2荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。

图1.1 荧光探针的结构

1.1.1 荧光探针的一般设计原理

(1) 结合型荧光探针[21]

+

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output

signal

图1.2 共价连接型荧光探针

结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组装：组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起，要充分考虑到识别基团和荧光基团之间能通

过连接基进行信号传递，对识别对象的识别信息（如荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等）可以及时传递出去。

图1.3 共价连接型锌离子荧光探针

De Silva 在1997年报道的化合物1[22]是一个典型的共价连接法设计的荧光探针。它分别以有优良光学性质的蒽作为荧光基团，以对Zn2+有特异性识别的基团双( 2-吡啶甲基)氨(DPA)为识别基团，通过亚甲基将识别基团和荧光报告基团连接在一起。通过对比加锌前后荧光强度的不同实现了对锌离子的检测。

(2) 置换型荧光探针

图1.4 置换型荧光探针

利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。该类传感器对识别基团和荧光指示剂的要求都比较高，既要选择能和识别基团结合但结合能力又不是特别强的荧光指示剂，又要设计对被分析物能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子传感器的设计。

2002 年，Kim小组[23]设计了邻苯二酚紫作为荧光指示剂，双锌配合物为HPO42-识别基团，并将二者自组装成化合物2，用于中性条件下水溶液中HPO42-的检测。加入识别客体HPO42-后，由于HPO42-与双锌配位能力强于邻苯二酚紫，从而把邻苯二酚紫挤开，使之进入溶液，表现为其原来颜色。在识别过程中，溶液颜色从蓝色变为黄色，常见的Ac-、CO32-、NO3-、N3-、ClO4-、S2-、F-、Cl-、Br-都不影响HPO42-的检测，表现出较好的选择性。

图1.5 置换型HPO42-化学传感器

(3) 化学计量型荧光探针（chemodosimeter）

化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测的一类探针[24]。主要包括两种类型：一类是目标离子和探针分子发生化学反应后仍旧通过共价键相连接:另一类是目标离子催化了一个化学反应（图1.6）。

图1.6 化学计量法的两种类型

一般而言，化学计量型荧光探针分子都具有专一性和不可逆性。尽管这类探针已有不少报道,但由于设计较为困难和反应不够灵敏等缺陷而进展较为缓慢。

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图1.7 氨基酸荧光分子探针

Kim和Hong等[25]设计的识别半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光分子探针3，属于第一种类型。他们利用半胱氨酸及高半胱氨酸与醛生成五元噻唑环或六元噻嗪环的特异反应以及反应前后化合物3和4荧光性质的显著差异实现了对半胱氨酸及高半胱氨酸的高选择性检测。

化合物5[26] 是较早应用化学反应原理实现检测客体的荧光探针，属于第二种类型。化合物5的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著增强(34倍)并红移，进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物6。

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图1.8 基于汞脱硫原理的汞离子荧光探针

1.1.2 荧光分子探针的响应机理

目前，荧光分子探针的响应机理主要有以下几种：光致电子转移（PET, photo-induced electron transfer）、分子内电荷转移（ICT, intramolecular charge transfer）、荧光共振能量转移（FRET, fluorescence resonance energy transfer）等。

(1) 光诱导电子转移原理（PET）

光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电

子给体与电子受体之间发生电子转移的过程。典型的光致电子转移荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团R通过连接基团S和荧光基团相连组成的功能分子。

一般情况下，荧光分子探针的识别基团是电子给体，荧光基团是电子受体，并且通常情况下多采用含有氨基的基团作为识别基团。具体PET工作过程如下：在识别基团与待测物种结合之前，当荧光基团受激发，具有给电子能力的识别基团能够使其处于最高占据轨道的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团的荧光猝灭。而识别基团与待测物种结合之后，由于降低了识别基团的给电子能力，光致电子转移过程被减弱或者不再发生，荧光基团的荧光发射得到恢复（如图1.9）。

h

h

图1.9 荧光分子光致电子转移的“开”“光”过程示意图。

由于与待测物种结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的

“关”、“开”状态，因此这类荧光分子探针又被称为荧光分子开关。PET 荧光分子探针的作用机制可由前线轨道理论[2]来进一步说明（见图1.10）。从图可以看出，识别基团处于自由态时，其HOMO轨道上的

