来源于耐碱真菌Pseudallescher_省略_的碱性木聚糖酶基因的克隆_表达(1)
生物技术进展
2011年第1卷第1期61 67
Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯
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2341
研究论文
Articles
收稿日期：2011-05-03；接受日期：2011-06-03基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（2008ZX003-002）；国家肉鸡产业技术体系项目（nycytx-42-G2-05）资助。作者简介：王坤，大学专科，研究方向为微生物。E-mail ：wangkun19190@163．com 。*通讯作者：姚斌，研究员，博士，博士生导师，从
事微生物工程研究。Tel ：010-
82106063；E-mail ：yaobin@mail．caas．net．cn 来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp．JSM-2的碱性木聚糖
酶基因的克隆、
表达及其性质研究王
坤，罗会颖，石鹏君，王亚茹，杨培龙，姚
斌
*
中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京100081摘
要：从造纸废水中分离得到的耐碱真菌Pseudallescheria sp．JSM-2的DNA 为模板，利用同源克隆和TAIL-
PCR 的方法，获得了一个碱性木聚糖酶基因xyl11-1。该基因DNA 和cDNA 分别为797bp 和678bp 。该基因的推测蛋白N-端有一个18个氨基酸的信号肽序列和一个含207个氨基酸的成熟蛋白。编码成熟蛋白的cDNA 序列在毕赤酵母GS115中重组表达后，进一步纯化并进行酶学性质测定。重组XYL11-1的最适pH 为6．5，在pH 4．5 9．0范围有50%以上的酶活；在pH 4．5 12．0范围具有良好的pH 稳定性；最适温度为50?；以燕麦木聚糖为底物，比活为2618U /mg ；且对中性和碱性蛋白酶具有极好的抗性。该酶作用底物范围广，包括各种木聚糖、纤维素和葡聚糖，易于工业化发酵生产，具有在纸浆脱墨、动物饲料、鱼类饵料中的应用潜力。
关键词：Pseudallescheria sp．JSM-2；碱性木聚糖酶；基因克隆与表达；毕赤酵母DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2011．01．10
Cloning ，Expression and Characterization of an Alkaline Xylanase from
Alkali-tolerant Fungus Pseudallescheria sp．JSM-2
WANG Kun ，LUO Hui-ying ，SHI Peng-jun ，WANG Ya-ru ，YANG Pei-long ，YAO Bin *
Key Laboratory of Feed Biotechnology ，Ministry of Agriculture ，Feed Research Institute ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China
Abstract ：An alkali-tolerant fungal strain ，Pseudallescheria sp．JSM-2，was isolated from the wastewater of a paper mill．By
using degenerate PCR and TAIL-PCR techniques ，a full-length xylanase gene ，xyl11-1，was cloned from the genomic DNA of
strain JSM-2．The complete genomic and chromosomal DNA sequences of xyl11-1consist of 797bp and 678bp ，respectively．
Deduced XYL11-1contains a putative 18-residue signal peptide at N-terminus and a C-terminal 207-residue polypeptide．
Recombinant XYL11-1produced in Pichia pastoris GS115was purified and characterized．The optimal pH of XYL11-1was 6．5，and the enzyme exhibited more than 50%of the maximal activity at pH 4．5 9．0．XYL11-1was stable at pH 4．5 12．0．The
optimal temperature was found to be 50?．XYL11-1had a specific activity of 2618U /mg towards oat spelt xylan ，and was
strongly resistant to various neutral and alkaline proteases．In addition to hydrolysis of different xylans ，XYL11-1had broad
substrate specificity ，including various xylans ，cellulose and glucan．Moreover ，fermentation of XYL11-1was easily handled．
These superior properties of XYL11-1make it advantageous for applying in the animal and fish feed and kraft pulp industries．Key words ：Pseudallescheria sp．JSM-2；alkaline xylanase ；gene cloning and expression ；Pichia pastoris
半纤维素是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，木聚糖是半纤维素的重要组成
部分［1，2］
。木聚糖为线状异聚多糖，由木糖通过β-
1，4糖苷键连接而成，在其侧链上有多种取代基团，包括乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸残基等。所以其完全降解需要多种酶的协同作用［3］
。
其中，内切β-1，4-木聚糖酶（EC 3．2．1．8）以内切
方式作用于木聚糖主链，产生不同链长的寡糖及
少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶
［4］
。
木聚糖酶广泛存在动物、植物和微生物中。微生物是木聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。而天然菌株产木聚糖酶的量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。目前，已经有很多木聚糖酶的编码基因被克隆并进行了异源表达，木聚糖酶的表达量得到很大提高［2，5］。根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，木聚糖酶多被划分为糖苷水解酶第10家族或第11家族，另外，第5家族、第7家族、第8家族或第43家族的木聚糖酶也有报道［2，6］。
木聚糖酶的工业化应用始于20世纪80年代，最初作为饲料酶制剂的一种应用于饲料行业，之后扩展到如食品（面包加工、酿酒和果汁澄清等）、纺织和造纸等行业［3，5］。木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域。例如在饲料工业中木聚糖酶应选择最适pH在偏酸性范围内的，而造纸工业中，则需要碱性木聚糖酶。人们对碱性木聚糖酶的研究较晚［2］。在1973年，Horikoshi等［7］首次报道了产自细菌的木聚糖酶，从碱性细菌Bacillus sp．No．C-59-2中纯化出最适pH为6.0 8．0的木聚糖酶。此后，研究得到很多碱性木聚糖酶，这其中大多属于芽孢杆菌属中分离得到的第10和第11家族的碱性木聚糖酶［8，9］。而真菌所产生的木聚糖酶一般为酸性，最适pH多在pH3．0 5．0［5］。在2002年，Taneja 等［10］筛选到一株嗜碱真菌Aspergillus nidulans KK299，并部分纯化了其所产的木聚糖酶，最适pH为8．0，在pH4．0 9．5之间稳定。这是唯一报道的在碱性条件下有高活性的真菌来源的木聚糖酶。
