三四章分子克隆载体---题目_完_

第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）

一、名词解析

二、填空题

1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。

2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和

、。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。

3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他

们的所致。

4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源

于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。

5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过和两

种质粒改造而来。它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。

6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状

的DNA分子的。

7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。

8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段

的阴性的突变体之间实现互补。

9.溶源化的频率和与有关。

10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生

重组，从而整合到染色体中。

11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被

或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。

12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。

13.代表性λ噬菌体载体有和

14.粘粒的组成包括________，________，________。

15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。

16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目

标克隆的目的。该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。

17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA

序列组成。

18.装载了外源DNA 片段的重组子导致抑制基因sup4 插入失活，从而形

成；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成。

19.YAC 的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对、重复的和极端的

DNA 有更强的容忍性。

20.细菌人工染色体是基于大肠杆菌的构建的，高通量低拷贝的质粒载

体

21.BAC 载体的可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿

主细胞的毒副作用

22.整合载体（integration vector），根据整合方式的不同可分为和随

机整合，按其作用来分可归为目标基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。

23.YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列

即、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（centromere , CEN）和两个。

24.将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过

层析柱时，将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。

25.在 YAC 载体中最常用的是

26.YAC 载体主要是用来构建，特别用来构建高等真核生物的基因组文

库，并不用作常规的基因克隆。

27.对于 BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用或切割

抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂。

28.YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面：首先，在YAC 载体的插

入片段会出现和和。

29.携带F因子的细胞，或以或以表达三根发样状的F菌毛。

30.第一代 BAC 载体（Shizuya et al. 1992）不含那些能够用于区分携带的

抗生素抗性细菌菌落与携带的细菌菌落的标记物。

31.大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足的基本要求，

即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。

32.GST 表达载体在启动子 tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序

列，其一是，其二是切割位点的编码序列。

33.大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达表达载体和

表达载体。

34.不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同

的。

35.按其用途可将标记基因分为标记基因和标

记基因。

36.通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有抗性基因

和抗性基因两种抗性标记。

37.表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了以及有

利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

38.除了具有质粒载体基本要素外，也具有多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子和单链噬

菌体的复制与包装信号等要素的质粒载体称为。

39.的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

40.质粒按拷贝数分为与质粒。

41.作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将运载到大肠杆菌

细胞中。在基本骨架的基础上表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其的差异。

42.λ 噬菌体有和两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。

43.粘粒是带有的质粒。粘粒载体的工作使用了和的双重

生物学性质。

44.表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了，以及有利于

表达产物分泌、分离或纯化的元件。

45.λ噬菌体感染野生型大肠杆菌后，只有一部分细胞进入。相反，在大多数感

染的细胞群体中，裂解循环是受挫的，存活的细胞进入。

46.是λ噬菌体DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的DNA 序列。

三、选择题

1.松弛型质粒( )

A、在宿主细胞中拷贝数较多

B、可用氯霉素扩增

C、有一般没有选择标记

D、上述A和B两项正确

2.同一种质粒DNA,以三种不同的形式存在,电泳时他们的迁移速度是( )

A、OC DNA> SC DNA> L DNA

B、SC DNA>L DNA>OC DNA

C、L DNA >OC DNA>SC DNA

D、SC DNA>OC DNA >L DNA

3.关于质粒的相容性，下面哪种说法不正确？( )

A、不相容群的质粒能够共存于一个细胞

B、质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群

C、如果a b两种质粒不相容，说明它们复制机制相同

D、属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，而且拷贝数和分子质量也相同

4.关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法是最正确的( )

A、在不同宿主中具有不同的复制机制

B、在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点

C、

在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶

D、在不同的宿主细胞中具有不同的复制速度

5.质粒具有下列特征,因此适合作为克隆载体,除了( )

A、赋予宿主细胞某种可检测的特性

B、可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离

C、独立的复制能力

D、可复制自身DNA以及插入的外源DNA

E、甲基化防止宿主细胞的限制性内切核酸酶对其降解

6.下列对质粒特征的描述中，不正确的是( )

A、既能以单链环状又能以双链环状的形式存在

B、是独立与细菌染色体DNA以外的复制子

C、有线性质粒DNA

D、能够自我复制

7.下列属于置换型载体的是( )

