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来源于耐碱真菌Pseudallescher_省略_的碱性木聚糖酶基因的克隆_表达(1)

生物技术进展

2011年第1卷第1期61 67

Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯

2341

研究论文

Articles

收稿日期:2011-05-03;接受日期:2011-06-03基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX003-002);国家肉鸡产业技术体系项目(nycytx-42-G2-05)资助。作者简介:王坤,大学专科,研究方向为微生物。E-mail :wangkun19190@163.com 。*通讯作者:姚斌,研究员,博士,博士生导师,从

事微生物工程研究。Tel :010-

82106063;E-mail :yaobin@mail.caas.net.cn 来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp.JSM-2的碱性木聚糖

酶基因的克隆、

表达及其性质研究王

坤,罗会颖,石鹏君,王亚茹,杨培龙,姚

*

中国农业科学院饲料研究所,农业部饲料生物技术重点开放实验室,北京100081摘

要:从造纸废水中分离得到的耐碱真菌Pseudallescheria sp.JSM-2的DNA 为模板,利用同源克隆和TAIL-

PCR 的方法,获得了一个碱性木聚糖酶基因xyl11-1。该基因DNA 和cDNA 分别为797bp 和678bp 。该基因的推测蛋白N-端有一个18个氨基酸的信号肽序列和一个含207个氨基酸的成熟蛋白。编码成熟蛋白的cDNA 序列在毕赤酵母GS115中重组表达后,进一步纯化并进行酶学性质测定。重组XYL11-1的最适pH 为6.5,在pH 4.5 9.0范围有50%以上的酶活;在pH 4.5 12.0范围具有良好的pH 稳定性;最适温度为50?;以燕麦木聚糖为底物,比活为2618U /mg ;且对中性和碱性蛋白酶具有极好的抗性。该酶作用底物范围广,包括各种木聚糖、纤维素和葡聚糖,易于工业化发酵生产,具有在纸浆脱墨、动物饲料、鱼类饵料中的应用潜力。

关键词:Pseudallescheria sp.JSM-2;碱性木聚糖酶;基因克隆与表达;毕赤酵母DOI :10.3969/j.issn.2095-2341.2011.01.10

Cloning ,Expression and Characterization of an Alkaline Xylanase from

Alkali-tolerant Fungus Pseudallescheria sp.JSM-2

WANG Kun ,LUO Hui-ying ,SHI Peng-jun ,WANG Ya-ru ,YANG Pei-long ,YAO Bin *

Key Laboratory of Feed Biotechnology ,Ministry of Agriculture ,Feed Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China

Abstract :An alkali-tolerant fungal strain ,Pseudallescheria sp.JSM-2,was isolated from the wastewater of a paper mill.By

using degenerate PCR and TAIL-PCR techniques ,a full-length xylanase gene ,xyl11-1,was cloned from the genomic DNA of

strain JSM-2.The complete genomic and chromosomal DNA sequences of xyl11-1consist of 797bp and 678bp ,respectively.

Deduced XYL11-1contains a putative 18-residue signal peptide at N-terminus and a C-terminal 207-residue polypeptide.

Recombinant XYL11-1produced in Pichia pastoris GS115was purified and characterized.The optimal pH of XYL11-1was 6.5,and the enzyme exhibited more than 50%of the maximal activity at pH 4.5 9.0.XYL11-1was stable at pH 4.5 12.0.The

optimal temperature was found to be 50?.XYL11-1had a specific activity of 2618U /mg towards oat spelt xylan ,and was

strongly resistant to various neutral and alkaline proteases.In addition to hydrolysis of different xylans ,XYL11-1had broad

substrate specificity ,including various xylans ,cellulose and glucan.Moreover ,fermentation of XYL11-1was easily handled.