电子可以向荧光基团的HOMO轨道上转移，致使荧光基团被激发到LUMO上的激发态电子不能返回基态而难以产生荧光，此过程对应于发生PET现象。在识别基团与待测物种结合后，识别基团上的HOMO电子已无法转移到荧光基团的HOMO轨道上，使PET过程无法进行，这时荧光基团的激发态电子可以返回基态，产生荧光。由此可见，利用识别基团对PET过程的控制可以实现对体系荧光发射状态的调控。

荧光团结合受体前荧光团结合受体后

图1.10 光致电子转移机制机制的前线轨道理论解释。

化合物1是一个非常典型的PET机理荧光增强型的例子。锌离子不存在时，由于识别基团中氮原子上的孤对电子能够在荧光基团受激发态时占据激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团的荧光猝灭，即发生了光致电子转移（PET）。当Zn2+存在时，Zn2+离子与两个吡啶氮及氨基配位，束缚了氮上的孤对电子，使发生在氮原子和荧光团之间的PET 过程被禁阻，荧光强度大幅度增强．实验结果也证实了此过程。在乙腈溶液中，加入Zn2+离子之前，化合物1的荧光量子产率仅为0.01；加入Zn2+离子之后，它的荧光量子产率为0.77，

荧光增强了77 倍。

(2) 分子内电荷转移( ICT )机理

分子内电荷转移荧光探针分子通常由富电子基团（电子给体）和缺电子基团（电子受体）共轭相连，形成推-拉作用的共轭体系，没有PET 探针分子那样明显的连接基。也就是说荧光团F和受体R通常融合在一起，识别过程二者同时参与。当受体结合被分析物后，作为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力被改变，整个共轭体系的 电荷重新分布，荧光团的推-拉作用被抑制或强化，进而导致吸收光谱、激发光谱以致发射光谱发生红移或蓝移（如图1.11）[27]。

化合物7[28]两端分别含有羰基、苯并噻唑两个强拉电子基和两个氨基强供电子基团，激态时荧光团能够有效地实现了从供体到受体的整个体系 电荷分离，是典型的ICT机理的荧光分子探针。当汞离子存在时，四氨基识别基团捕获Hg2+离子, 6, 7位氮的供电子能力大大减弱，减弱了整个体系 电荷分离程度，引起吸收波谱和荧光光谱分别蓝移了60 nm 和92 nm ，荧光颜色由蓝色变为黄色，同时实现了比色及比率型Hg2+离子的检测。

图1.11 识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT过程光谱移

动示意图

8

7

图1.12 具有D-A结构的ICT汞离子荧光探针

(3) 荧光共振能量转移(FRET)机理

荧光共振能量转移是指当一对合适的能量给体分子(Donor)和受

体分子(Acceptor)相距一定距离(一般为2-5 nm)，且给体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效重叠时，处于激发态的给体将把一部分或全部能量转移给受体，使接受体被激发的过程。受体可以是荧光物质也可以是只有吸收而没有发射的荧光猝灭剂。根据F?rster 理论，共振能量转移效率可以用式 1.5 表示[29]:

6011

??????+=R R T φ (1.5)

式中R 为两个荧光基团的距离，R 0为F?rster 距离(供体-受体之间的临界转移距离)。从这个方程可以看出，即使R 的微小变化都会导致

能量转移的效率强烈改变[24-26]。

9

10

图1.13具有D-A 结构的FRET 汞离子分子荧光探针 利用FRET 效率对距离的强的依赖性，FRET 广泛应用于蛋白质和核酸的结构及动力学研究、分子结合的测定等领域[30]。同样，能量共振转移原理也被用于荧光分子探针的设计。