本研究从山东一造纸厂的碱性废水中分离到一株耐碱真菌，对其产酶进行分析，并通过同源克隆的方法获得了其木聚糖酶编码基因，在毕赤酵母中成功进行了表达。重组蛋白经纯化进行了酶学性质的研究，获得了在碱性条件下具有高活性的真菌来源的新型木聚糖酶。
1材料与方法
1．1材料
样品是来自山东省的一个造纸厂的碱性废水。大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115由本实验室保存。载体pEASY-T3购自全式金公司，pPIC9质粒购自Invitrogen公司并由本实验室保存。限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶购自TakaRa公司；DNA 提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司；RNA提取试剂盒购自Promega公司；逆转录试剂盒购自东洋纺公司（ReverTra Ace，TOYOBO）。
实验所用培养基按照文献［11］配制，其中Pseudallescheria sp．JSM-2培养基为马铃薯汁培养基，pH10．0；富集培养基，pH10．0；大肠杆菌培养基LB，pH7．0；BMGY培养基及BMMY培养基，pH4．0。
1．2菌株的分离和鉴定
采集水样接种于富集培养基中进行富集培养。30?培养5d后用无菌水稀释至适当浓度，再均匀涂布于pH10．0的固体PDA培养基，于30?培养。将分离到的菌株转移到液体富集培养基中培养，测定木聚糖酶活力。将产木聚糖酶菌株JSM-2在PDB培养基中培养后提取基因组DNA［12］，以JSM-2基因组DNA为模板，选用ITS 通用引物ITS4和ITS1（ITS4：5'-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3'；ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCT-GCGC-3'）进行PCR扩增菌株的ITS序列，经测序后在NCBI数据库上进行比对分析。
1．3木聚糖酶编码基因xyl11-1的克隆
木聚糖酶基因的保守区片段通过简并引物获得，简并引物设计及序列参见文献［13］。以耐碱真菌Pseudallescheria sp．总DNA为模板进行PCR扩增，使用降落PCR程序［14］。为了得到编码基因全长序列，根据测序得到的核苷酸序列，利用TAIL-PCR［15］扩增保守区两侧的序列。TAIL-PCR 特异引物序列见表1。
1．4木聚糖酶基因xyl11-1cDNA序列的获得将PDA上的JSM-2接种至菌丝体液体培养基中，30?、150r/min摇床培养活化48h后转接至产酶（富集）培养基。3d后离心收集菌丝，提取JSM-2的总RNA，提取方法按照RNA提取试剂盒操作说明进行。使用逆转录试剂盒进行cDNA 第一链的合成。利用逆转录得到的cDNA一条链，设计引物（Xyl11-1F：5'-ATGTTCTACTC-TACTCTCGCCACGGTCGC-3'；Xyl11-1R：5'-TC-AAGGAGGAGACTCGACAGTGATGTGAGAG-3'）获得木聚糖酶基因XYL11-1的cDNA序列。
26生物技术进展Current Biotechnology
表1本研究所用的TAIL-PCR特异性引物
Table1TAIL-PCR primers used in this study．
引物名称引物序列引物长度（bp）usp15'-CTCGATGGAAGGCTGCTGTACACGCGTG-3'28
usp25'-GAGATTATACGTGCCTTCCGACGTCTGGAC-3'30
usp35'-GAGCTTCCGGGGTTGTACTCGCC-3'23
dsp15'-CCGTAATCCCTTGGTCGAGTACTACATCATC-3'32
dsp25'-GGAGTACAACCCCGGAAGCTCCGC-3'23
dsp35'-CGTCCAGACGTCGGAAGGCACGTATAATC-3'29
1．5木聚糖酶XYL11-1的序列分析
将获得的编码木聚糖酶XYL11-1的DNA及cDNA序列通过Vector NTI7．0软件进行比对分析。并通过Signal P程序（http：//www．cbs．dtu．dk/services/SignalP/）进行信号肽序列预测。成熟蛋白的理论分子质量及等电点通过Vector NTI 7.0软件进行预测，并利用BLAST对基因序列进行了相似性比对分析。通过ClustalW程序（http：//www．ebi．ac．uk/clustalW）和GeneDoc软件进行多序列比对。
1．6木聚糖酶基因xyl11-1表达载体的构建木聚糖酶XYL11-1成熟蛋白的cDNA编码序列通过引物Xyl11-1F-s和Xyl11-1R-s（Xyl11-1 F-s：5'-ACTGAATTCTCGCCGGCCGCCTCGCCC-TTC-3'，Xyl11-1R-s：5'-ACTGCGGCCGCTCAAG-GAGGAGACTCGACAGTGATGTG-3'，划线部分分别为Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点）扩增获得。并通过的酶切位点与表达载体pPIC9连接，获得含有Pseudallescheria sp．JSM-2木聚糖酶基因xyl11-1的重组质粒pPIC9-xyl11-1。
1．7木聚糖酶基因xyl11-1在Pichia pastoris中的表达
转化和筛选主要操作流程参照Invitrogen公司的毕赤酵母表达操作手册。重组质粒pPIC9-xyl11-1用BglⅡ进行线性化后通过电击转化毕赤酵母P．pastoris GS115。转化细胞涂布到固体MD 平板上，30?培养至转化子长出。将在MD上生长的转化子用牙签挑取按先后顺序分别点到MM 和MD平板上，30?培养2d。
重组酵母在3mL BMGY培养基中于30?摇床培养48h，离心收集菌体，加入1mL BMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体，继续30?诱导培养，48h 后取样检测各菌株上清液的木聚糖酶活性，从中筛选出表达木聚糖酶的转化子。
1．8重组木聚糖酶的活性分析
木聚糖酶酶活采用DNS法［13，16］测定，酶促反应在最适pH和最适温度条件下进行，反应时间为10min。每组反应设3个平行和一个空白对照。酶活单位定义参照文献［13］。
1．9重组木聚糖酶的纯化和性质测定
1．9．1重组木聚糖酶的纯化挑取木聚糖酶活性高重组子进行摇瓶水平表达，加入BMMY甲醇诱导表达，每24h取样测定木聚糖酶活性，并在诱导表达72h后离心收集培养上清液用于重组木聚糖酶的纯化，进行SDS-PAGE分析［17］。
毕赤酵母表达的木聚糖酶纯化方法如下：收集的菌液首先通过中空纤维进行脱盐和浓缩，再经阴离子交换柱层析纯化。用0 1．0mol/L NaCl（20mmol/L Tris-HCl溶液，pH8．5）进行线性梯度洗，分步收集洗脱峰，每管1mL，选取酶活性最高的几管进行电泳检测其纯度，以达到电泳纯的收集液作为表达木聚糖酶酶学性质研究的样品。利用Bradford法［18］测定纯化后酶液的蛋白质含量，计算出酶的比活性。
1．9．2重组木聚糖酶XYL11-1的最适pH和pH 稳定性的测定纯化的木聚糖酶的最适pH和pH稳定性的测定方法参见文献［11，13］，所用缓冲液的pH范围为pH2．2 11．0，不同pH缓冲液的配制参见文献［11］。木聚糖酶活力的测定温度为50?。在pH稳定性测定中，最终木聚糖酶活力的测定使用的pH为6．5。
1．9．3重组木聚糖酶XYL11-1的最适温度和热稳定性的测定纯化木聚糖酶的最适温度及热稳定性的测定方法参照文献［13］进行。其中最适温
36
王坤，等：来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp．JSM-2的碱性木聚糖酶基因的克隆、表达及其性质研究
度的测定是在pH6．5的缓冲液体系下进行，热稳定性测定的热处理分别在40?及50?下处理不同时间后，50?下测定剩余酶活力。
1．9．4重组木聚糖酶XYL11-1底物特异性及动力学参数的测定重组木聚糖酶XYL11-1底物特异性及动力学参数的测定参照文献［11］的方法进行。测定的底物包括不同来源的木聚糖（燕麦木聚糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖、小麦可溶性木聚糖和小麦不可溶性木聚糖）、羧甲基纤维素和大麦葡聚糖。以不同浓度（0．1%、0．2%、0．5%、0．8%和1．0%）的燕麦木聚糖为底物，pH6．5，50?下反应5min测定木聚糖酶的酶活力，利用双倒数作图法求得XYL11-1的K m值及V max。1．9．5不同金属离子化学试剂对重组木聚糖酶XYL11-1的酶活的影响不同金属离子化学试剂对重组木聚糖酶XYL11-1的酶活的影响的测定参见文献［13］。加入的金属离子或化学试剂的终浓度为5mmol/L或10mmol/L。木聚糖酶活力的测定在pH6．5、50?条件下进行。