These superior properties of XYL11-1make it advantageous for applying in the animal and fish feed and kraft pulp industries.Key words :Pseudallescheria sp.JSM-2;alkaline xylanase ;gene cloning and expression ;Pichia pastoris

半纤维素是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖,木聚糖是半纤维素的重要组成

部分[1,2]

。木聚糖为线状异聚多糖,由木糖通过β-

1,4糖苷键连接而成,在其侧链上有多种取代基团,包括乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸残基等。所以其完全降解需要多种酶的协同作用[3]

其中,内切β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)以内切

方式作用于木聚糖主链,产生不同链长的寡糖及

少量的木糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶

[4]

木聚糖酶广泛存在动物、植物和微生物中。微生物是木聚糖酶的重要来源,具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。而天然菌株产木聚糖酶的量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。目前,已经有很多木聚糖酶的编码基因被克隆并进行了异源表达,木聚糖酶的表达量得到很大提高[2,5]。根据催化域氨基酸序列及结构的相似性,木聚糖酶多被划分为糖苷水解酶第10家族或第11家族,另外,第5家族、第7家族、第8家族或第43家族的木聚糖酶也有报道[2,6]。

木聚糖酶的工业化应用始于20世纪80年代,最初作为饲料酶制剂的一种应用于饲料行业,之后扩展到如食品(面包加工、酿酒和果汁澄清等)、纺织和造纸等行业[3,5]。木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域。例如在饲料工业中木聚糖酶应选择最适pH在偏酸性范围内的,而造纸工业中,则需要碱性木聚糖酶。人们对碱性木聚糖酶的研究较晚[2]。在1973年,Horikoshi等[7]首次报道了产自细菌的木聚糖酶,从碱性细菌Bacillus sp.No.C-59-2中纯化出最适pH为6.0 8.0的木聚糖酶。此后,研究得到很多碱性木聚糖酶,这其中大多属于芽孢杆菌属中分离得到的第10和第11家族的碱性木聚糖酶[8,9]。而真菌所产生的木聚糖酶一般为酸性,最适pH多在pH3.0 5.0[5]。在2002年,Taneja 等[10]筛选到一株嗜碱真菌Aspergillus nidulans KK299,并部分纯化了其所产的木聚糖酶,最适pH为8.0,在pH4.0 9.5之间稳定。这是唯一报道的在碱性条件下有高活性的真菌来源的木聚糖酶。

本研究从山东一造纸厂的碱性废水中分离到一株耐碱真菌,对其产酶进行分析,并通过同源克隆的方法获得了其木聚糖酶编码基因,在毕赤酵母中成功进行了表达。重组蛋白经纯化进行了酶学性质的研究,获得了在碱性条件下具有高活性的真菌来源的新型木聚糖酶。

1材料与方法

1.1材料

样品是来自山东省的一个造纸厂的碱性废水。大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115由本实验室保存。载体pEASY-T3购自全式金公司,pPIC9质粒购自Invitrogen公司并由本实验室保存。限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶购自TakaRa公司;DNA 提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司;RNA提取试剂盒购自Promega公司;逆转录试剂盒购自东洋纺公司(ReverTra Ace,TOYOBO)。

实验所用培养基按照文献[11]配制,其中Pseudallescheria sp.JSM-2培养基为马铃薯汁培养基,pH10.0;富集培养基,pH10.0;大肠杆菌培养基LB,pH7.0;BMGY培养基及BMMY培养基,pH4.0。

1.2菌株的分离和鉴定

采集水样接种于富集培养基中进行富集培养。30?培养5d后用无菌水稀释至适当浓度,再均匀涂布于pH10.0的固体PDA培养基,于30?培养。将分离到的菌株转移到液体富集培养基中培养,测定木聚糖酶活力。将产木聚糖酶菌株JSM-2在PDB培养基中培养后提取基因组DNA[12],以JSM-2基因组DNA为模板,选用ITS 通用引物ITS4和ITS1(ITS4:5'-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3';ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCT-GCGC-3')进行PCR扩增菌株的ITS序列,经测序后在NCBI数据库上进行比对分析。

1.3木聚糖酶编码基因xyl11-1的克隆

木聚糖酶基因的保守区片段通过简并引物获得,简并引物设计及序列参见文献[13]。以耐碱真菌Pseudallescheria sp.总DNA为模板进行PCR扩增,使用降落PCR程序[14]。为了得到编码基因全长序列,根据测序得到的核苷酸序列,利用TAIL-PCR[15]扩增保守区两侧的序列。TAIL-PCR 特异引物序列见表1。

1.4木聚糖酶基因xyl11-1cDNA序列的获得将PDA上的JSM-2接种至菌丝体液体培养基中,30?、150r/min摇床培养活化48h后转接至产酶(富集)培养基。3d后离心收集菌丝,提取JSM-2的总RNA,提取方法按照RNA提取试剂盒操作说明进行。使用逆转录试剂盒进行cDNA 第一链的合成。利用逆转录得到的cDNA一条链,设计引物(Xyl11-1F:5'-ATGTTCTACTC-TACTCTCGCCACGGTCGC-3';Xyl11-1R:5'-TC-AAGGAGGAGACTCGACAGTGATGTGAGAG-3')获得木聚糖酶基因XYL11-1的cDNA序列。

26生物技术进展Current Biotechnology

表1本研究所用的TAIL-PCR特异性引物

Table1TAIL-PCR primers used in this study.

