文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

CloneEZ?重组克隆试剂盒

本试剂盒为非内切酶依赖的克隆系统,可快速和高通量的将PCR产物定向克隆到任何载体中,只需将200 bp到15 kb的PCR片段与线性化的载体混合,用本试剂盒提供的专有酶处理30分钟后即可转化,阳性率在95%以上。(具体原理见下图)

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

主要特色:

1. 快速,定向的克隆PCR产物,阳性克隆比例高(95%以上)。

2. PCR产物与线性化载体无需酶切,去磷酸化处理,适合高通量克隆。

3. 可有效克隆15 kb的DNA片段。

4. 如果长片段不易PCR扩增获得,可将次长片段分解为2-4个较短片段分别扩增,每个片段首尾重

叠15 bp核苷酸,利用本试剂盒可将这些片段首尾连接形成全长片段,并克隆到载体中。

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

使用方法:

A.线性化质粒的制备

线性化质粒可通过PCR扩增,单酶切,或双酶切制备。质粒的线性化不彻底将导致阴性克隆的产生,所以一般建议通过双酶切或PCR扩增的方法进行质粒线性化。如使用PCR扩增获得线性化质粒,所用的Taq酶应选用高保真酶(如pfu酶),并确保所选酶不会在产物末端加“A”。

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

B.目标DNA的PCR扩增

利用PCR扩增目标DNA,所用的Taq酶应尽量选用高保真酶(如pfu酶),并确保所选酶不会在产物末端加“A”。利用本试剂盒克隆目标DNA,需要目标DNA的两端含有与载体两端相同的15 bp核酸,所以设计引物时要将的这15 bp的核酸加到特异性引物5’端,具体设计见下图:

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

C.目标DNA与载体的重组

1.将下列混合物小心加到0.5 ml的eppendorf管的管底,或PCR管的管底(如果不慎将液体粘在管壁,请务必通过短暂离心使其沉入管底)。

线性化载体(100-200 ng/μl) 6 μl

纯化的PCR产物(100-200 ng/μl) n μl n μl

10X CloneEZ Buffer 2 μl

CloneEZ Enzyme 2 μl

去离子水补足20 μl

一般来说,反应体系中多添加一些PCR产物,会使阳性克隆增多,较长的PCR片段要增加其添加量,以维持其适当摩尔数目。对于不同大小的PCR片段,建议加入下列体积:

PCR DNA of 1 kb, n = 4

PCR DNA of 2 kb, n = 6

PCR DNA of 3 kb, n =8

PCR DNA of >3 kb, n =10

2.将其混合物在25 ℃保持30分钟,之后在冰上保持5分钟。

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文

3.可立即进行转化,也可-20 ℃保存,以后再转化。

D.转化

转化前请自行准备42 ℃水浴,SOC液体培养基,DH5α感受态细胞(>1×108cfu/μg)

1.冰上融化一管50 μl的感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬起来。加入5到8μl的反应液到感受态细胞中,轻弹数下,置冰上孵育30分钟。

2.42 ℃水浴中热激45 90秒,冰上孵育2分钟。

3.6000 rpm离心2分钟收集菌体,用100μlSOC液体培养基重悬菌体。

4.将菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

可能遇到的问题及解决办法

CloneEZ-PCR-Cloning-Kit 中文