1．9．6重组木聚糖酶XYL11-1抗蛋白酶能力测定将纯化的XYL11-1（100μg/mL）与不同的蛋白酶，包括：胰蛋白酶（pH7．6，25?），α-胰凝乳蛋白酶（pH7．8，25?），胶原蛋白酶（pH7．4，37?），枯草杆菌蛋白酶A（pH7．4，37?）和蛋白酶K（pH7．5，37?），按1?10（蛋白酶?XYL11-1，W/W）的比例混合温浴，温浴30min或60min 后，在pH6．5及50?条件下测定酶活性。
2结果与分析
2．1菌株的分离和鉴定
从碱性造纸废水的水样中筛选获得了一株产木聚糖酶的耐碱菌株JSM-2，经测定JSM-2在pH 7．0 12．0均能正常生长。采用通用引物ITS1和ITS4扩增获得574bp的ITS序列（GenBank登录号：JN002403），在NCBI数据库中进行Blastn 比对发现该菌的ITS与Pseudallescheria boydii isolate WB1173的ITS序列（GenBank登录号：DQ147774．1）的一致性为99%。结合形态鉴定，推断它属于Pseudallescheria属，命名为Pseudalle-scheria sp．JSM-2。
2．2木聚糖酶基因的克隆及序列分析
通过同源克隆方法，以JSM-2的DNA为模板得到一个长194bp的DNA片段，经Blastx比对发现，该片段与Fusarium oxysporum f．sp．lycopersici 来源的木聚糖酶基因有最高的相似性，其序列一致性为79%。根据得到的木聚糖酶的部分序列，通过TAIL-PCR的方法获得核心片段两侧的序列。将核心片段及两侧翼序列通过Vector NTI7.0软件序列拼接并结合NCBI数据库序列比对的结果，得到木聚糖酶编码基因全长序列为797bp。
利用RT-PCR获得木聚糖酶基因XYL-11-1的cDNA序列，cDNA全长为678bp（GenBank登录号：JN002404）。将木聚糖酶基因XYL-11-1的全长DNA序列和cDNA序列进行比对后发现该基因有1个内含子。木聚糖酶基因XYL-11-1 cDNA共编码226个氨基酸。利用SignalP3．0分析发现，其预测的信号肽序列为N端1 18个氨基酸。成熟蛋白质的理论分子质量为22．7kDa，预测等电点为5.9。XYL-11-1成熟蛋白序列与GenBank上的木聚糖酶序列进行同源性比较发现，与基因组测序的Magnaporthe oryzae70-15来源的木聚糖酶氨基酸序列一致性最高，为68%；与有功能验证来源于Fusarium oxysporum f．sp．Lycopersici的木聚糖酶5（GenBank登录号：AAK27974．1）氨基酸序列一致性为59%。
2．3木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达
重组木聚糖酶表达载体pPIC9-xyl11-1转化P．pastoris GS115后，共挑选了100株能在不含组氨酸（His）的培养基上正常生长的His+转化子。进一步在试管中诱导表达，通过酶活性测定，从100株重组酵母中筛选到79株表达木聚糖酶的重组子。木聚糖酶活性最高的为14号重组菌株，诱导48h后的表达量为37U/mL。将14号菌株进行摇瓶水瓶的表达，每24h取样测定酶活力，发现酶活持续增长，诱导72h后木聚糖酶力达到近100U/mL。经SDS-PAGE分析发现特异性的木聚糖酶表达条带（见图1第3泳道）。重组木聚糖酶的分子质量约为23kDa，与理论分子质量（22．7kDa）相当。
2．4重组木聚糖酶的纯化及质谱鉴定
毕赤酵母表达的木聚糖酶经阴离子交换柱层析纯化。用0 1．0mol/L NaCl（20mmol/L Tris-HCl溶液，pH8．5）进行线性梯度洗脱，木聚糖酶
46生物技术进展Current Biotechnology
图1木聚糖酶XYL11-1的SDS-PAGE 分析。Fig．1
SDS-PAGE analysis of purified recombinant
XYL11-1．
1：低分子量标准蛋白；2：经阴离子柱纯化的XYL11-1；3：重组毕赤酵母表达的培养基上清
活性主要分布在0．3mol /L NaCl 的蛋白质洗脱峰中，
并达到SDS-PAGE 电泳纯（图1第2泳道）。最终回收率为40．2%，比活为2618U /mg 。将纯蛋白质条带进行质谱分析，
其中有三条肽段（G TVQTSEGTYNLFQSTR 、VQQPSIEGTSTFNQY -
WAIR 和TGGTVDTGIFFDAWEKAGMPLGTHDY-MVVATEA-YR ）与XYL11-1的氨基酸序列完全一致，说明纯化出的蛋白质就是XYL11-1。2．5
重组木聚糖酶的性质测定
2．5．1重组木聚糖酶XYL11-1的最适pH 和pH
稳定性纯化的木聚糖酶XYL11-1的最适pH 为6．5，在pH 4．5 9．0的范围内，酶活性均能维持在最大酶活性的50%以上，
且在pH 10．0仍能检测到木聚糖酶活性，是一个在碱性范围有高活性的真菌木聚糖酶（图2-a ）。XYL11-1的pH 稳定性研究结果表明（图2-b ），其在pH 4．5 12．0的
范围内稳定，且在整个碱性范围内处理60min 后
剩余活性相当于最高活性的90%，说明XYL11-1具有非常好的耐碱性。
2．5．2重组木聚糖酶XYL11-1的最适温度和热
稳定性XYL11-1的最适温度为50?（图2-c ），在45? 60?之间能维持70%以上的酶活。其
热稳定性研究结果表明（图2-d ），在40?条件下处理60min 后，剩余酶活在60%左右，在50?处
理10min 后，木聚糖酶活性维持在最高酶活的25%
。
图2
重组木聚糖酶XYL11-
1的性质Fig．2
Characterization of purified recombinant XYL11-1．
a ：XYL11-1的最适pH 曲线；
b ：XYL11-1的pH 稳定性；
c ：XYL11-1的最适温度；
d ：XYL11-1的热稳定性
5
6王坤，等：来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp．JSM-2的碱性木聚糖酶基因的克隆、表达及其性质研究
2．5．3重组木聚糖酶XYL11-1底物特异性及动力学参数测定重组木聚糖酶XYL11-1对不同底物的水解能力发现：该酶对不同来源的木聚糖，包括：燕麦木聚糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖、小麦不可溶性及不可溶性木聚糖，均有很强的水解能力，其中对燕麦木聚糖的水解能力最强。同时还能水解羧甲基纤维素和大麦葡聚糖（表2）。
表2毕赤酵母表达的重组木聚糖酶XYL11-1
的底物特异性分析
Table2Substrate specificity analysis of recombinant
XYL11-1．
底物比活（U/mg）相对酶活力（%）燕麦木聚糖2618?105100
桦木木聚糖2594?8799?3．3
榉木木聚糖2391?4391?1．6小麦不可溶木聚糖855?1733?0．6
小麦可溶木聚糖636?3224?1．2
羧甲基纤维素209?128?0．5
大麦葡聚糖49?1．52?0．1
重组木聚糖酶XYL11-1在50?、pH6．5条件下，以燕麦木聚糖为底物的K m值和V max分别为4．05?0．23mg/mL和1127?19μmol/min·mg。2．5．4各种金属离子和化学试剂对木聚糖酶XYL11-1的活性影响不同浓度的金属离子和化学试剂对重组木聚糖酶XYL11-1的活性影响的实验结果表明：在5mmol/L的浓度的情况下，Cu2+和β-巯基乙醇对木聚糖酶XYL11-1的激活作用明显，酶活分别为对照组的141%和125%。Ni2+、Mn2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cr2+和Pb2+对XYL11-1的酶活有轻微的抑制作用（＜10%）。SDS或EDTA可抑制木聚糖酶XYL11-112% 16%的酶活力。10mmol/L的β-巯基乙醇对酶活也有明显的激活作用，而Fe3+、Mn2+和SDS对木聚糖酶XYL11-1活力的发挥有部分（＜40%）抑制作用，且10mmol/L Cu2+对酶活的抑制作用达60%以上。Hg2+则完全抑制了XYL11-1的酶活。2．5．5各种蛋白酶对木聚糖酶XYL11-1的活性影响实验结果表明木聚糖酶XYL11-1用胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶和蛋白酶K 处理30min或60min后，木聚糖酶的活力均维持在90%以上。枯草杆菌蛋白酶A处理后的XYL11-1的酶活是处理前的70% 80%。说明XYL11-1有很强的抗蛋白酶降解的能力。
3讨论
随着DNA序列数据库的迅速膨胀，已鉴定出大量的不同来源的木聚糖酶基因。对一些木聚糖酶基因的功能已经进行了研究，其中，真菌来源的木聚糖酶多为酸性，其发挥活性的pH范围从酸性到中性［5］。已有报道，来源于嗜碱真菌Asper-gillus nidulans KK299的木聚糖酶为碱性木聚糖酶，但还没有进行相关基因克隆和表达［10］。本研究的XYL11-1是来源于耐碱真菌的糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶，其在中性及碱性条件下具有高活性，是迄今报道的第二个在碱性条件下有高活性和稳定性的真菌木聚糖酶。