引物名称引物序列引物长度(bp)usp15'-CTCGATGGAAGGCTGCTGTACACGCGTG-3'28

usp25'-GAGATTATACGTGCCTTCCGACGTCTGGAC-3'30

usp35'-GAGCTTCCGGGGTTGTACTCGCC-3'23

dsp15'-CCGTAATCCCTTGGTCGAGTACTACATCATC-3'32

dsp25'-GGAGTACAACCCCGGAAGCTCCGC-3'23

dsp35'-CGTCCAGACGTCGGAAGGCACGTATAATC-3'29

1.5木聚糖酶XYL11-1的序列分析

将获得的编码木聚糖酶XYL11-1的DNA及cDNA序列通过Vector NTI7.0软件进行比对分析。并通过Signal P程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽序列预测。成熟蛋白的理论分子质量及等电点通过Vector NTI 7.0软件进行预测,并利用BLAST对基因序列进行了相似性比对分析。通过ClustalW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalW)和GeneDoc软件进行多序列比对。

1.6木聚糖酶基因xyl11-1表达载体的构建木聚糖酶XYL11-1成熟蛋白的cDNA编码序列通过引物Xyl11-1F-s和Xyl11-1R-s(Xyl11-1 F-s:5'-ACTGAATTCTCGCCGGCCGCCTCGCCC-TTC-3',Xyl11-1R-s:5'-ACTGCGGCCGCTCAAG-GAGGAGACTCGACAGTGATGTG-3',划线部分分别为Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点)扩增获得。并通过的酶切位点与表达载体pPIC9连接,获得含有Pseudallescheria sp.JSM-2木聚糖酶基因xyl11-1的重组质粒pPIC9-xyl11-1。

1.7木聚糖酶基因xyl11-1在Pichia pastoris中的表达

转化和筛选主要操作流程参照Invitrogen公司的毕赤酵母表达操作手册。重组质粒pPIC9-xyl11-1用BglⅡ进行线性化后通过电击转化毕赤酵母P.pastoris GS115。转化细胞涂布到固体MD 平板上,30?培养至转化子长出。将在MD上生长的转化子用牙签挑取按先后顺序分别点到MM 和MD平板上,30?培养2d。

重组酵母在3mL BMGY培养基中于30?摇床培养48h,离心收集菌体,加入1mL BMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体,继续30?诱导培养,48h 后取样检测各菌株上清液的木聚糖酶活性,从中筛选出表达木聚糖酶的转化子。

1.8重组木聚糖酶的活性分析

木聚糖酶酶活采用DNS法[13,16]测定,酶促反应在最适pH和最适温度条件下进行,反应时间为10min。每组反应设3个平行和一个空白对照。酶活单位定义参照文献[13]。

1.9重组木聚糖酶的纯化和性质测定

1.9.1重组木聚糖酶的纯化挑取木聚糖酶活性高重组子进行摇瓶水平表达,加入BMMY甲醇诱导表达,每24h取样测定木聚糖酶活性,并在诱导表达72h后离心收集培养上清液用于重组木聚糖酶的纯化,进行SDS-PAGE分析[17]。

毕赤酵母表达的木聚糖酶纯化方法如下:收集的菌液首先通过中空纤维进行脱盐和浓缩,再经阴离子交换柱层析纯化。用0 1.0mol/L NaCl(20mmol/L Tris-HCl溶液,pH8.5)进行线性梯度洗,分步收集洗脱峰,每管1mL,选取酶活性最高的几管进行电泳检测其纯度,以达到电泳纯的收集液作为表达木聚糖酶酶学性质研究的样品。利用Bradford法[18]测定纯化后酶液的蛋白质含量,计算出酶的比活性。