A、λgt10 载体 B 、EMBL3 C 、lgt11 D 、lGEM-2/4

8.载体中常用的标签蛋白有( )

A 、谷胱甘肽转移酶B、蛋白质C C、纤维素结合位点D、六聚组氨酸肽

9.质粒的转移性需要的因子是那几个( )

A、移动基因mob

B、转移基因tra

C、顺式因子bom

D、反式因子com

10.下列属于质粒载体的筛选标记的是( )

A、琥珀突变抑制基因

B、抗性基因

C、插入失活

D、蓝白斑

11.下列不属于l 噬菌体发育调节的是( )

A、吸附

B、转入

C、迟早期转录

D、源化

12.下列不属于λ噬菌体的选择标记的是( )

A、lacZ 基因

B、因cⅠ失活

C、苄青霉素抗性基因

D、Spi 筛选

13.[多选]粘粒载体的优势( )

A、可以装进100万碱基以上的DNA片段

B、可在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因

C、可克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段

D、在构建基因文库时，可减少文库中重组体的数目

14.[多选]粘粒的结构特点( )

A、含有抗药性标记和质粒复制起始位点

B、一个或多个单一限制酶切位点

C、带有λ噬菌体粘性末端

D、分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，

15.[多选]YAC 的主要功能成份有( )

A、着丝粒

B、端粒

C、自主复制序列（ARS）元件

D、酵母复制起始位点

16.[多选]cosmid载体带有( )

A、质粒的复制起点

B、克隆位点

C、选择性标记

D、λ噬菌体用于包装的cos末端等

17.酵母人工染色体（YAC）载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持

染色体稳定的需要，必须含有以下元件除了( )

A、端粒重复序列

B、着丝粒

C、复制终止序列

D、自主复制序列

18.YAC 载体主要是用来构建库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不

用作常规的基因克隆。( )

A、小片段DNA

B、大片段DNA

C、大片段RNA

D、小片段RNA

19.由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC

载体，YAC 载体以方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。( )

A、线状

B、环状

C、半开环

D、螺旋

20.是基于大肠杆菌的F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。( )

A、细菌人工染色体

B、母人工染色体

C、P1 人工染色体载体

D、P1 噬菌体载体

21.酿酒酵母的形态为卵形，生长的代时为90 分钟。( )

A、圆形

B、圆形

C、柱形

D、菱形

22.酿酒酵母含染色体，其大小为225-1900kb ，总计有14×106 bp。( )

A、20

B、18

C、16

D、14

23.YAC 载体的选择标记主要采用( )

A、养缺陷型

B、氨酸缺陷型

C、药性

D、氨酸缺陷型

24.YAC 载体装载了外源DNA 片段的重组子导致抑制基因插入失活，从而形成红

色菌落。( )

A 、up1 B、sup2 C 、up3 D、sup4

25.YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在3 个方面：首先，在Y AC 载体的

插入片段会出现缺失和，嵌合体。( )

A、基因插入

B、基因重排

C、基因添加

D、移码突变

26.BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个抗

性基因。( )

A、青霉素

B、红霉素

C、氯霉素

D、链霉素

27.大肠杆菌- 酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与

选择标记，另有一个。( )

A、复制终止序列

B、多克隆位点区

C、主复制序列

D、粒重复序列

28.同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架，

更主要的是含有一段便于同源重组的( )

A、组DNA 片段

B、大分子DNA片段

C、小分子DNA片段

D、链RNA片段

29.下面载体中不属于质粒载体的是。( )

A、pBR322

B、pUC18／19

C、M13mp18／19

D、pUC118/119

30.λ 噬菌体载体分为插入型载体和置换型载体，其中属于常见的置换型载体

是。( )

A、λgt10

B、λgem-11

C、λgt11

D、λExcell

31.YAC是基于染色体生物学性质构建的载体。( )

A、噬菌体

B、大肠杆菌

C、酵母菌

D、细菌

32.通常一个质粒含有一个与相应的结合在一起的复制起始区。( )

A、顺反子

B、顺式作用元件

C、增强子

D、反式作用因子

33.质粒在复制时，首先合成前引物，并与DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前引物，

使之成为成熟的引物，该引物是。( )

A、RNAⅠ

B、RNAⅡ

C、rRNA

D、mRNA

34.pUC 系列载体含有基因，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。

因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。( )

