3种小球藻DNA提取方法的比较

收稿　1999206216 修定　2001202226

　1　国家自然科学基金(39870561)和“九五”国家科技攻关(962

C02204205)资助项目。

3种小球藻D NA 提取方法的比较1

陈　颖　刘根齐　李文彬　孙勇如(中国科学院遗传研究所,北京100101)

Comparison of Three Extraction Methods for D NA from Chlorella spp.

CHEN Y ing ,L IU G en 2Qi ,L I Wen 2Bin ,SUN Y ong 2Ru (Institute of Genetics ,The Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100101)

提要　单细胞真核藻类小球藻已成为藻类分子生物学研究的热点,但其特殊的细胞壁组分给DNA 的提取带来了一定的困难。文章比较了3种从小球藻中提取DNA 的方法,即纤维素酶法、作者改进的CTAB 法和目前单细胞藻类常用的裂解法。通过所提取的DNA 进行浓度、纯度分析,认为CTAB 法是一种简单、快速和高效的适合于小球藻的DNA 提取方法。

关键词　椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea )　DNA 提取方法　CTAB 法

作为单细胞真核藻类的小球藻因其结构简单、

生长迅速、营养丰富,又可食用,目前正逐渐成为藻

类分子生物学及基因工程研究的热点。但由于其细胞壁的组分和结构较为特殊[1～4],细胞壁外层还含有可抑制多糖酶降解作用的孢粉质(sporopol 2lenin )[5],给小球藻DNA 的提取带来一定困难,从而影响了小球藻基因工程的深入研究。要想获得高产量与高质量的DNA ,关键问题在于细胞壁的充分降解与破碎。目前虽然已有几种小球藻藻体中DNA 的提取方法,但有些较为复杂,有些提取效果不佳[6,7]。本文采用纤维素酶法和作者改进的CTAB 法与目前单细胞藻类常用的超声波处理法相比较,通过对提取的DNA 进行浓度、纯度分析,以期得到一种简单、快速、高效提取小球藻DNA 的方法。

材料与方法

1　材料来源及培养条件 椭圆小球藻(Chlorella ellipsoi dea )由北京大

学张昀教授提供。培养基成分为克氏培养液:Ca (NO 3)2 1.0g ?L -1、K 2HPO 40.2g ?L -1、MgSO 4?7H 2O 0.2g ?L -1、KCl 0.12g ?L -1、FeCl 310mg ?L -1,附加0.1%的酵母提取物和0.2%的葡

萄糖。

培养条件:将在固体培养基中生长的直径约1mm 左右的单藻落接种于20ml 液体培养基中悬浮培养,转速90～100r ?min -1,温度20～25℃,光照培养16h ,光照条件4.39～5.86W ?m -2,黑暗

培养8h 。

2　试剂和溶液

(1)Tris 2ED TA 缓冲液:250mmol ?L -1Tris 2HCl (p H 8.0)、50mmol ?L -1ED TA 、20%蔗糖。

(2)10%蛋白酶K 、10%肌氨酰(Sarkosyl )、10%纤维素酶(Onozuka R 210)均为Sigma 公司产品。

(3)CTAB 缓冲液:2%CTAB (十六烷基三乙基溴化铵,cetyltrithylammonium bromide )、0.1

mol ?L -1Tris 2HCl (p H 8.0)、1.4mol ?L -1

NaCl 、10

mmol ?L -1ED TA 、2%β2巯基乙醇。

(4)25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇抽提液。(5)TE :10mmol ?L -1Tris 2HCl (p H 7.6)、1mmol ?L -1ED TA 。

(6)10μg ?μl -1RNase 、限制性内切酶Hi n d Ⅲ、λ(Hi n d Ⅲ+Eco R Ⅰ)marker 均为Promega 公司产品。3　仪器 岛津UV 2220型紫外分光光度计。4　提取方法

(1)超声波处理法:收集对数生长期(约1×108个?ml -1)的小球藻细胞,每ml 藻液加入250μl Tris 2ED TA 缓冲液,超声波破碎60s ,分别加入终浓度至1%的蛋白酶K 和2%的肌氨酰,于65℃下温育1h ,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提液抽提1次,将上清转至新的离心管中,加入RNase 至终浓度为10μg ?ml -1,37℃下放置30min ,然后再用酚∶氯仿∶异戊醇抽提液抽提1次,水相转至新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇,于室温下沉淀数分钟,6500×g 离心20min ,所得的DNA 沉淀用70%的乙醇洗2次后,真空抽干或自然干燥,最后溶于10～20μl 的TE 中。