1.9.2重组木聚糖酶XYL11-1的最适pH和pH 稳定性的测定纯化的木聚糖酶的最适pH和pH稳定性的测定方法参见文献[11,13],所用缓冲液的pH范围为pH2.2 11.0,不同pH缓冲液的配制参见文献[11]。木聚糖酶活力的测定温度为50?。在pH稳定性测定中,最终木聚糖酶活力的测定使用的pH为6.5。

1.9.3重组木聚糖酶XYL11-1的最适温度和热稳定性的测定纯化木聚糖酶的最适温度及热稳定性的测定方法参照文献[13]进行。其中最适温

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王坤,等:来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp.JSM-2的碱性木聚糖酶基因的克隆、表达及其性质研究

度的测定是在pH6.5的缓冲液体系下进行,热稳定性测定的热处理分别在40?及50?下处理不同时间后,50?下测定剩余酶活力。

1.9.4重组木聚糖酶XYL11-1底物特异性及动力学参数的测定重组木聚糖酶XYL11-1底物特异性及动力学参数的测定参照文献[11]的方法进行。测定的底物包括不同来源的木聚糖(燕麦木聚糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖、小麦可溶性木聚糖和小麦不可溶性木聚糖)、羧甲基纤维素和大麦葡聚糖。以不同浓度(0.1%、0.2%、0.5%、0.8%和1.0%)的燕麦木聚糖为底物,pH6.5,50?下反应5min测定木聚糖酶的酶活力,利用双倒数作图法求得XYL11-1的K m值及V max。1.9.5不同金属离子化学试剂对重组木聚糖酶XYL11-1的酶活的影响不同金属离子化学试剂对重组木聚糖酶XYL11-1的酶活的影响的测定参见文献[13]。加入的金属离子或化学试剂的终浓度为5mmol/L或10mmol/L。木聚糖酶活力的测定在pH6.5、50?条件下进行。

1.9.6重组木聚糖酶XYL11-1抗蛋白酶能力测定将纯化的XYL11-1(100μg/mL)与不同的蛋白酶,包括:胰蛋白酶(pH7.6,25?),α-胰凝乳蛋白酶(pH7.8,25?),胶原蛋白酶(pH7.4,37?),枯草杆菌蛋白酶A(pH7.4,37?)和蛋白酶K(pH7.5,37?),按1?10(蛋白酶?XYL11-1,W/W)的比例混合温浴,温浴30min或60min 后,在pH6.5及50?条件下测定酶活性。

2结果与分析

2.1菌株的分离和鉴定

从碱性造纸废水的水样中筛选获得了一株产木聚糖酶的耐碱菌株JSM-2,经测定JSM-2在pH 7.0 12.0均能正常生长。采用通用引物ITS1和ITS4扩增获得574bp的ITS序列(GenBank登录号:JN002403),在NCBI数据库中进行Blastn 比对发现该菌的ITS与Pseudallescheria boydii isolate WB1173的ITS序列(GenBank登录号:DQ147774.1)的一致性为99%。结合形态鉴定,推断它属于Pseudallescheria属,命名为Pseudalle-scheria sp.JSM-2。

2.2木聚糖酶基因的克隆及序列分析

通过同源克隆方法,以JSM-2的DNA为模板得到一个长194bp的DNA片段,经Blastx比对发现,该片段与Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici 来源的木聚糖酶基因有最高的相似性,其序列一致性为79%。根据得到的木聚糖酶的部分序列,通过TAIL-PCR的方法获得核心片段两侧的序列。将核心片段及两侧翼序列通过Vector NTI7.0软件序列拼接并结合NCBI数据库序列比对的结果,得到木聚糖酶编码基因全长序列为797bp。

利用RT-PCR获得木聚糖酶基因XYL-11-1的cDNA序列,cDNA全长为678bp(GenBank登录号:JN002404)。将木聚糖酶基因XYL-11-1的全长DNA序列和cDNA序列进行比对后发现该基因有1个内含子。木聚糖酶基因XYL-11-1 cDNA共编码226个氨基酸。利用SignalP3.0分析发现,其预测的信号肽序列为N端1 18个氨基酸。成熟蛋白质的理论分子质量为22.7kDa,预测等电点为5.9。XYL-11-1成熟蛋白序列与GenBank上的木聚糖酶序列进行同源性比较发现,与基因组测序的Magnaporthe oryzae70-15来源的木聚糖酶氨基酸序列一致性最高,为68%;与有功能验证来源于Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici的木聚糖酶5(GenBank登录号:AAK27974.1)氨基酸序列一致性为59%。