据报道，位于活性中心作为质子供体和进行亲核攻击的氨基酸残基的pKa值会限制酶发挥功能的pH范围［19，20］。因此，活性中心附近的带电荷氨基酸或芳香族氨基酸可能是影响酶的酸碱性的一个重要因素，它们可能会影响催化氨基酸的pKa或影响酶对底物的结合［21］。XYL11-1的2个谷氨酸残基的pKa值分别为5．6和8．2，比多数酸性木聚糖酶的pKa值要高。另外，嗜酸木聚糖酶的碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）含量在3%左右，而XYL11-1有更多的碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸，6．3%）。高的pKa值和高的碱性氨基酸含量可能是导致XYL11-1在碱性条件下有高活性的原因。
XYL11-1除具有木聚糖酶活性外，还具有较高的纤维素和葡聚糖酶活性，底物作用范围广。以前的研究中人们发现，糖苷水解酶第10家族的木聚糖酶多具有纤维素酶活性，而具有高纤维素和葡聚糖酶活性的第11家族木聚糖酶还未见报道。2010年，Shi等［22］报道了第10家族的木聚糖酶具有高活性的葡聚糖酶活性，分析其原因可能是与底物结合的口袋比较大，既能接受较小分子的木聚糖，也能接受较大分子的葡聚糖。而XYL11-1具有高纤维素和葡聚糖酶活性的原因需要做进一步的研究。
研究中还发现木聚糖酶XYL11-1的热稳定性较差，这也是目前所报道的第11家族木聚糖酶普遍存在的问题［2，5］，但这并不是限制木聚糖酶
66生物技术进展Current Biotechnology
广泛应用的决定因素。现在通过基因工程、酶工程等对木聚糖酶分子进行改造，可使其热稳定性得到显著提高［23，24］，从而能更好地满足工业生产的要求。
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王坤，等：来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp．JSM-2的碱性木聚糖酶基因的克隆、表达及其性质研究
QS2631内切-β-1,4-葡聚糖酶(Cx)活性测定试剂盒说明书
货号：QS2631 规格：50管/24样 内切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性测定试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： Cx存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份之一，Cx主要作用于非晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物，随机水解糖苷键，将其分解成葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和其他寡聚体。 测定原理： 采用3,5－二硝基水杨酸法测定Cx催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 样品测定的准备： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 混匀， 90℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），冷却后，测 540nm 下吸光值 A，计 算ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。 第1页，共2页
木聚糖酶及其应用
木聚糖酶及其应用 姓名：程婷婷学号：20083768 班级：食品科学与工程专业08级本科2班摘要：木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的主要成分，是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源。木聚糖木聚糖结构复杂，完全降解需要多种酶的参与，其中β-1，4-内切木聚糖酶能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶,在食品、制浆造纸、饲料等行业上有着广阔的应用前景.本文主要从木聚糖酶的分类、特性及其应用等方面进行阐述。 关键词：木聚糖酶；分类；特性；应用 木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β-1， 4键连接的半纤维素，富含于阔叶树和大多数一年生植物体内，是一种重要的可再生资源，仅次于纤维素。它多为异聚多糖，结构变化范围很大，从β-1，4糖苷键相连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。目前，木聚糖酶主要由微生物生产，已报道能生产木聚糖酶的微生物有丝状真菌、细菌和链霉菌等。微生物产生的木聚糖酶具有多样性，即常常产生不止一种类型的木聚糖酶，而且这些木聚糖酶的特性也存在差异。木聚糖酶可广泛应用于食品、制浆造纸、饲料等行业。 1木聚糖酶的分类 1.1木聚糖酶 木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，主要包括三类:内切-β-1,4一木聚糖酶，作用于木聚糖和长链木寡糖，从β-1,4一木聚糖主链的内部切割木糖苷链，从而使木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖;外切-β-1,4一木聚糖酶，作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产物为木糖; β-木糖苷酶,该酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基[1]。 1.2根据所水解的木聚糖苷键类型 木聚糖酶可分为β-1,4糖苷键木聚糖酶和β-1,3糖苷键木聚糖酶两类。陆上植物的木聚糖酶均属β-1,4糖苷键木聚糖酶，而β-1,3糖苷键木聚糖酶大都
(完整版)木质素酶活力的测定方法
1前言 草菇是一种著名的食用菌，营养丰富，味鲜美，深受人们的喜爱。草菇子实体含有人体必需的8种氨基酸，占其他氨基酸总量得38.2%，还含有14种维生素[1]，不愧为一种比较理想的天然保健食品。草菇喜高温高湿，生长速度快，生长周期短，一糙只需25天左右，在广西每年4月至9月均可以种植，是一种很有发展前途的食用菌，生产和市 场前景广阔。 栽培草菇的生物学效率比较低（鲜菇与栽培料的比值），用稻草栽培草菇的生物学效率大都在10—15%左右。过去研究认为草菇主要利用纤维素、淀粉，不大利用半纤维素以及木质素。因为草菇的半纤维素酶活性低，又缺乏降解木质素的酶类，但是农作物秸杆中一般含有半纤维素15—30%，木质素占10—30%。为此，本试验用透明圈法、氧化圈法观 测V 展1、V 展2 、V 展3 、V 6 、V 广 、V 11 六个菌株所产的胞外酶利用分解半纤维素，木质素的能 力，看是否能够从其中初步筛选出利用半纤维素、木质素较强的菌株来。探讨更合理地配制栽培料的途径对提高草菇的生物转化率有重要意义。 2 实验原理 半纤维素是由五个碳原子为主的木糖聚合的高分子化合物，经木聚糖酶降解利用之后，基质生成透明圈[2]。木质素是以苯环为基本结构的复杂大分子的有机化合物，含碳60—66%，在多酚氧化酶、过氧化酶降解后，能与愈创木酚进行反应生成棕红色或棕褐色轮环[3]。亮兰试剂与蛋白质结合兰青色、在与过氧化酶作用则呈黄色透明圈[4]。通过相应的平板基质培养，草菇菌丝分泌的酶类降解利用后，形成的透明圈迟早、直径大小、色泽深度等初步判断是否存在半纤维素酶和木质素酶降解酶类及其活性。 3 材料与方法 3.1 材料 3.1.1 菌株 V 9购至广西大学微生物研究所，V 广、 V 11 购至广西农业科学院生物技术研究所，V 展1 、 V 展2 、V 展3 采至广西现代农业展示中心经组织培养所得。 3.1.2 试剂 可溶性淀粉、亮兰溶液自配、半纤维素自已提制、愈创木酚为国产分析纯、木聚糖为进 口。 3.2 试验方法 3.2.1 试剂配制 3.2.1.1 亮兰溶液配制