A、tet r

B、amp r

C、lacZ

D、lacC

四、判断题

1.迄今发现的质粒DNA都是环状的( )

2.能够在不同宿主细胞中复制的质粒叫做穿梭质粒( )

3.ColE1是唯一的用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选

择( )

4.基因克隆中，低拷贝的质粒载体是没有用的( )

5. 噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂

解循环。( )

6.整合酶 Int 是Ⅱ型拓扑异构酶，可同时切割和连接 DNA ，对含负超螺旋的闭合环状

DNA 的作用效果更好。( )

7.在感染早期，在宿主的复制蛋白和应激蛋白的作用下，噬菌体 DNA 通过滚环方式进行

复制。( )

8.由于λ噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入

6kb 外源 DNA 片段，最大 13kb 。( )

9.它用于构建 cDNA 文库、基因组文库和表达融合蛋白。该载体最大的特点是在最左侧可

替代区置换了一段lac5 基因，可编码 -半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。( )

10.一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构

建基因组文库。( )

11.构建粘粒文库时，载体分子会自身连接，从而导致效率大大降低甚至失败。通过对载体

作去磷酸化处理、使用双cos 位点载体或对载体的酶切产物进行部分补平，可解决这一问题。( )

12.柯斯质粒(Cosmid)载体一般可插入35～40kb的外源基因。( )

13.外源片段克隆在粘粒载体中是以噬菌斑的形式表现出来的。( )

14.YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，

以便保存和增殖。( )

15.F菌毛不是供体与受体细胞之间产生性接触所必需。( )

16.YAC 人工染色体载体具原核 mRNA 的加工活性。( )

17.YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列

即自主复制序列、用于有丝分裂功能的着丝粒和两个端粒。( )

18.与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突

变ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成白色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制ade 2-1基因的突变效应，形成正常的红色菌落。( )

19.F因子通常以单链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在。( )

20.BAC 载体的低拷贝性可以避免基因重排的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的

毒副作用。( )

21.在P1 噬菌体载体系统中，含有基因组和载体序列的环状重组分子在体外被组装到 P1

噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb。( )

22.P1 人工染色体结合了 P1 载体和 YAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB 及噬

菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。( )

23.表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7

噬菌体终止子序列及其下游的几个酶切位点。( )

24.筛选标记用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

https://www.wendangku.net/doc/3716202952.html,cA 基因是乳糖lac操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因。( )

26.在lacZ' 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响

β-半乳糖苷酶的功能内互补。( )

27.含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的载体插入外源DNA后，转入宿主细菌，如

宿主细菌在含有四环素培养基中能存活，则说明重组载体一定转入到宿主细菌中。( ) 28.四环素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。

( )

29.如果在某一宿主中含有琥珀突变的tetr基因和ampr基因，只有当宿主含有supF基因

时对Amp和Tet具有抗性。( )

30.大肠杆菌表达载体都是质粒载体。( )

31.对野生型大肠杆菌来说，感染复数越高，营养状态越差，溶源化的频率就越低。（）

32.重组λ噬菌体的基因组 DNA 的大小不会影响其存活能力。( )

33.λ噬菌体载体克隆外源DNA 片段的原理与质粒载体的工作原理是完全相同的。( )

34.λ噬菌体是一种烈性噬菌体，感染宿主后立即进入裂解生长。( )