2.3木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

重组木聚糖酶表达载体pPIC9-xyl11-1转化P.pastoris GS115后,共挑选了100株能在不含组氨酸(His)的培养基上正常生长的His+转化子。进一步在试管中诱导表达,通过酶活性测定,从100株重组酵母中筛选到79株表达木聚糖酶的重组子。木聚糖酶活性最高的为14号重组菌株,诱导48h后的表达量为37U/mL。将14号菌株进行摇瓶水瓶的表达,每24h取样测定酶活力,发现酶活持续增长,诱导72h后木聚糖酶力达到近100U/mL。经SDS-PAGE分析发现特异性的木聚糖酶表达条带(见图1第3泳道)。重组木聚糖酶的分子质量约为23kDa,与理论分子质量(22.7kDa)相当。

2.4重组木聚糖酶的纯化及质谱鉴定

毕赤酵母表达的木聚糖酶经阴离子交换柱层析纯化。用0 1.0mol/L NaCl(20mmol/L Tris-HCl溶液,pH8.5)进行线性梯度洗脱,木聚糖酶

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来源于耐碱真菌Pseudallescher_省略_的碱性木聚糖酶基因的克隆_表达(1)

图1木聚糖酶XYL11-1的SDS-PAGE 分析。Fig.1

SDS-PAGE analysis of purified recombinant

XYL11-1.

1:低分子量标准蛋白;2:经阴离子柱纯化的XYL11-1;3:重组毕赤酵母表达的培养基上清

活性主要分布在0.3mol /L NaCl 的蛋白质洗脱峰中,

并达到SDS-PAGE 电泳纯(图1第2泳道)。最终回收率为40.2%,比活为2618U /mg 。将纯蛋白质条带进行质谱分析,

其中有三条肽段(G TVQTSEGTYNLFQSTR 、VQQPSIEGTSTFNQY -

WAIR 和TGGTVDTGIFFDAWEKAGMPLGTHDY-MVVATEA-YR )与XYL11-1的氨基酸序列完全一致,说明纯化出的蛋白质就是XYL11-1。2.5

重组木聚糖酶的性质测定

2.5.1重组木聚糖酶XYL11-1的最适pH 和pH

稳定性纯化的木聚糖酶XYL11-1的最适pH 为6.5,在pH 4.5 9.0的范围内,酶活性均能维持在最大酶活性的50%以上,

且在pH 10.0仍能检测到木聚糖酶活性,是一个在碱性范围有高活性的真菌木聚糖酶(图2-a )。XYL11-1的pH 稳定性研究结果表明(图2-b ),其在pH 4.5 12.0的

范围内稳定,且在整个碱性范围内处理60min 后

剩余活性相当于最高活性的90%,说明XYL11-1具有非常好的耐碱性。

2.5.2重组木聚糖酶XYL11-1的最适温度和热

稳定性XYL11-1的最适温度为50?(图2-c ),在45? 60?之间能维持70%以上的酶活。其

热稳定性研究结果表明(图2-d ),在40?条件下处理60min 后,剩余酶活在60%左右,在50?处

理10min 后,木聚糖酶活性维持在最高酶活的25%

来源于耐碱真菌Pseudallescher_省略_的碱性木聚糖酶基因的克隆_表达(1)

图2

重组木聚糖酶XYL11-

1的性质Fig.2

Characterization of purified recombinant XYL11-1.

a :XYL11-1的最适pH 曲线;

b :XYL11-1的pH 稳定性;

c :XYL11-1的最适温度;

d :XYL11-1的热稳定性

5

6王坤,等:来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp.JSM-2的碱性木聚糖酶基因的克隆、表达及其性质研究

2.5.3重组木聚糖酶XYL11-1底物特异性及动力学参数测定重组木聚糖酶XYL11-1对不同底物的水解能力发现:该酶对不同来源的木聚糖,包括:燕麦木聚糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖、小麦不可溶性及不可溶性木聚糖,均有很强的水解能力,其中对燕麦木聚糖的水解能力最强。同时还能水解羧甲基纤维素和大麦葡聚糖(表2)。

表2毕赤酵母表达的重组木聚糖酶XYL11-1

的底物特异性分析

Table2Substrate specificity analysis of recombinant

XYL11-1.