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。 纤维素酶DNS酶活力测定方法 DNS, 活力, 纤维素酶, 测定 1 定义" |0 `. y6 t9 b" ^ 2 x 1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。 2 原理 纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。! Y" m& p' q; I& K B& e$ T( B4 } 3.试剂和溶液 3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定） 3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液 取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。4 C) c+ }( l2 R( M( p! L 3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）; h1 a. l3 Z3 k6 t2 | 4仪器和设备 4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃) 4.2分光光度计 含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。$ ]1 h& A) p) K 5测定步骤 5.1 标准曲线绘制. [* |! P6 u* G& u2 ^6 J4 Q 分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。1 H, `% F/ `7 X/ U. W 5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定） 1 L- {5 h8 W; q+ V4 u2 Y 5.3 比色测定 精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。 同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。 6.计算0 W+ i$ S: }( _1 o7 ], R5 m( N
木聚糖酶研究进展
木聚糖酶研究进展 刘亮伟 河南农业大学生命科学学院 郑州 450002 文化路 95 号llw321@https://www.wendangku.net/doc/3415012329.html, 科学技术的进步给21世纪的人类带来了便利,也给人类带来了前所未有的压力：人口膨胀、能源危机、环境污染、资源匮乏，所有这些问题的本源是能源危机。与能源匮乏相矛盾，自然界通过光合作用赋予人类大量可再生资源：如纤维素和半纤维素，作为继纤维素后第一大生物资源的半纤维素在农业和木材工业中是常见的废弃物，它作为可再生资源的一个有利条件是它比纤维素更易于提取和水解。秸秆中半纤维素含量占其总干重的25～50%，其化学结构较纤维素复杂得多，由D-木糖通过β-1,4-糖苷键相连成的主链和少量L-阿拉伯糖侧链所组成[1]，这种D-木糖单元在硬木和软木中平均聚合度分别是150－200和70－130，要得到能够利用的单糖必须通过以木聚糖酶为主的半纤维素酶系协同作用进行水解而完成[2]。 内切-1,4-β-木聚糖酶（E.C 3.2.1.8）是一种内切糖苷酶，能够水解木聚糖这类自然界中最丰富的半纤维素，同自然界中五碳糖的循环相联系，在能量循环中占有重要地位。在古代人们就已经在生产过程中间接地利用各种酶进行生产：如酿酒、制作奶酪、烘焙面包、修饰淀粉等。1986年，Viikarri发现了木聚糖酶在纸浆漂白和造纸工业中能够降低环境污染物品的用量[3]，伴随着人类对于可持续性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用明显增加，在1997-2002年间的5年中，纸浆造纸业用酶由1.0亿美元增加到1.92亿元，增长率为16.2%，是所有酶制品行业中增长率最快的。 1木聚糖酶的应用 1.1在纸浆造纸工业中应用 木聚糖酶最重要的用途是在纸浆造纸工业中对于纸浆的漂白。因为环境污染最大的来源是纸浆造纸工业中的废水。根据资料显示仅仅美国每年用于纸浆漂白的氯化物或次生氯化物用量就有200多万吨[4]。因为纸浆漂白污水中含有有毒物质，并且这些物质能在生态系统的生物和非生物组成中积累，如氯苯、氯二苯和其它氯化木质素次生物[5; 6]。这些化学物质对环境危害很大，据有关研究显示既便是远离造纸厂10公里以外的鱼群都会受到纸浆漂白污水中有害物质的负面影响[7]，这种受到污染的鱼可以直接或间接地影响人类的身体健康。木聚糖酶的作用就是对木聚糖进行水解从而加快了纸浆中木质素的释放，色素物质所以能够比较容易地从纤维素中释放出来。经实验证实，木聚糖酶的漂白效果比木质素降解酶好得多，这是因为木质素大部分交联在半纤维素上，而半纤维素比木质素更容易解聚[8]。利用木聚糖酶相应地比其它酶进行多聚物降解时，碳水化合物水解速度要快2-3倍[9]。经木聚糖酶处理后的纸浆漂白可以降低20%-40%漂白剂用量 [10]。
木聚糖酶的酶活测定
木聚糖酶的酶活测定方法 一、原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的木聚糖酶的活力成正比。 酶活定义方法 木聚糖酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化木聚糖水解生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。 二、实验试剂 榉木木聚糖（sigma），木聚糖酶（苏柯汉），木糖 50mmol NaAC-HAC、DNS试剂、50mmol柠檬酸-Na2HPO4、50mmol甘氨酸-NaOH DNS（1L）配置方法： 取3,5-二硝基水杨酸6.3g溶于500ml水中，45℃水浴溶解后，加2mol/L的NaOH 262ml，不停搅拌，然后加入185g酒石酸钾钠，溶解后加入5g结晶酚（或6.25ml 80%的苯酚），溶解后加入亚硫酸钠5g，搅拌至溶解后冷却定容至1L。4℃保存，7天后可用，若有絮状物请过滤后使用，有效期为6个月。 50mmol NaAC-HAC：称取3.402gNaAC·3H2O 溶于蒸馏水中，定容至500ml；用移液器移取1.428ml HAC溶于蒸馏水中，定容至500ml。两者按V（NaAC）：V（HAC）≈2:1 体积配比，用pH计调节到pH5.0。 50mmol柠檬酸-Na2HPO4：称取柠檬酸5.2535gNa2HPO4 4.477g，溶于蒸馏水中定容至250ml；称取柠檬酸5.2535g溶于蒸馏水中定容至500ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。50mmol甘氨酸-NaOH：称取甘氨酸0.3735g溶于蒸馏水中，定容100ml；称取NaOH 0.200g 溶于蒸馏水中，定容100ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。 三、仪器 水浴锅、分光光度计、电热套、烧杯、具塞刻度试管、移液器、电子天平 四、标准曲线的绘制 1、木糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水木糖（预先在105℃干燥至恒重），用 少量蒸馏水溶解后，定容转移到100ml容量瓶中，再定容至刻度，摇匀，浓度为1mg/ml。 2、按下表制木糖标准曲线 表1、木糖标准曲线 五、酶活测定 1、样品制备
食品生物化学 木聚糖酶及其应用
附件一: 新疆农业大学 专业文献综述 题目: 木聚糖酶及其应用 姓名: 全莉 学院: 食品科学与药学学院 专业: 食品科学与工程 班级: 食科112班 学号: 114031226 指导教师: 蓬焕明职称: 副教授 20012 年12 月20 日 新疆农业大学教务处制
木聚糖酶及其应用 姓名：全莉指导老师：蓬焕明 摘要：木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的主要成分，是仅次于纤维素的第二β-1，4-内切木聚糖酶能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶,在食品、制浆造纸、饲料等行业上有着广阔的应用前景.本文主要从木聚糖酶的分类、特性及其应用等方面进行阐述。 关键词：木聚糖酶；分类；特性；应用 引言：丰富的可再生资源。木聚糖木聚糖结构复杂，完全降解需要多种酶的参与，其中木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β-1， 4键连接的半纤维素，富含于阔叶树和大多数一年生植物体内，是一种重要的可再生资源，仅次于纤维素。它多为异聚多糖，结构变化范围很大，从β-1，4糖苷键相连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。目前，木聚糖酶主要由微生物生产，已报道能生产木聚糖酶的微生物有丝状真菌、细菌和链霉菌等。微生物产生的木聚糖酶具有多样性，即常常产生不止一种类型的木聚糖酶，而且这些木聚糖酶的特性也存在差异。木聚糖酶可广泛应用于食品、制浆造纸、饲料等行业。 正文： 1 木聚糖酶的分类 1.1木聚糖酶 木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，主要包括三类:内切-β-1,4一木聚糖酶，作用于木聚糖和长链木寡糖，从β-1,4一木聚糖主链的内部切割木糖苷链，从而使木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖;外切-β-1,4一木聚糖酶，作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产物为木糖; β-木糖苷酶,该酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基[1]。 1.2 根据所水解的木聚糖苷键类型 木聚糖酶可分为β-1,4糖苷键木聚糖酶和β-1,3糖苷键木聚糖酶两类。陆上植物的木聚糖酶均属β-1,4糖苷键木聚糖酶，而β-1,3糖苷键木聚糖酶大都存在于海藻及海洋生物中。按木聚糖酶的序列同源性和疏水族，木聚糖酶分别属于糖苷水解酶的两个家族，即F家族(10家族)和G家族(11家族),属于同一家族的木聚糖酶催化区域具有同源性，可以根据已知家族的酶来推测未知酶的催化特性[2]。F家族的木聚糖酶分子量高，结构复杂，通常生成较小的低聚糖，该家族的木聚糖酶可以作用于对硝基苯和对硝基苯纤维二糖，与底物结合需要较少数量的点;G家族的木聚糖酶则对木聚糖有很高的特异性。 1.3 依据木聚糖酶对底物的特异性 木聚糖酶可分为特异性木聚糖酶和非特异性木聚糖酶。特异性木聚糖酶特异作用于木聚糖底物，非特异性酶除作用于木聚糖外，还能作用于纤维素及人工底物，称双功能酶。