五、简答题

1.简述烈性噬菌体的溶菌生长周期的基本过程？

2.简述lacZ基因功能选择法？

3.简述选择标记和筛选标记的区别。

4.简述质粒的基本特性

5.试述利用α-互补作为筛选标记的原理。

6.简述噬菌粒的基本特性。

7.简述噬菌粒的优缺点。

六、问答题

1.什么是质粒的相容性？什么是不相容群？机制是什么？

2.引起质粒不相容性的主要原因是什么？

3.常见质粒有哪些其拷贝数是多少？

4.常用的选择标记有哪些？举例说明

5.常用的筛选标记有哪些？举例说明

6.噬菌体有哪些常见用途？

7.比较λ噬菌体载体和粘粒载体的结构和功能，并分别说出其优缺点？

8.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？

9.YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在几个方面，它们分别是什么？

10.YAC 载体的工作原理是什么？

11.YAC 的突出优点是什么？

12.P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构是什么？

13.试述λ噬菌体载体的克隆原理及步骤。

14.试述粘粒的优缺点。

第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）

一、名词解析

1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；

大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。

2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数

之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。

3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在

第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合

的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。

5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体必须既有细

菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。

6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵

基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的

7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。

8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。

9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合的噬菌体

DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA的整合或插入。

10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶源化。

11.载体:将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因

操作的核心工具。

12.粘粒:粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。cos 序列是 l 噬

菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。

13.柯斯质粒:一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建的复合载体。柯斯质粒载体又叫粘粒载

体，这是一种由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

柯斯质粒在结构组成上具有l噬菌体的特性、也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40kb的外源基因。

14.pcos1 EMBL载体:pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重

组过程达到筛选目标克隆的目的。该载体的复制起点来源于 R6K 质粒，与 ColE1 复制起点无同源性，属于不同的不相容群，含卡那霉素和四环素抗性基因。

15.F 因子:大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配

和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA （1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。

16.穿梭载体:穿梭载体（Shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的

载体。

17.整合载体:在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色

体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体。

18.酵母人工染色体:酵母人工染色体YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母

（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。

19.端粒重复序列:端粒重复序列定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被

胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

20.细菌人工染色体：细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的

质粒载体。

21.标签蛋白：用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘

肽转移酶（glutathione S-transferase, GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质 A（protein A）和纤维素结合位点（cellulose binding domain）等。

22.随机突变体库：随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组事件随机插

入基因组中而形成的突变体的集合。

23.琥珀突变：在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则这种突变

称为琥珀突变。

24.克隆载体：用于扩增或保存 DNA 片段的载体称为克隆载体。

25.插入失活：指当外源 DNA 片段插入某一基因后，导致该基因失活。

26.染色体步查：采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA 片段作为探针以鉴定含

有相邻序列的重组克隆。

27.表达载体：该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以

及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

二、填空题

1.质粒DNA、病毒DNA、质粒和病毒DNA杂合体

2.复制区（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外源DNA的插

入）

3.同一个不亲和、复制机制相同

4.pMB1、pSC101、pSF2124

5.pBR322 、M13、pMB1、转座子

6.DNA连接酶

7.溶源性

8.β-半乳糖苷酶

9.感染复数和营养状态

10.attP attB

11.ga1 基因 bio 基因

12.感染复数和细胞的营养状态

13.插入型载体、置换型载体

14.质粒复制起点（colE1）,抗性标记（ampr）,cos 位点

15.质粒,A噬菌体

16.R6K ，卡那霉素四环素

17.着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)、来自四膜虫的端粒(Tel)