底物比活(U/mg)相对酶活力(%)燕麦木聚糖2618?105100

桦木木聚糖2594?8799?3.3

榉木木聚糖2391?4391?1.6小麦不可溶木聚糖855?1733?0.6

小麦可溶木聚糖636?3224?1.2

羧甲基纤维素209?128?0.5

大麦葡聚糖49?1.52?0.1

重组木聚糖酶XYL11-1在50?、pH6.5条件下,以燕麦木聚糖为底物的K m值和V max分别为4.05?0.23mg/mL和1127?19μmol/min·mg。2.5.4各种金属离子和化学试剂对木聚糖酶XYL11-1的活性影响不同浓度的金属离子和化学试剂对重组木聚糖酶XYL11-1的活性影响的实验结果表明:在5mmol/L的浓度的情况下,Cu2+和β-巯基乙醇对木聚糖酶XYL11-1的激活作用明显,酶活分别为对照组的141%和125%。Ni2+、Mn2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cr2+和Pb2+对XYL11-1的酶活有轻微的抑制作用(<10%)。SDS或EDTA可抑制木聚糖酶XYL11-112% 16%的酶活力。10mmol/L的β-巯基乙醇对酶活也有明显的激活作用,而Fe3+、Mn2+和SDS对木聚糖酶XYL11-1活力的发挥有部分(<40%)抑制作用,且10mmol/L Cu2+对酶活的抑制作用达60%以上。Hg2+则完全抑制了XYL11-1的酶活。2.5.5各种蛋白酶对木聚糖酶XYL11-1的活性影响实验结果表明木聚糖酶XYL11-1用胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶和蛋白酶K 处理30min或60min后,木聚糖酶的活力均维持在90%以上。枯草杆菌蛋白酶A处理后的XYL11-1的酶活是处理前的70% 80%。说明XYL11-1有很强的抗蛋白酶降解的能力。

3讨论

随着DNA序列数据库的迅速膨胀,已鉴定出大量的不同来源的木聚糖酶基因。对一些木聚糖酶基因的功能已经进行了研究,其中,真菌来源的木聚糖酶多为酸性,其发挥活性的pH范围从酸性到中性[5]。已有报道,来源于嗜碱真菌Asper-gillus nidulans KK299的木聚糖酶为碱性木聚糖酶,但还没有进行相关基因克隆和表达[10]。本研究的XYL11-1是来源于耐碱真菌的糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶,其在中性及碱性条件下具有高活性,是迄今报道的第二个在碱性条件下有高活性和稳定性的真菌木聚糖酶。

据报道,位于活性中心作为质子供体和进行亲核攻击的氨基酸残基的pKa值会限制酶发挥功能的pH范围[19,20]。因此,活性中心附近的带电荷氨基酸或芳香族氨基酸可能是影响酶的酸碱性的一个重要因素,它们可能会影响催化氨基酸的pKa或影响酶对底物的结合[21]。XYL11-1的2个谷氨酸残基的pKa值分别为5.6和8.2,比多数酸性木聚糖酶的pKa值要高。另外,嗜酸木聚糖酶的碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)含量在3%左右,而XYL11-1有更多的碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸,6.3%)。高的pKa值和高的碱性氨基酸含量可能是导致XYL11-1在碱性条件下有高活性的原因。

XYL11-1除具有木聚糖酶活性外,还具有较高的纤维素和葡聚糖酶活性,底物作用范围广。以前的研究中人们发现,糖苷水解酶第10家族的木聚糖酶多具有纤维素酶活性,而具有高纤维素和葡聚糖酶活性的第11家族木聚糖酶还未见报道。2010年,Shi等[22]报道了第10家族的木聚糖酶具有高活性的葡聚糖酶活性,分析其原因可能是与底物结合的口袋比较大,既能接受较小分子的木聚糖,也能接受较大分子的葡聚糖。而XYL11-1具有高纤维素和葡聚糖酶活性的原因需要做进一步的研究。

研究中还发现木聚糖酶XYL11-1的热稳定性较差,这也是目前所报道的第11家族木聚糖酶普遍存在的问题[2,5],但这并不是限制木聚糖酶

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广泛应用的决定因素。现在通过基因工程、酶工程等对木聚糖酶分子进行改造,可使其热稳定性得到显著提高[23,24],从而能更好地满足工业生产的要求。

参考文献

[1]Prade R A.Xylanases:from biology to biotechnology[J].Biotech.Genet.Eng.Rev.,1995,13(12):100-131.