酶活测定方法
酶活测定方法 还原法 酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加 化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。 色原底物法 通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。 粘度法 该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常 情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子 使其粘度大为降低。基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。 高压液相色谱法 酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行 色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物 的含量,从而换算出酶活力的数值。 免疫学方法 常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。 免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂 家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。 琼脂凝胶扩散法 将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在 琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。 蛋白酶活力的测定
蛋白类木聚糖酶研究进展
蛋白类木聚糖酶抑制剂研究进展 专业：09生物工程班级：09级1班作者:许斌指导老师：龚妍春 摘要：木聚糖酶已广泛应用于饲料、食品加工、纸浆漂白等领域, 然而近年研究小麦等谷物中存在一种能抑制木聚糖酶活性的蛋白质性质的成分, 称为木聚糖酶抑制蛋白。木聚糖酶抑制蛋白具有多型性, 但不同类型抑制蛋白都只作用于外源木聚糖酶,而对谷物内源性木聚糖酶没有抑制作用。这就对木聚糖酶应用领域中酶功效的发挥提出了挑战: 抑制蛋白的存在是否影响外加木聚糖酶的作用? 本文综述了三类木聚糖酶抑制蛋白的分子结构抑制特性，阐明蛋白类抑制剂与木聚糖酶之间的互作机理, 为最大限度的发挥木聚糖酶功效奠定理论基础。简要介绍了木聚糖酶抑制蛋白对谷物的影响作用。 关键词:木聚糖酶;木聚糖酶抑制蛋白;抑制特性 1.引言 木聚糖作为植物中的一种主要的非淀粉多糖，含量仅次于纤维素，是自然界中第二大丰富的多聚糖。木聚糖是植物细胞壁多糖中半纤维素的主要成分，主链由D- 吡喃型木糖残基通过B-1, 4-糖苷键连接而成，主链上一般还带有少量的乙酰基、葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基等侧链取代基[1]。内切B-1-4木聚糖酶(EC3.2.1.2，简称木聚糖酶) 是专一性水解木聚糖主链的酶，将大分子木聚糖降解成低聚木糖、木二糖及少量的木糖，木聚糖酶主要由微生物产生，但一些藻类、原生动物、甲壳类动物和植物等也能产生木聚糖酶。根据催化结构域氨基酸的同源性和疏水簇分析法，木聚糖酶可分为GH10家族（包括植物酶类、真菌酶类和细菌酶类等）和GH11家族（包括真菌酶类和细菌酶类）2个家族。已知的禾谷类所产的木聚糖酶都属于GH10 家族，而微生物产生的木聚糖酶则属于F10 或G11 两个家族[2]。木聚糖除了在饲料工业中应用之外，在造纸制浆、食品加工等领域均有涉及。然而, 近年的研究发现微生物木聚糖酶的活性在体外试验中会被来自小麦等谷物的一种蛋白质性质的成分所抑制, 这种成分即木聚糖酶抑制蛋白。由于实验室应用试验所加木聚糖酶的量总是大于实际应用过程中的酶用量, 因此可以推测实际应用中外加的木聚糖酶也会受到基质中抑制蛋白的抑制作用, 从而影响用酶工艺过程[3]。许多有益微生物产生的木聚糖酶已经广泛应用于饲料面包焙制淀粉加工纸浆生物漂白等领域，而植物病原菌的木聚糖酶有方面作用:
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
木聚糖酶
木聚糖酶 本品精选优良菌株，经液体深层发酵精制而成的高效浓缩酶制剂。适用于饲料、食品、酿造、果蔬汁加工、纺织等行业。 作用原理 木聚糖是一种多聚五碳糖，为半纤维素的主要成分之一。木聚糖酶是一类降解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键的酶系，主要包括内切β- 1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切β-1,4-木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1,4-木糖苷键，其主要水解产物为低聚木糖和少量木糖。β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。木聚糖彻底降解为木糖需要这两种酶的共同参与。 理化性质 外观：黄色或白色粉剂及黄色液体. 作用pH范围：pH3.0-7.0，最适pH为5.0 作用温度范围：30-75℃，最适温度为50℃。 产品酶活 木聚糖酶酶活：1~30万u/g 酶活单位(U)定义：在50℃、pH5.0条件下，每分钟水解木聚糖产生1μg还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位。 使用方法 本品可应用于饲料、食品、酿造、果蔬汁加工，植物提取、纺织等行业。因应用领域和生产条件等不同用量与用法而有所改变。用户也可以结合自己的工艺条件通过试验确定最佳使用方案。 5.包装规格
25kg/桶。 6.运输与贮存 运输时应避免日晒，贮存于阴凉干燥环境中（25℃以下可保存18个月）。 中性蛋白酶 中性蛋白酶采用枯草芽孢杆菌经深层发酵提炼而成。广泛应用于酒精、啤酒、味精、淀粉糖、发酵工业的液化以及纺织、印染退浆等. 一、产品性状: 1 、产品规格： 固体型分为 50000--100000u/g 。. 2、 1g固体酶粉在30℃，pH7.5条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸所需的酶 量为1个酶活力单位，以u/g表示。 二、产品特性: 1 、热稳定性：最适作用温度40℃～50℃ 。 2 、 PH 稳定性：最适作用pH6.5～7.5，PH5.0 以下失活严重。 三、应用工艺（根据试验情况进行调整） 1、饲料用酶：该酶与a-淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、糖化酶等复合使用。可以广泛应用于仔猪、育成猪、禽类、鱼类饲喂。参考用量为3-10u/g。 2、用于皮革脱毛：酶脱毛（35-42℃，pH7.5，20-25u/ml）→水洗→浸酸→揉制。 3、用于胶片回收：45℃，pH7.0-7.5，用20-23u/ml进行回收。 4、用于丝绸脱胶：预处理→脱水→酸处理（蛋白酶18-24u/ml，肥皂0.75%， 48-50℃，30-60分钟，pH 7-8）→脱水→扯皮→冲洗→脱水→抖松→烘干→抖松。 5、医药工业：含中性蛋白酶的药物，可起到消炎、利胆、止痛、助消化的功效。 6、焙烤行业的应用：改善成品的光泽，结构均匀一致，口感松爽酥脆。 四、注意事项 1、此产品可完全溶于水，使用安全可靠。操作时请勿直接与酶制剂接触，若有
木聚糖酶活力特性研究