18.红色菌落，白色菌落

19.不稳定的

20.F质粒

21.低拷贝性

22.定点整合

23.自主复制序列，端粒

24.融合蛋白

25.PYAC4

26.大片段DNA文库

27.EcoRⅠ，SmaⅠ

28.缺失，基因重排，嵌合体

29.游离状态，整合状态

30.重组子，空载体

31.克隆载体

32.谷胱甘肽转移酶基因, 凝血蛋白酶

33.融合蛋白、非融合蛋白

34.复制子

35.选择标记、筛选标记

36.氨苄青霉素、四环素

37.强启动子

38.多功能载体

39.不相容性

40.严谨型、松驰型

41.外源基因、增加、表达元件

42.溶源状态、裂解循环

43.cos 序列、质粒、λ噬菌体

44.强启动子

45.裂解循环、溶源状态

46.cos 序列

三、选择题

1. A

2. B

3. D

4. B

5. E

6. A

7. B

8. B

9. D

10. D

11. B

12. C

13.BCD

14.ABCD

15.ABC

16.ABCD

17. C

18. B

19. B

20. A

21. B

22. C

23. A

24. D

25. B

26. C

27. B

28. A

29. C

30. B

31. C

32. B

33. B

34. C

四、判断题

1.错误质粒也有线性的

2.正确

3.错误 ColE1上没有四环素抗性基因，不能通过抗性筛选

4.错误对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体

5.正确

6.错误 Int 是Ⅱ型拓扑异构酶

7.错误噬菌体 DNA 通过θ方式进行复制

8.错误最大 11kb

9.正确

10.正确

11.正确

12.正确

13.错误外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑

14.正确

15.错误 F菌毛不是供体与受体细胞之间产生性接触所必需

16.YAC 人工染色体载体具真核 mRNA 的加工活性

17.YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列

即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒。

18.与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突

变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。

19.F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在。

20.BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒

副作用。

21.在P1 噬菌体载体系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1

噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb。

22.P1 人工染色体结合了 P1 载体和 BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬

菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。

23.表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7

噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。

24.错误选择标记用于鉴别目标DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出

来。

25.错误lacZ 基因是乳糖lac 操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因。

26.正确

27.正确

28.错误氨苄青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转

肽反应。

29.正确

30.正确

31.错误对野生型大肠杆菌来说，感染复数越高，营养状态越差，溶源化（lysogenization）

的频率就越高。

32.错误重组λ噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。

33.错误λ噬菌体载体克隆外源DNA 片段的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是

在形式上有许多差别。

34.错误λ噬菌体是一种温和噬菌体，感染宿主后或裂解生长或以溶原状态存在。

五、简答题

1.简述烈性噬菌体的溶菌生长周期的基本过程？

答：

1）吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上。

2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。

3）转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体的场所。

4）合成：功能发生了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。

5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，这个过程也叫噬菌体的形态建成。

6）释放：新合成的自带噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。

2.简述lacZ基因功能选择法？

答：根据lacZ基因编码产物β-半乳糖苷酶在Xgal-IPTG培养基平板上显色反应的原理，已经在某些插入型的l噬菌体载体的lacZ基因中，引入了若干常用的核酸内切限制酶识别位点。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时，形成的是无功能活性的β-半乳糖苷酶。于是被感染的大肠杆菌寄主细胞，就将在含有Xgal-IPTG培养基平板上形成无色的噬菌斑；而相反的，没有插入外源序列的l噬菌体载体则会形成蓝色的噬菌体斑。

同样的方法也可用于替换型载体的重组体分子的选择，当然其先决条件是在可取代的区段中应带有lacZ基因的相应序列。由此可见，我们可以利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶的功能活性，作为选择l重组分子的一种简便有效的生化指标。

3.简述选择标记和筛选标记的区别。

答：选择标记用于鉴别目标目标DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来，而筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来。

4.试述质粒的基本特性。

答：（1）．质粒的复制：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的。（2）．质粒的拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。（3）．质粒的不相容性：不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。（4）．转移性：在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

5.试述利用α-互补作为筛选标记的原理。

答：α-互补是指基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41 个氨基酸的lacZ

基因，无酶学活性。对于只编码N-端140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，能将培养基中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）分解产生蓝色产物。利用这一互补性质，在相应的载体系统中lacZ△M15 放在 F 质粒上, 随宿主传代；lacZ' 放在含有某抗生素抗性基因载体上, 作为筛选标记，即在lacZ'基因上插入外源DNA片段，lacZ'基因失活，不能形成α-互补。转化宿主细胞后，在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）和该抗生素的培养基上培养，含有重组子的菌落或噬菌斑呈白色，即可筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。

6.①双链DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；②免却了将外源DNA 片段

从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤；③由于载体足够小，故可得到长达10kb 的外源DNA 区段的单链。

7.噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生

缺失突变，而这些外源DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA 的产量较低且重复性较差。

六、问答题

1.什么是质粒的相容性？什么是不相容群？机制是什么？

答：质粒的相容性是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容，不能共存则称不相容。从本质上说，能够共存于同一个细胞中的质粒具有不同的复制机制，因而复制时互不干涉，并保持稳定。根据质粒的这一特性将质粒分为若干个不相容群。同一个不相容群里的质粒不能共存于同一个细胞，因为他们的复制机制相同，因此凡能共存于同一个细胞中的质粒属于不同的不相容群，因为它们的复制机制不同。

2.引起质粒不相容性的主要原因是什么？

答：质粒的不相容性主要有两方面引起的：第一，由于复制控制而产生的不相容性。复制控制系统不能将它们作为两个质粒来识别，因而只能随机选择进行复制。第二，由于分离引起的不相容性。有时一个子细胞只能得到一种类型的质粒，而另一个细胞得到另外一种类型的质粒，这样得到的子细胞都是丢失了一种质粒的细胞。

