min的流速下，均需4~5min才能排完）
6、单击泵（Pump）图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。把Flow改为0.5~1.0ml/min，单击OK。
7、等待流速降下来后，关闭排液阀。
8、待压力稳定后，从“Instrument”菜单中选择“System on”或单击GUI图标的On图标启动系统。开始走基线，并可选择观察信号。
注：仪器运行过程，画面颜色由灰色转变成黄色或绿色，当各部件都达到所设参数时，画面均变为绿色，左上角红色的“not ready”变为绿色“ready”，表明可以进行分析。（此时如果要终止仪器的运行，可单击流程图右下角的“off”，再单击“Yes”，关闭输液泵和检测器氘灯）。
9、单击最大化按钮，将online Plot窗口放大。待基线平稳后，点信号窗口的“Banlance”，调至零点。
10、等仪器Ready ，从“Runcontrol”菜单中选择F5或“Run method”。
11、编辑样品信息：
从“Run control”菜单中选择“Sample into”选项，选择“Sample Info…..”，即打开了样品信息页面，输入操作者（Operator Name）、数据存贮通道（Subdirectory）、样品名（Sample Name）、进样瓶号（Vial）、浓缩因子（Multipline）、稀释因子（Dilution）、，“Data file”中选择“Prefix”，在Prefix框中输入批号或日期等，在Counter框中输入计算器的起始位，仪器会自动命名。（样品量（Sample Amount）、内标量（ISID Amount）可不选，Location只对自动进样器有用，不填则走空白，检查干扰峰的来源。）
单击OK。
12、进样分析：
进样阀扳到Load位置，插入注射器，注样品，进样后扳动阀至Inject位置。
13、进样分析结束，点Close键退出样品分析。
（注意：检测完尽量要关DAD的灯，以保持灯的寿命。单击DAD图标，出现参数设定菜单，单击control ，选择关灯。）
四、数据分析方法编辑（可在offline下操作）
1、从“View” 菜单中选“Date analysis”进入数据分析画面。该页面最上方为命令栏，依次为File ，Graphics，Integration……等。命令栏下为快捷操作图标，如积分、校正、色谱图、单一色谱图调用、多色谱图调用、调用方法、保存等。
2、从“File”菜单中选“Load signal”，或单击快捷操作的“单一色谱图调用”图标，选择色谱图文件名，单击“OK”，画面中即出现所调用的色谱图。
3、做图谱优化，从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项。从Ranges中选择Auao scale及合适的显示时间，单击OK，或选择“Use Ranges”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分
（1）先调用所要分析的色谱图，从“Integration”中选择“Auto integrate”，从“Integration”中选择“Integration Results”，此时仪器将内置的积分参数给出积分结果。如积分结果不理想，再从“Integration”菜单中选择“Integration Events”选项，或单击快捷操作的“编辑/设定积分表”图标，此时，在屏幕下方左侧出现积分参数表，右侧为积分结果，在积分参数表中按实际的要求输入修改的参数，如斜率（Slope sensitivity）、峰宽（Peak width）、最小峰面积（Area reject）、最低峰高（Height reject）等。
（2）从“Integration”中选择“Integrate”选项或单击快捷操作的“对现有色谱图积分”图标，仪器即按照新设定的积分参数重新积分。
（3）若积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
（4）完成后，单击左边的“ˇ”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告：
（1）从“Report”菜单中选择“Specify report”选项，或单击最右侧快捷操作的“定义报告及打印格式”（右下角带叉的报告画面）图标，进入打印画面。
（2）根据实际要求选择报告的格式和输出形式等。可在“Calculate”右则的黑三角中选“Percent”（面积百分比），其它项不变。（如“Destination”项下选择“Screen”；“Based On”选“Area”；“Sorted By”选“Signal”；“Repirt Style”选“Short”；选择“Add chromatogram Output（打印色谱图）”；选择“With Calibrated Peaks”；选择“Portrait”；可根据需要选择“Size”）。
（3）单击OK。
（4）选择快捷操作的“报告预览”图标，可预览报告的全貌。从“Report”菜单中，选择“Print Report”，则报告打印到屏幕上，如想输出到打字机上，则单击“Print”，即可进行报告的打印。最后，单击“close”退出此操作页面。
6、定量分析
如果需要进行标准曲线制备，可按此项进行操作。
（1）一级校正表的建立：
在“Data Analysis”界面下，调用最低浓度的色谱图，在“栏“Calibration”下，选择“New Calibration Table”，选择“Automatic Setup Level”，并设校正级数为“1”，单击“OK”。在画下方左侧出现校正表，右侧为校正图。在画面左下侧的校正表中选择所要的色谱峰，输入校正级数、化学物名称及浓度，如果采用内标法，需对内标峰进行标记。单击OK，工作站提示是否删除0浓度行，单击Yes 。
（2）二级校正表的建立：
调用第二个色谱图，在命令栏“Calibration”下，选择“Add Level”，设为“2”，单击“OK”，在画面左下侧的校正表中输入校正级数、化学物名称及样品浓度。（如需对校正表中的某些数据进行重新修正，可调用新的图谱，在命令栏“Calibration”下，选择“Recalibration”，并在校正表中输入校正级数，样品浓度。）此时，校正表右侧自动绘制各组分的标准曲线，并进行线性回归。单击校正表中的“Print”，可进行打印。
五、关机
1、关机前，用过缓冲盐溶液必须先用100%的水冲洗系统（打开排液阀，调流速为5ml/min，冲洗约5 min，然后调流速为1ml/min，待流速降下来后，关闭排液阀，再冲洗冲洗约20 min）；然后用甲醇同法清洗20min，然后关泵。
注意：此方法适用于反相色谱柱，而正相色谱柱应用适当的溶剂冲洗。
2、清洗进样器：
将进样器扳至Load的位置，用专用的注射器装约10ml适当溶剂冲洗进样器。当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时扳动进样阀数次，每次数毫升。
3、退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down）。
4、关掉Agilent 1100电源开关。
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高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解
岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
高效液相色谱仪(HPLC)校正方法
高效液相色谱仪（HPLC）校正方法 0.1输液系统： 0.1.1梯度误差G C不超过±3% 0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2% 0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2% 0.2紫外检测器性能 0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU 0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5% 0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液 0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件 1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65% 1.2校正设备 1.2.1秒表分度值小于0.1 s 1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg 1.2.3容量瓶 1.2.4微量注射器 1.3标准物质和试剂 1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮 1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液 1.3.3紫外波长标准溶液 2校正方法 2.1梯度误差G C的校正 2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%， 20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100% Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值 可接受标准： -3%≤Gci≤3% 2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正 2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待 流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25
高效液相色谱法的应用
高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，
Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法
Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位
高效液相色谱方法的验证
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至
高效液相色谱仪操作步骤
高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
高效液相色谱法测定手册
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项
高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能） 注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。 注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。 注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。
游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)
八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样
高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.
最新高效液相色谱使用方法
最新高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法 一、开机 1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相B瓶：为有机相。 2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。 该页面主要由以下几部分组成： ——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等； ——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等； ——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告； ——中下部为动态监测信号； ——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。 二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。 3、泵参数设定：
高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总
高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总 1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。 6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7. 设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9．填写登记本，由负责人签字。 10．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 12．所有过柱子的液体均需严格的过滤。 13．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。 选择波长要从以下几个方面考虑： 1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。