(2)纤维素酶法:收集对数生长期(约1×108

242植物生理学通讯　第37卷第3期,2001年6月

个?ml -1)的小球藻细胞,每ml 藻液加入250μl

Tris 2ED TA 提取缓冲液,充分混匀后,加入纤维素酶Onozuka R 210至终浓度为1%,于45℃下温育1h 。取出后立即放入冰浴中3～5min ,加入终浓度为2%的肌氨酰,混匀后,再在冰上放置10min 。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提液抽提1次,以下步骤同超声波处理法。

(3)改良的CTAB 法:收集对数生长期(约1×108个?ml -1)的小球藻细胞,每ml 藻液加入250μl CTAB 缓冲液,充分混匀后,将混合物在65℃下温育1h ,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提液抽提1次,以下步骤同超声波处理法。

结果与讨论

分别采用超声波处理法、纤维素酶法和改良

CTAB 法这3种方法,得到了小球藻的总DNA 。通过紫外分光光度计测定它们在260nm 下的吸光度A 值,3种方法从4ml ×108个细胞中可分别提出4.2、3.8和4.8μg DNA 。从它们的核酸电泳图亦可见,改良的CTAB 法提取的总DNA 含量高于超声波处理法和纤维素酶法(图1)

。

图1　3种方法提取的小球藻总DNA

1.λ(Hi n d Ⅲ+Eco R Ⅰ

)marker ;2.超声波处理法;3.纤维素酶法;4.改良CTAB 法。

上述3种方法得到的小球藻总DNA 在220～

300nm 下的吸光度如图2所示。它们的A 230nm /A 280nm 和A 260nm /A 280nm 值如表1所列。超声波处理法和纤维素酶法的A 230nm /A 280nm 值均高于改量CTAB 法,说明二者所提的总DNA 中有较高的糖分含量。根据经验数据,纯净DNA 的A 260nm /A 280nm 值在1.8左右。若RNA 未除干净,比值将偏高;若样品中污染有蛋白质或酚,其比值将明显低于此值[8]。3种方法所提取的DNA 的A 260nm /A 280nm 的比值均大于1.8,说明样品中没有蛋白质

和酚的污染。其中改良CTAB 法提出的DNA ,其A 260nm /A 280nm 的值为1.8734,并能被限制性内切酶酶切(图3),显示出较好的纯度。纤维素酶法提出的DNA 其A 260nm /A 280nm 的值为1.9625,DNA 沉淀呈黄褐色,可能是纤维素酶中所含杂质所致。超声波处理法的A 260nm /A 280nm 值为2.1558,可见该方法提出的DNA 中RNA 含量较高

。

图2　3种方法所得小球藻总DNA 在220～300nm

下的吸光度

表1　3种方法所得小球藻总DNA 的A 230nm /A 280nm 和

A 260nm /A 280nm 值

方法A 230nm /A 280nm A 260nm /A 280nm

超声波处理法 1.3766 2.1558纤维素酶法 1.7500 1.9625改良CTAB 法

1.0264

1.

8734

图3　3种方法提取的小球藻总DNA 酶切图

1.超声波处理法;

2.纤维素酶法;

3.改良CTAB 法。

总之,通过对不同方法所提DNA 浓度和纯度的比较可知,纤维素酶法和超声波处理法所提取小

3

42植物生理学通讯　第37卷第3期,2001年6月

球藻DNA 的产量较低,并含有较多的糖分或RNA ,而且在采用超声波处理法时,探头必须彻底

清洗干净,这一点对转基因小球藻来说,显得尤为重要,因为若探头未洗干净,DNA 就有被交叉污染的可能性,从而产生假阳性,影响转基因检测结果。我们改进的CTAB 法操作过程简单快捷,得到的DNA 纯度高,能直接被限制性内切酶酶切,适用于

分子生物学研究,且对各转基因藻株间无交叉污染,不影响分子检测的结果,是较为理想的提取小球藻DNA 的方法。

在使用改良CTAB 法时,需注意温育时间不宜过长,超过1h ,则所提DNA 会出现降解现象,可能是由于DNA 酶的作用所致。此外沉淀时间也不宜过长,超过1h ,一些盐和多糖也会沉淀下来,从而影响DNA 质量。