3.常见质粒有哪些其拷贝数是多少？

答：

4.常用的选择标记有哪些？举例说明

答：选择标记用于鉴别目标DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来，筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来。抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记，如1．氨苄青霉素抗性基因2．四环素抗性基因3．氯霉素抗性基因4．卡那霉素和新霉素抗性基因5．琥珀突变抑制基因还有其他的选择标记如一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。

5.常用的筛选标记有哪些？举例说明

答：筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。

1．α-互补（α-complementation）

α-互补是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的

2．插入失活

通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA 片段插入tetr 基因后，导致tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。

6.噬菌体有哪些常见用途？

答：细菌的鉴定与分型噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。例如用伤寒沙门菌Vi噬菌体可将有Vi抗原的伤寒沙门菌分为96个噬菌体型。这对流行病学调查、追查传染源等具有重要意义。

分子生物学研究的重要工具噬菌体对基因工程理论与技术的发展已经发挥了重要作用。噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，而且容易获得大量的突变体，因此成为研究基因复制、转录、重组、表达调控机制等的重要工具；成为研究DNA、RNA和蛋白质相互作用的良好模型系统。近年来，利用λ噬菌体作为载体构建基因文库；利用丝形噬菌体表面表达技术构建肽文库、抗体文库和蛋白质文库等，又使噬菌体成为分子生物学研究中的重要载体。

细菌感染的诊断与治疗应用噬菌体效价增长试验可检测标本中的相应细菌。即在疑有某种细菌存在的标本中，加入一定数量的已知的相应噬菌体，37℃孵育6～8 h，再进行该噬菌体的效价测定。若其效价有明显增长，则表明标本中有某种细菌的存在。

若在一标本中检出某种噬菌体，且数量较多，也表明有相应细菌的存在。

在有些局部感染时可用噬菌体作为一种辅助治疗，如应用铜绿假单胞菌噬菌体治疗创口感染。但由于噬菌体的特异性过于专一，限制了噬菌体在临床上的广泛应用。

7.比较λ噬菌体载体和粘粒载体的结构和功能，并分别说出其优缺点？

答：入噬菌体结构：COS、左臂、可替代区、右臂、COS

入噬菌体功能：插入型克隆11Kb，置换型克隆23Kb；用于构建CDNA文库和基因组文库，也可用于亚克隆在大容量载体（粘粒）中增殖的外源片段。

入噬菌体优点：

①λ基因组中有1/3的非必需区，可以被置换，改造成载体后，克隆较大（可达

20Kb），而质粒载体的克隆片段只有几个Kb

②用噬菌体DNA作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的效

率高，包装后的效率就更高了

③λ可通过溶源化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时可让它

以溶源性存在，若要表达，可通过诱导即可进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA的拷贝数就会很多。

入噬菌体缺点：

常用的克隆载体

第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作 原理 第三章 基因疫苗抗原 基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构 建 第五章 基因疫苗制备 第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫 效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素 第九章 基因疫苗安全性 第十章 细菌病基因疫苗 第十一章 病毒病基因 疫苗 第十二章 寄生虫病基 因疫苗 第十三章 肿瘤基因疫 苗 第十四章 控制动物生 长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体 克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。其中，质粒是目前应用最为广泛 的克隆载体。下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。 （一）质粒特性 质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。有的质 粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。 质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面 用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类 型。严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。 质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA （ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。实验室常利用这 些理化特性鉴定和纯化质粒。 质粒具有以下几项生物学特性： ? 寄生性：质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。 ? 稳定性：每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。 ? 重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 ? 不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ? 传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基 因。

三四章分子克隆载体---答案_完_

第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 一、名词解析 1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。

分子克隆技术第三章

2017/2/21 第三章载体 第一节基因克隆技术概述 一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR ?首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性 内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟 枪法”或“散弹枪”实验法。 三、重组体的构建 1、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。 （1）质粒（plasmid) （2）噬菌体λ的衍生物 （3）科斯质粒（cosmid） （4）单链DNA噬菌体 M13（5）病毒?面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先 用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。 2、载体的性质 1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。 2）载体DNA的分子量应该较小。 3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。 4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。 3、酶系的选用

(整理)克隆载体与表达载体

一部分：概念解析 二部分：问题解答 克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔 5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs

基因克隆的质粒载体

基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。

分子克隆载体

分子克隆载体（vector） 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。 重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。 质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。 载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。 1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。 对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因（Tet r）等，以便从

克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表 达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们 是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由 3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往 在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体 :具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.