2004年，Ono 小组[31]设计了以荧光素为能量供体，以没有发射

的荧光猝灭剂4-(4- 二甲氨苯偶氮)苯甲酰基为受体，二者通过富含胸腺嘧啶的碱基连接在一起。当加入汞离子之前，供体受体之间的距离较长，二者不会发生能量共振转移，只发射荧光素的荧光；当加入识别客体Hg2+后，含有多个T的碱基发生特异性分子识别，拉近了荧光素和4-(4-二甲氨苯偶氮)苯甲酰基间的距离，发生荧光素向4-(4- 二甲氨苯偶氮)苯甲酰基的能量转移，从而猝灭荧光素的荧光。

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

分子荧光的机理和荧光探针原理

1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA

PCR和定量PCR的引物和探针设计

引物和探针设计 – PCR 和定量PCR 基本原理 引物设计的重要因素 针对特殊应用的其他提示 引物的质量和纯度目录 1247

基本原理 引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。这个3'-羟基由相配的引物提供。引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。 体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。 对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 在开始引物设计之前，必须弄清以下几点： PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型） PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR) 样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） 可能的问题（例如假基因、SNP) 1

引物设计的重要因素 2 有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。 最流行的软件为Primer 3(https://www.wendangku.net/doc/3817185603.html,)，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。典型的引物长度为18-30个碱基。 短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。 非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。 应避免编码单一序列和重复序列的引物。 引物长度和专一性 引物的GC 含量应介于40%和60%之间。应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。最常用的解链温度计算公式显示如下。“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。 GC 法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。 两种法则都假设退火发生于以下标准条件下： 50 nM 引物、50 mM Na + 和pH 7.0。 “盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。 最复杂的方法称为“碱基堆积”法。这里的计算中包括了杂交期间的焓（H ）和熵（S ）。 计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。 但是，经常需要经验性地估算最佳温度。 所选引物的解链温度应允许退火温度介于55°C 和65°C 之间。一个引物对的两条引物都应具有相同或极相近的解链温度。 退火温度 Tm = 2 °C ? (A + T) + 4 °C ? (G + C) Tm = 64.9 °C + 41 °C ? (G + C -16.4)(A + T + G + C) Tm = 100.5 °C + 41 °C ? ? 16.6 ? log 10([Na + ]) C + G A + C + G + T 820A + C + G + T 提示

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR6勺原理及使用 荧光定量PCR 的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR) 是新近出现的一种定量PCR 检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA ，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA 内插染料 某些染料如SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green I可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA 成正比。 SYBR Green I 荧光染料技术原理SYBR Green I 是一种只与DNA 双链结合的荧光染料。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量。SYBR Green 荧光染料法定量PCR 的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green

染料与DNA 双链结合时发出荧光。2、DNA 变性时，SYBR Green 染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR 产物。4、聚合完成后，SYBR Green 染料与双链产物结合，定量PCR 系统检测到荧光的净增量加大。 SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'一5' 外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合， 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、