参考文献

1　Hiroshi T ,Tayoyasu H.Studies on the cell wall of Chlorella Ⅲ:

Incorporation of photosythetically fixed carbon into cell wall of syn 2chronously growing cells of Chlorella elli psoi dea.Plant Cell Physiol ,1982,23(6):1033～10402　Maria B ,Doris M ,Eckhard L.Cell wall cornposition of Chlorococ 2cal algae.Phytochemist ry ,1983,22(7):1603～1604

3　Hiroshi T ,Tayoyasu H.Studies on the cell wall of Chlorella V :

Comparision of the cell wall chemical compositions in strains of Chlorella elli psoi dea.Plant Cell Physiol ,1984,25(2):287～2954　Edwin K ,Werner R.A chitin 2like glycan in the cell wall of a

Chlorella sp.(Chlorococcales ,Chlorophyceae ).Planta ,1995,197:577～582

5　Takashi Y ,Kenji S.Protoplast induction in Chlorella spiecies.A 2gric Biol Chem ,1981,45(8):1905～1909

6　Takanobu H.,Takashi Y.Electrophoretic karyotyping and chro 2masomal gene mapping of Chlorella.N ucleic Res ,1991,19(22):6191～6195

7　Huss VAR ,Schuarzwalder E ,Kessler E.Deoxyribonucleic acid re 2association in the taxonomy of the genus Chlorella Ⅰ:Chlorella saccharophila.A rch Microbiol ,1986,145:329～333

?小方法?

收稿　2000205229 修定　2000211222　1　贵州省自然科学基金资助项目。

用塑料杯快繁马铃薯无毒苗1

刘仁祥

(贵州大学农学系,贵阳550025)

植物离体快繁因比常规繁殖方式快上万倍,而在良种繁殖、无毒苗大量繁殖等有经济价值植物繁殖中广为采用。但植物离体快繁中采用的三角瓶、罐头瓶价格高、易破损,且回收利用要花很多人力和物力,因此成本高,效率低,这在一定程度上也限制了组培技术的广泛应用。我们在马铃薯的快繁中,以饮水用的一次性塑料杯作培养器具,价格低,不回收清洗成本也小,且透光性好,微繁苗的长势健壮。根据我们的实验,它有如下优点:

(1)增加透光率。据我们测定,罐头瓶的透光率为77.81%,三角瓶和塑料杯的透光率分别为94.29%和94.38%。塑料杯和三角瓶的透光率相当,明显优于罐头瓶。

(2)利于试管苗生长。据实验,一次性塑料杯中的苗矮壮、根多、根长、节数多,苗综合素质最好。三角瓶中微繁苗素质略次,但都比罐头瓶培养的试管苗素质好。

(3)降低成本。据粗略估算,塑料杯培养苗的容器成本仅为0.0017元?株-1,罐头瓶培养苗为0.003元?株-1,三角瓶培养苗为0.0074元?株-1。

尽管塑料杯是一次性使用,但因价格低,不回收清

洗,其成本也比采用罐头瓶和三角瓶都低,且塑料杯轻,不会碰坏,接种和搬动都比较方便。

根据我们的实验,采用塑料杯时,应注意几个问题。由于一次性塑料杯璧薄,较软,不能承受较大的内外压力差。在高温高压灭菌时,如扎口过紧,口部因胶筋的拉力容易变形;灭菌后如放气过快,则因内外压力差过大,会造成塑料杯杯体严重变形,导致接种后封口不严,易污染,有的甚至不能使用。所以,(1)高温灭菌前的扎口应尽量松,严防塑料杯的口部因胶筋在高温高压下产生过大的拉力而变形;(2)灭菌后,必须缓慢放气,防止因放气过快杯内外压力差过大而导致塑料杯变形;(3)接种后,在不使塑料杯变形的前提下,胶筋扎口应紧,严防杂菌侵入导致再污染。封口材料可采用塑料膜或塑料膜加1层羊皮纸,这能保水透气;用胶筋扎口,封闭较严,再污染少,植株生长健壮。

442植物生理学通讯　第37卷第3期,2001年6月