分子克隆之载体构建完整步骤

分子克隆之载体构建完整步骤 一、目的片段的扩增和酶切 PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。 准备： A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落 B.引物配制： a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁 nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。 b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul 工作液。终浓度200-400nM。 1. PCR反应体系(50ul) Taq酶体系：Thermo 10x buffer （无Mg2+）5ul MgCl2（25mM）5ul dNTP （10mM）1ul 上下游引物工作液1ul 模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul Taq DNA聚合酶0.5ul ddH2O 补充至50 ul 注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。 PCR仪设置反应条件： 95℃ 5min 预变性 循环x30-35： 变性95℃ 30s 退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃） 延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸 4-10℃ 保温 高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo

第四章克隆策略与体外重组.

第四章克隆策略与体外重组 一、填空题 1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—； (2)第二层涵义是—----------------—； (3)第三层涵义就是-------------------- 。 2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1)—-----------------—(2)——------------------ (3)—------------------—。 3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。 4．受体细胞的感受态是—--------------—。 5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------— (3)————————————（4)—--------------------—。 6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。 7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。 8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。 9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。 10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。 11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。 12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。 14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。

分子克隆技术

分子克隆技术
生
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

克隆载体
l
l
是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序 列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。 3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片 段。
生
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

生
pBR322
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

生
pBR322
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化 时，它便从该质粒获得 了抗生素抗性。两个抗 生素基因中均含供插入 外源DNA用的不同的单一 酶切位点。一般只选一 个抗生素基因作为插入 外源DNA之用。外源DNA 插入后该抗生素抗性失 活。另一抗生素抗性基 因则作为转化细菌后筛 选阳性克隆之用。
生
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

四个重要位点
l (1)
负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
生
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