木聚糖酶活力特性研究 郑翔鹏 （福建省燕京惠泉啤酒股份有限公司） 概况 木聚糖酶分子只含一个亚基，分子量在8～30kD间的为碱性蛋白，分子量在30～145kD 间的为酸性蛋白。PI值为3～10.5，稳定pH值为3～10，反应最适pH值在4～7之间，最适温度为40～60℃。离子通过改变酶的构象影响木聚糖酶的稳定性，一般情况下,Ag+ (离子浓度1 mmol·L - 1 ,抑制酶活达100% ) 、Hg2 + (离子浓度1 mmol · L - 1 , 抑制酶活达7013% ) 、Cu2 + (离子浓度2. 00 mg·ml- 1 ,抑制酶活达25. 42% )等离子抑制木聚糖酶的活性,Mg2 + (离子浓度2. 00 mg·ml- 1 ,提高酶活达6% ) 、Mn2+ (离子浓度1 mmol·L - 1 ,提高酶活达24% )等离子则能提高木聚糖酶的活性。Ag+ 、Hg2 + 、Cu2 +等离子主要通过改变酶分子中2SH基团的还原态或直接攻击酶分子中的某些氨基酸残基,改变酶的构象来抑制木聚糖酶的活性， Mg2 + 、Zn2 +等则通过影响酶与底物的结合及解离状态,提高酶的活性,其具体机制还有待进一步研究。 木聚糖酶的分子结构由功能结构域和连接区构成。其中，功能结构域由催化结构域和纤维素结合结构域构成，纤维素结合结构域可改变酶对可溶或不溶底物的活力。根据结构域的相似性，木聚糖酶可通过结构域的改组和随后结构域的修饰而进，许多木聚糖酶具有纤维素酶的活性。木聚糖酶与木聚糖的结合利用离子间的静电作用。木聚糖含有的4-O-甲基葡糖醛酸带负电，木聚糖酶在pH低于PI时带正电荷，易于结合，而在pH值高于PI时，则不易结合。其反应为典型的酸碱亲核水解反应。 木聚糖酶特性分析 在对木聚糖酶的特性分析中，着重分析酶活力与温度、PH值、钙离子对酶活力的影响。 1.1木聚糖酶活力分析 对于木聚糖酶活力的分析，国标中没有相应的推荐方法。目前，主要采用分光比色测定反应液颜色的强度来定量分析酶的活力。木聚糖酶活力单位是指在50℃、pH值为5.3的条件下，每分钟从浓度为10mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。 吸取水1.0ml，加入DNS试剂3.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，制成标准空白样。分别吸取木糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，分别用水定容至100ml，配制成浓度为0.10～0.50mg/ml木糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00ml （做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入3mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。 固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。液体试样可直接称取。称取试样，精确至0.001g。加入250ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液定容至500ml，在4℃条件下避光保存12h，过滤。再用缓冲溶液做二次稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04～0.08U/ml之间）。
木聚糖酶分子结构与重要酶学性质关系的研究进展
21卷1期2005年1月 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal o f Biotechnology V ol.21 N o.1 January 2005 Received :July ,13,2004;Accepted :September ,16,2004. This w ork was supported by G rant from Chinese National Programs for H igh T echnology Research and Development (863)(N o.2001AA214041). 3C orresponding author.T el :86210268975126;E 2mail :yaobin @https://www.wendangku.net/doc/3415012329.html,. cn 国家高技术研究与发展计划(863计划)项目资助(N o.2001AA214041)。 木聚糖酶分子结构与重要酶学性质关系的研究进展 R ecent Advances in Structures and R elative E nzyme Pro 2 perties of X ylanase 杨浩萌1 ,姚 斌 13 ,范云六 2 Y ANG Hao 2Meng 1,Y AO Bin 13and FAN Y un 2Liu 2 11中国农业科学院饲料研究所, 北京 10008121中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081 11F eed Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China 21Biotechnology Research Center ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China 摘 要 木聚糖是一种多聚五碳糖,是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶,它在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有着广阔的应用前景。随着分子生物学、结构生物学的发展及蛋白质工程的应用,对木聚糖酶结构和功能的研究不断深入。这里重点阐述与酶的活性、热稳定性、作用pH 、等电点、底物亲和性及催化效率等重要性质相关的分子结构研究进展,讨论了其进一步的研究发展方向。研究木聚糖酶结构与功能的关系,对进一步加深木聚糖酶作用机制的了解、指导木聚糖酶的分子改良有重要意义。关键词 木聚糖酶,结构与功能,催化残基,热稳定性,pH 性质,底物亲和性中图分类号 Q556 文献标识码 A 文章编号100023061(2005)0120006206 Abstract X ylanase can hydrolyze xylans into xyloolig osaccharides and D 2xylose ,and has great prospect for applications in feed industry ,paper and pulp industry ,food industry and environment science.The study of xylanase had been started in 1960’s.W ith the development and application of the new technologies ,such as m olecular biology ,structural biology and protein engi 2neering ,many progresses have been made in the research of structures and functions of xylanase.This paper reviews the research progress and trend in the structure correlating with the im portant properties of xylanase.Analyses of three 2dimensional structures and properties of mutants have revealed that glutam ine and aspartic acid residues are inv olved in the catalytic mechanism.The therm ostability of xylanase correlated with many factors ,such as disulfide bridges ,salt bridges ,aromatic interactions ,cotent of arginine and proline ,and some multidomain xylanase have therm ostability domains in N or C term inal.But no single mechanism is responsible for the remarkable stability of xylanase.The isoelectic points and reaction pH of xylanase are in fluenced by hydropho 2bicity and content of electric charges.M any researches had dem onstrated that aromatic am ino acid ,histidine ,and tryptophan play an im portant role in im proving enzyme 2substrate affinity.The researches of structures and functions of xylanase are of great signifi 2cance in understanding the catalytic mechanism and directing the im provement of xylanase properties to meet the application requirement. K ey w ords xylanase ,structure and function ,catalytic residures ,therm ostability ,pH properties ,substrate affinity