[2]Collins T,Gerday C,Feller G.Xylanases,xylanases families and extremophilic xylanases[J].FEMS Microbiol.Rev.,2005,29:3-23.

[3]Subramaniyan S,Prema P.Biotechnology of microbial xylanases:enzymology,molecular biology,and application

[J].Crit.Rev.Biotechnol.,2002,22(1):33-64.

[4]Biely P.Microbial xylanolytic systems[J].Trends Biotechnol.,1985,3:286-290.

[5]Polizeli M L T M,Rizzatti A C S,Monti R,et al..Xylanases from fungi:properties and industrial applications[J].Appl.

Microbiol.Biotechnol.,2005,67:577-591.

[6]Henissat B,Bairoch A.New families in the classification of glycosyl hydrolases on amino acid sequence similarities[J].

Biochem.J.,1993,293:781-788.

[7]Horikoshi K,Atsukawa Y.Xylanase produced by alkalophilic Bacillus No.C25922[J].Agric.Biol.Chem.,1973,3:2097

-2103.

[8]Khasin A,Alchanati I,Shoham,Y.Purification and charac-terization of a thermostable xylanase from Bacillus stearother-

mophilus T-6[J].Appl.Environ.Microbiol.,1993,59:1725

-1730.

[9]Takami H,Nakasone K,Takaki Y,et al..Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and

genomic sequence comparison with Bacillus subtilis[J].Nucl.

Acids Res.,2000,28:4317-4331.

[10]Taneja K,Gupta S,Kuhad R C.Properties and application of

a partially purified alkaline xylanase from an alkalophilic fungus

Aspergillus nidulans KK299[J].Bioresour.Technol.,2002,85(1):39-42.

[11]魁红,罗会颖,董守良,等.一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究[J].中国农业

科技导报,2010,12(5):109-115.

[12]Graham G C,Mayers P,Henry R J.A simp lified method for

the p reparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD

analysis[J].Biotechniques,1994,16(1):48-50.

[13]Luo H,Wang Y,Li J,et al..Cloning,expression and char-acterization of a novel acidic xylanase,XYL11B,from the

acidophilic fungus Bispora sp.MEY-1[J].Enzyme Microb.

Technol.,2009,45:126-133.

[14]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al..Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J].

Nucl.Acids Res.,1991,19(14):4008.

[15]Liu Y G,Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end frag-

ments from P1and YAC clones for chromosome walking[J].

Genomics,1995,25:674-681.

[16]Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determ ination of reducing sugar[J].Anal.Chem.,1959,31(3):

426-428.

[17]Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assem-bly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:

680-685.

[18]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantita-tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of

protein-dye binding[J].Anal.Biochem.,1976,72:248

-254.

[19]Tynan-Connolly B M,Nielsen J E.Redesigning protein pKa values[J].Protein Sci.,2007,16:239-249.

[20]Le Nours J,Ryttersgaard C,Lo Leggio L,et al..Structure of two fungalβ-1,4-galactanases:searching for the basis for tem-

perature and pH optimum[J].Protein Sci.,2003,12:1195-

1204.

[21]Fushinobu S,Ito K,Konno M,et al..Crystallographic and mutational analyses of an extremely acidophilic and acid-stable

xylanase:biased distribution of acidic residues and importance

of Asp37for catalysis at low pH[J].Protein Eng.,1998,11:

1121-1128.

[22]Shi P,Tian J,Yuan T,et al..Paenibacillus sp.strain E18 bifunctional xylanaseglucanase with a single catalytic domain

[J].Appl.Environ.Microbiol.,2010,76:3620-3624.[23]杨浩萌,姚斌,罗会颖,等.木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响[J].生物工程

学报,2005,21(3):414-419.

[24]杨浩萌,孟昆,罗会颖,等.通过N端替换提高木聚糖酶的热稳定性[J].生物工程学报,2006,22(1):26-32.

76

王坤,等:来源于耐碱真菌Pseudallescheria sp.JSM-2的碱性木聚糖酶基因的克隆、表达及其性质研究