EAST装置的磁探针设计

第28卷 第1期 核 聚 变 与 等 离 子 体 物 理 V ol.28, No.1 2 0 0 8年 3 月 Nuclear Fusion and Plasma Physics March 2008 文章编号：0254?6086(2008)01?0073?04 收稿日期：2007?03?07；修订日期：2007?09?06 基金项目：国家自然科学基金资助项目(10405024) 作者简介：奚维斌(1970?)，男，安徽肥东人，博士研究生，研究方向：EAST 电磁测量系统研究和设计。 EAST 装置的磁探针设计 奚维斌，武松涛，沈 飚，万宝年，宋云涛 (中国科学院等离子体物理研究所，合肥 230031) 摘 要：介绍了EAST 装置中磁探针设计中的结构、安装位置、匝面积的标定、幅频响应，并给出了该磁探针的标定误差和Mirnov 线圈幅频响应特征图。两轮EAST 放电试验表明，电磁测量的信号满足装置运行和等离子体控制的需要。 关键词：EAST 装置；磁探针；幅频响应；工程设计 中图分类号：TL65+5 文献标识码：A 1 引言 EAST 是全超导托卡马克核聚变实验装置，它的物理目标[1]是研究并实现稳态的高参数等离子体。为了实现确定的物理目标，电磁测量中磁探针的设计是重要的。在托卡马克中安装在等离子体边界处的磁探针是一种最简单、最重要的提供运行等离子体信息的工具。这些磁探针也提供用于对等离子体的位置、位形和磁流体动力学(MHD)不稳定控制所需要的各种信号。 本文首先介绍磁探针设计的原理；其次详细地叙说EAST 装置中磁探针的结构、安装位置、匝面积标定及幅频响应；最后给出该磁探针的标定误差及幅频响应特征图。 2 磁探针的测量原理 磁探针是安装在等离子体中或边界处的小螺线管线圈，其工作原理是根据电磁感应定律，当线圈所在空间中的磁场发生了变化时，由于穿过线圈横截面的磁通Φ发生变化，在线圈两端将产生一个感应电动势ε： t B S t Φd d d d eff ?=?=ε (1) 式中，B 为磁探针所在空间磁感应强度在线圈轴向的分量；S NS S Δ+=eff ，N 为线圈匝数，S 为线圈 横截面，?S 是引出线和接头所形成的附加的杂散面积。在EAST 装置中设计了两种骨架尺寸相同的磁探针。一种是测量等离子体位置和形状的磁探针叫小探针。小探针测量的信号经过积分器积分，即ε积分就得到小探针几何中心处的磁场B ，磁场方向是线圈的轴线方向。在托卡马克中一般在垂直于等离子体小环方向的截面上安装一组小探针，来反演等离子体的位置和形状。另一种是测量MHD 的不稳定性的磁探针，叫Mirnov 线圈。Mirnov 线圈测量的信号不经过Mirnov 积分器积分。在托卡马克中Mirnov 线圈安装位置和数量都与小探针相同。 满足EAST 装置电磁测量要求的磁探针必须满足如下条件： a. 所有磁探针安装的空间位置精确； b. 所有磁探针有标定精确的匝面积； c. Mirnov 线圈有100kHz 频率响应, 以使探针输出的信号能真实反映磁场的变化。 3 磁探针的设计 3.1 EAST 装置磁探针结构和安装位置 在EAST 装置中，磁探针是安装在真空为1×10?6Pa 、内部部件的烘烤温度为350℃，承受的磁场为3.5T ，等离子体电流为1MA 的真空室内部。磁探针线圈是采用玻璃丝布套管绝缘的裸铜线。玻

甲基化引物探针设计方法

本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。

首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.wendangku.net/doc/3817185603.html,/methprimer/，较为简单直观。

直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此网站也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word内标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。

关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 TaqMan 探针设计的基本原则： a)TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。

探针设计-Northern

核酸分子杂交 基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。 （一）DNA的变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。 （二）DNA复性 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA 或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。（三）探针——靶分子反应 从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。抗体——抗体、外源凝集素——碳水化合物、亲合素——生物素、受体——配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针——靶分子反应，蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决定它的特异性。 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。 一、核酸探针的种类 （一）DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针，这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向，加之分子杂交技术的高度敏感性，分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。DNA探针（包括cDNA 探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备

2荧光探针设计原理(优选.)

最新文件---------------- 仅供参考--------------------已改成-----------word文本 --------------------- 方便更改 赠人玫瑰，手留余香。 荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理

(1) 结合型荧光探针[21] + Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1.2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接 起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组装：组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识

2荧光探针设计原理教学文案

2荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[21]

+ Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1.2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现 象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分

荧光探针定量PCR技术原理及应用

荧光探针定量PCR技术原理及应用 PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR （FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。 1.原理 FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→ 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM （6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap 酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。

MGB探针设计原则

总体原则 ?先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 ?所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 ?扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 ?保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 ?为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） ?将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 引物设计原则 ?序列选取应在基因的保守区段 ?避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构?典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 ?Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% ?引物之间的TM相差避免超过2℃ ?引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ?为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 ?Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp ?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。 探针设计原则