文献综述木聚糖酶的研究及应用前景
木聚糖酶的研究及应用前景 （张海珍1吴萍2） （张海珍江苏省灌云县伊山高级中学 222200 吴萍安徽科技学院生命科学院 233100） 摘要：对木聚糖酶的特性及其在国内外的研究进展作了介绍，详细阐述了木聚糖酶在造纸、食品、饲料、酿酒、烘烤等工业及其在生产单细胞蛋白、生物制药、液体或气体燃料、糖浆、饮料等方面的巨大潜力及十分诱人的应用前景。 关键词：木聚糖酶特性研究进展应用前景 木聚糖酶（endo—1,4—β—D—xylan xylanohydrolase, EC. 3. 2. .1. 8）是一类以内切方式降解木聚糖分子中的β—1 ,4--木糖苷键的水解酶类。该酶在造纸工业上可用于预漂纸张，提高木素溶出率，改善纸张性能且减少环境污染。在食品工业中利用木聚糖酶降解半纤维素的主要成分，木聚糖生产低聚木糖具高附加的产品。在饲料工业中可提高饲料的能量值和禽。畜对饲料的利用率，并且在饮料和制药，溶剂，糖浆，气体或液体燃料等行业中也具有巨大潜力，其前景十分诱人。因此，木聚糖酶的开发具有重要的经济和社会价值意义。 1．木聚糖酶的特性 木聚糖酶（endo—1,4—β—D—xylan xylanohydrolase,EC·3·2·1·8）是一类以内切方式讲解木聚糖分子中的β—1，4—木糖苷键的水解酶类。包括内切β—木聚糖酶、外切β—木聚糖酶和β—木二糖苷酶。其主要水解产物为木二糖和木二糖以上的低聚木糖，还有少量木糖和阿拉伯糖。[1] 木聚糖酶按其序列同源性和疏水族分析属于糖苷水解酶的两个家族，即F家族（10家族）和G家族（11家族），属于同一家族的木聚糖酶催化区域具有同源性，可根据已知家族的酶来推测未知酶的催化特性。F家族的木聚糖酶分子量高，复杂，通常产生较小的聚糖；F家族则具有较高的特异性[4,10]。 木聚糖酶体（xylanosome）是在微生物表面分离到的多酶复合体。[2]这些复合体在半纤维素的降解中起重要作用。现在已知能够产木聚糖酶的微生物包括细菌、真菌、黑曲霉、木霉等。不同来源的木聚糖酶催化特性是有差异的，它们各自有其不同的PH值和最适温度。已证实放线菌和细菌的最适生长和产酶PH 接近于中性；耐碱性杆菌PH值在9—10；而真菌却较适合酸性条件[15]，且能分泌胞外木聚糖酶的水平高于酵母菌[10,11,12]和细菌[2,13]，从而格外引起研究人员的关注。
木聚糖酶作用机理
木聚糖酶作用机理及区分木聚糖内外切酶测定方法探讨2007-08-01 13:01:27 作者：汤海鸥来源：挑战部文字大小：【大】【中】【小】 近年来，木聚糖酶以其特有降解阿拉伯木聚糖，消除阿拉伯木聚糖对动物的抗营养作用，已成为一种在养殖业中广泛应用的酶制剂。特别是基因工程菌株性木聚糖酶以其稳定性好，降解效率高等特点引起了人们的广泛关注。然而木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，要想很好的应用木聚糖酶制剂产品，必须对木聚糖酶的作用机理有较深的了解。同时，在实际生产应用中木聚糖内切酶和外切酶的协同作用对木聚糖降解至关重要，但对于如何应用检测方法去区分木聚糖内外切酶的性质却很少关注。由此，本文首先从分子角度对木聚糖酶的作用机理进行了论述，然后对区分木聚糖酶系中内切酶和外切酶的检测方法进行了探讨，意欲对木聚糖酶制剂产品在生产上更好的应用提供帮助。 1. 木聚糖酶作用机理 木聚糖是由β－1,4或β－1,3糖苷键连接的一种杂合多聚分子。主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连，侧链上连着多种不同大小的短的取代基,主要有乙酰基、4-甲基-D-葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中其它几种结构性多糖(如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等)以共价或非共价键连接,组成植物细胞重要的结构——细胞壁。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中,处于木质素及其它多聚糖之间,起着连接作用。也正由于这些侧链的不同,使得木聚糖的结构变化范围很大,从仅由β-1,4-糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。因此，要使木聚糖完全降解则需要多种水解酶的协同作用，这其中包括主链水解酶β－D －1,4内切木聚糖酶、β－D－1,4外切木糖苷酶和侧链水解酶a－L－阿拉伯呋喃糖苷酶、a－葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等。 木聚糖降解时，起主要作用的酶是β－D－1,4内切木聚糖酶和β－D－1,4外切木糖苷酶。β－D－1,4内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β- 1，4木糖苷键,其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等；β－D－1,4外切木糖苷酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。另外, 参与彻底降解木聚糖的还有a－L－阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶及能降解木聚糖上阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯键酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键，协同主链水解酶的作用最终将木聚糖转化为它的组成单糖。
饲料酶活性测定方法
饲用酶活性测定方法
附录A 木聚糖酶活力的测定方法 A1应用范围 本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。 本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出限为10.0U/g。 A2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。A3木聚糖酶活力单位定义 在37℃，pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 A4测定原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。 A5.试剂与溶液 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。 A5.1乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。 A5.2乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。 A5.3氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100ml。 A5.4乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH为5.50 称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。 A5.5木糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/ml： 称取无水木糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100ml。 A5.6木聚糖溶液，浓度为5mg/mL 称取木聚糖（Sigma X0672）1.00g，加入氢氧化钠0.32g(或0.5mol/LNaOH溶液16mL)，再加入90mL水（75mL）,加热，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5mL，再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。使用前，适当摇匀。4℃避光保存，有效期为12h。 A5.7DNS试剂 称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL 氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7