09生物学术活动蓖麻毒蛋提取白实验报告
学术活动实验报告
题目：蓖麻毒蛋白的分离纯化及其应用
目录
摘要 (1)
一：实验目的 (1)
二：实验原理 (1)
2.1什么是蓖麻及蓖麻毒蛋白 (1)
2.2分离与提纯 (2)
2.3检测 (4)
三：实验内容 (4)
3.1 实验器材 (4)
3.2 实验步骤 (4)
四：实验结果分析 (5)
五：实验心得体会 (6)
摘要：蓖麻是一种适应性很强的油料植物,具有较高的经济价值与广泛的应用前景。本次实验经(NH4)2SO4沉淀,分子筛层析和亲和层析等处理,从去壳蓖麻籽中分离纯化得到蓖麻毒蛋白, 通过考马斯亮蓝染色法-紫外分光光度法检测蓖麻毒蛋白的含量，用实验室的紫外可见分光光度计进行检测。最后参照标准蛋白测定数值绘制标准曲线然后根据标准曲线得到所提取蛋白样品的相对浓度。
关键词：蓖麻毒蛋白层析分离纯化分光光度计浓度
一、实验目的
1.学习了解蓖麻及蓖麻毒蛋白的性质与作用。
2.了解并且掌握蓖麻毒蛋白的分离纯化的方法。
3.掌握考马斯亮蓝染色法-紫外分光光度法检测蓖麻毒蛋白的含
量的实验方法。
4.学习对生化实验的中出现问题的分析解决方法。
二、实验原理
2.1什么是蓖麻及蓖麻毒蛋白
蓖麻，又称大麻子布于非洲、亚洲等，具有特殊的用途和很高、红麻等，是大戟科蓖麻属植物，蓖麻栽培历史悠久，是世界十大油料作物之一，主要成分的经济价值蓖麻的种子（蓖麻子）蓖麻籽是蓖麻成熟的果实，含有45%左右的油，其油可作为重要的化工原料，生产润滑油、油漆、表面活性剂等。榨油后可剩余50%的蓖麻饼粕，饼粕脱脂后含35%左右的蛋白质，但因其废弃物中含5 %的剧毒蓖麻毒蛋白，使大量蛋白质无法利用。蓖麻的利用价值非常高，蓖麻籽可以榨油；蓖麻叶可以养蚕；蓖麻茎秆可以制板和造纸；蓖麻的根、茎、叶、籽均可入药；现代医学研究表明蓖麻毒素是重要的抗癌物质；蓖麻粕营养丰富，是优质有机肥，脱毒后是一
种高蛋白饲料。蓖麻籽含油量50%左右，是其它油料作物所不能及的。其籽油含90%左右的羟基脂肪酸，独特的分子结构决定了蓖麻是一种重要的工业油料作物，被称为“绿色可再生石油资源”，是替代石油生产化工原料最理想的植物油脂。
蓖麻毒蛋白，是从蓖麻中分离得到的具有凝集素活性的毒蛋白，为最强烈天然毒素之一。是由全毒素、毒类素、凝集素三种物质组成的蛋白质。蓖麻毒蛋白对所有哺乳动物真核细胞都有毒害作用，而对某些恶性肿瘤细胞毒性更强。这使它在医学上成为用于杀伤肿瘤细胞的首选毒素之一。蓖麻毒蛋白是糖蛋白异二聚体，是由全毒素、毒类素、凝集素三种物质组成的蛋白质，并由数种不同类型的高分子蛋白质组成，蓖麻毒蛋白的氨基酸组成（质量百分比）如下：赖氨酸-1.5%，撷氨酸-2.9%，甘氨酸-2.0%，异亮氨酸-
3.6%，组氨酸-0.9%，色氨酸-0.8%，亮氨酸-3.8%，苯丙氨酸-
2.3%，苏氨酸-2.%，肤氨酸-1.6%，天冬氨酸-10.3%，蛋氨酸-
0.9%，谷氨酸-6.8%，精氨酸-12.7%，丝氨酸-8.2%。由此可见蓖麻毒蛋白中精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸的含量较多。而A链色氨酸200、精氨酸180、谷氨酸177、酪氨酸123和酪氨酸80在氨基酸序列中是几个保守的非极性氨基酸，它们对稳定活性中心起了一定的作用。由于A链的赖氨酸的含量低，所以可防止泛素化和泛素介导的蛋白酶水解，有研究证明赖氨酸被移除不会影响A链的活性、结构、稳定性，如果在上面附加4个赖氨酸残基，A链的降解速度会明显加快。
2.2分离与提纯
从蓖麻种子或蓖麻饼粕中提取蓖麻毒蛋白粗提液的方法主要有：乙酸溶液提取法；磷酸缓冲溶液提取法；硫酸铵沉淀法和透析
法等。
2.2.1 乙酸提取法
称取适量蓖麻饼在研钵中研碎（研碎置于冰浴中，防止蓖麻毒蛋白在研碎过程中变性），加入适量乙醚以脱去脂肪。浸泡20 min 后，用四层纱布过滤，以滤去含脂乙醚。将脱脂后的蓖麻饼在室温下晾干，用冰醋酸在4℃下分别浸泡20 h，用纱布过滤得粗提液。
2.2.2 酸缓冲液提取
用磷酸缓冲液浸泡蓖麻饼处理样品20 h后，用聚乙二醇吸水，经5000r/min离心机离心15min，取上清液测定蓖麻毒蛋白含量。
2.2.3硫酸铵沉淀和透析法
在滤液中分别加入固体硫酸铵70%饱和度，5000r/min离心
20min，所得深沉物先对蒸馏水透析，再对pH 7.7的HCl-Tris缓冲液透析。透析后的样品用相对分子质量为6000的聚乙二醇覆盖1-2天，直至把样品中的水分吸干得粗蓖麻毒蛋白。收集所得粗蓖麻毒蛋白，用紫外分光光度计测定蓖麻毒蛋白含量。利用蓖麻毒素和凝集素对D-半乳糖基结合的特性，采用琼脂糖Sepharose 4B吸附，用半乳糖洗脱，再用纤维素离子交换柱层析或葡聚糖凝胶过滤可进一步纯化得到蓖麻毒素。高宝岩将适量去壳蓖麻籽和石油醚加入到食品粉碎机中进行粉碎脱脂，过滤除去石油醚，用乙醚洗涤滤饼，所得脱脂蓖麻粉置于用醋酸调整pH=3.8的醋酸水溶液中浸取12h，所得上清液对蒸馏水透析24h，然后对pH=6.5磷酸缓冲溶液透析24h，透析液经25000 r/min超速离心30min，上清液为蓖麻毒蛋白粗提液。然后将蓖麻毒蛋白进行柱层析分离纯化，毒蛋白粗提液经琼脂糖Sepharose 4B分离得到纯品。通过乙酸提取、硫酸铵沉淀、透析，制备蓖麻粗蛋白，用紫外可见分光光度计测定蓖麻毒蛋白的
含量，还使用高效液相色谱进行了分析，提取率较高，结果较满意。
2.3检测
蓖麻毒蛋白分析检测尚缺乏简单、快速、准确的定量分析方法，通用的方法如红血细胞凝集法、280nm紫外吸收法，仅达目视比较半定量分析，还不适用于工业化规模的产品控制分析，更缺乏同时检出能力。
三、实验内容
3.1 实验器材
1.实验仪器：玻璃棒，容量瓶，胶头滴管，漏斗，移液管，通风
柜，离心机，电子秤，锥形瓶，量筒，移液枪；
2.实验药材：蓖麻子，磷酸缓冲液，硫酸铵；
3.2 实验步骤
⑴选择比较饱满的蓖麻子，剥壳，称出20g，放入研钵里，研
磨直到看不到明显的颗粒为止。
⑵加入磷酸缓冲液500mL，用玻璃棒搅拌均匀，并倒入广口瓶
中，盖好瓶口，贴好标签。
⑶把研磨混合液放入4℃的冰箱中冷藏24小时。
⑷过滤，将静止了24小时的混合液摇匀，用四层纱布过滤到另
一个广口瓶中，静置20分钟左右，然后分装到印管中，我们
组总共分装了36支。
⑸离心，将这36支印管放入离心机离心，每次12支总共离心
了3次，每次10分钟。
⑹从离心机中取出移液管，用移液枪吸收离心管中的上清液。
将上清液倒入量筒中（44mL），根据硫酸铵的对应关系并且称
取了20.768克的硫酸铵放入广口瓶中。再将上清液也从量筒
中倒入光口瓶。
⑺盖好瓶口，贴好标签，放入4℃冰箱中静置24小时。
⑻取出广口瓶，再次用移液管分装并进行离心。
⑼倒掉上清液，取沉淀，用磷酸缓冲液溶解，摇匀后倒入透析
带。
⑽把透析带放入装有磷酸缓冲液的烧杯中淹没透析，一般情况下透析8个小时。
⑾8小时后取出透析带，甩动摇匀后把透析好的溶液倒入小锥形瓶中。
⑿利用蛋白质+考马斯亮蓝染色—紫外分光光度法测定蛋白质的
含量。
四、实验结果分析
320 （μg每ml） 0.049（A)
240 0.037
160 0.025
80 0.013
40 0.005
20 0.003
8 0.001
4 0.001
经过仪器计算本组的结果：0.9827（过大），与理论值相比较我们组的这次实验算是一次失败的实验。
误差分析：
①因为这次实验是多人合作完成的，有些步骤本应该由一个人
连续完成，但是我们出现了交叉完成的情况，也许在这期间
会出现一些人为的误差影响。
②可能是实验过程中，由于小组比较多，在实验过程中难免会
出现洒漏的情况。
③由于时间关系我们在最后一步并没有静置8个小时进行透析
而是在6个小时左右之后就开始进行最后的检测分析。
④由于实验条件有限，透析膜多次使用而我们正好又是后面在
做，透析效果明显降低，残存其他蛋白质。和我们一起实验
的小组也出现结果偏大的情况。
五、实验心得体会
本次实验从开始到结束总共历时一个周的时间，我们小组总共有4名成员一起合作完成此次生化实验。因为我们的知识有限，整
个实验过程还是由老师的研究生指导我们完成。当然，通过此次实验我们不仅仅从理论上了解了蓖麻毒蛋白的分离与纯化的过程，更重要的是通过我们亲自动手实践切身体验了这个过程，在这个实验过程中我们所学到的远远大于书本上的讲解。总之，经过这一个周实验我们小组的成员都学到了很多东西。通过这次实验我们深刻体会到做生化实验一定要细心，要有耐心，要严谨，不然小小的疏忽都会导致最终实验的失败。通过这次实验大家之间的相互协作精神又得到了很大的提高，最后也感谢郭灿老师和赵学姐的细心指导才使得我们顺利完成此次实验。