分子生物学克隆表达常用载体序列

pcDNA3.1载体序列：5428bp GACGGA TCGGGAGA TCTCCCGA TCCCCTA TGGTGCACTCTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCA TAGTTAAGCCAGTA TCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAG CAAAA TTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAA TTGCA TGAAGAA TCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGA TGTACGGGCCAGA TA TACGCGTTGACA TTGA TTA TTG ACTAGTTA TTAA TAGTAA TCAA TTACGGGGTCA TTAGTTCA TAGCCCA TA TA TGGAGTTCCGCGTTACA TAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACG TCAA TAA TGACGTA TGTTCCCA TAGTAACGCCAA TAGGGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGTA TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTA TCA TA TGCCAAGTACGCC CCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCA TTA TGCCCAGTACA TGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA TCTACGTA TTAGTCA TCGCTA TTACCA TGGTGA TGCGGTT TTGGCAGTACA TCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTGACTCACGGGGA TTTCCAAGTCTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCG TAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA TA TAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTA TCGAAA TTAA TACGACT CACTA TAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGA TCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAA TTCTGCAGA TA TCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAG AGGGCCCGTTTAAACCCGCTGA TCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAA T AAAA TGAGGAAA TTGCA TCGCA TTGTCTGAGTAGGTGTCA TTCTA TTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGA TTGGGAAGACAA TAGCAGGCA TGCTGGGGA TGCGGTG GGCTCTA TGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTA TCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCA TTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACT TGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAA TCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGA TTTAGTGCTTTACGGC ACCTCGACCCCAAAAAACTTGA TTAGGGTGA TGGTTCACGTAGTGGGCCA TCGCCCTGA TAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAA TAGTGGACTCTTGTTCCAAAC TGGAACAACACTCAACCCTA TCTCGGTCTA TTCTTTTGA TTTA TAAGGGA TTTTGCCGA TTTCGGCCTA TTGGTTAAAAAA TGAGCTGA TTTAACAAAAA TTTAACGCGAA TTAA TTCTGTGGAAT GTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTA TGCAAAGCA TGCA TCTCAA TTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAA GTA TGCAAAGCA TGCA TCTCAA TTAGTCAGCAACCA TAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCA TTCTCCGCCCCA TGGCTGACTAA TTTTTTTTA TTT A TGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTA TTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTA TA TCCA TTTTCGGA TCTGA TCA AGAGACAGGA TGAGGA TCGTTTCGCA TGA TTGAACAAGA TGGA TTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTA TTCGGCTA TGACTGGGCACAACAGACAA TCGGCTGCTCTG A TGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAA TGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTA TCGTGGCTGGCCACGACG GGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTA TTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGA TCTCCTGTCA TCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTA TC CA TCA TGGCTGA TGCAA TGCGGCGGCTGCA TACGCTTGA TCCGGCTACCTGCCCA TTCGACCACCAAGCGAAACA TCGCA TCGAGCGAGCACGTACTCGGA TGGAAGCCGGTCTTGTCGA TCA GGA TGA TCTGGACGAAGAGCA TCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCA TGCCCGACGGCGAGGA TCTCGTCGTGACCCA TGGCGA TGCCTGCTTGCCGAA TA TCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTTTCTGGA TTCA TCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTA TCAGGACA TAGCGTTGGCTACCCGTGA TA TTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAA TGGG CTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTA TCGCCGCTCCCGA TTCGCAGCGCA TCGCCTTCTA TCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAA TGACCGACCAAGCGACG CCCAACCTGCCA TCACGAGA TTTCGA TTCCACCGCCGCCTTCTA TGAAAGGTTGGGCTTCGGAA TCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGA TGA TCCTCCAGCGCGGGGA TCTCA TGCTGGAGTTCT TCGCCCACCCCAACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAA TGGTTACAAA TAAAGCAA TAGCA TCACAAA TTTCACAAA TAAAGCA TTTTTTTCACTGCA TTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCA TCAA TG TA TCTTA TCA TGTCTGTA TACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAA TCA TGGTCA TAGCTGTTTCCTGTGTGAAA TTGTTA TCCGCTCACAA TTCCACACAACA TACGAGCCGGAAGCA TAA AGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAA TGAGTGAGCTAACTCACA TTAA TTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCA TTAA TGAA TCGGCCAACGCGCGG GGAGAGGCGGTTTGCGTA TTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTA TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAA TACGGTTA TCCACAG AA TCAGGGGA TAACGCAGGAAAGAACA TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCA TAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA TCACAA AAA TCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTA TAAAGA TACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGA TACCTGTC CGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCA TAGCTCACGCTGTAGGTA TCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACTA TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGA TTAGCAGAGCGAGGTA TGTAGGCGGTGCTACAGAGTT CTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTA TTTGGTA TCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGA TCCGGCAAACAAACCACCGC TGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGA TTACGCGCAGAAAAAAAGGA TCTCAAGAAGA TCCTTTGA TCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGA T TTTGGTCA TGAGA TTA TCAAAAAGGATCTTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAA TGAAGTTTTAAA TCAA TCTAAAGTA TA TA TGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA TGCTTAA TCAGTGA GGCACCTA TCTCAGCGA TCTGTCTA TTTCGTTCA TCCA TAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGA TAACTACGA TACGGGAGGGCTTACCA TCTGGCCCCAGTGCTGCAA TGA TACCGCGAGACC CACGCTCACCGGCTCCAGA TTTA TCAGCAA TAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTA TTAA TTGTTGCCGGGAAGCTAGAG TAAGTAGTTCGCCAGTTAA TAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCA TTGCTACAGGCA TCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTA TGGCTTCA TTCAGCTCCGGTTCCCAACGA TCAAGGCGAGTTACA TGA TCCCCCA TGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGA TCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTA TCACTCA TGGTTA TGGCAGCACTGCA TAA TTCTCTTACTGTCA T GCCA TCCGTAAGA TGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCA TTCTGAGAA TAGTGTA TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAA TACGGGA TAA TACCGCGCCACA TAGC AGAACTTTAAAAGTGCTCA TCA TTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGA TCTTACCGCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGA TCTTCAGCA TCTT TTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAA TGCCGCAAAAAAGGGAA TAAGGGCGACACGGAAA TGTTGAA TACTCA TACTCTTCCTTTTTCAA TA TTA TTGAAGCA TTTA TCAGGGTTA TTGTCTCA TGAGCGGA TACA TA TTTGAA TGTA TTTAGAAAAATAAACAAA TAGGGGTTCCGCGCACA TTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC