犬血栓前体蛋白TpP酶联免疫分析ELISA

犬血栓前体蛋白(TpP)酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用

目的：本试剂盒用于测定热犬血清，血浆及相关液体样本中血栓前体蛋白(TpP)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中犬血栓前体蛋白(TpP)水平。用纯化的犬血栓前体蛋白(TpP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血栓前体蛋白(TpP)，再与HRP标记的血栓前体蛋白(TpP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血栓前体蛋白(TpP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中犬血栓前体蛋白(TpP)浓度。

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上

清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心

20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/

分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备

用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上

进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标

准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样

品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止

液后15分钟以内进行。

注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计

算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

2.批内与批见应分别小于9%和11%

检测范围：

100ng/L -2000ng/L

保存条件及有效期：

1.试剂盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6个月

酶联免疫法

酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之

酶联免疫分析法

酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围

泛素-蛋白酶体通路和癌症关系的研究进展

泛素-蛋白酶体通路与癌症关系的研究进展 张海满 （山东农业大学生命科学学院山东泰安201018） 摘要：泛素化过程是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞的多种生理活动过程，对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。泛素-蛋白酶体途径（UPP）的异常改变不仅与癌症的病因学有着直接关素，并且与癌症的发展和预后有着密切的关系。本文综述了泛素的构成、泛素链的形成过程、UPP的生理和病理功能及UPP与癌症的关系的研究进展。 关键词：泛素-蛋白酶体通路；UPP；癌症；研究 细胞内蛋白质的产生和降解必须保持着动态平衡，才能维持细胞的稳态和正常功能。泛素-蛋白酶体途径( ubiquitin-pro-teasome pathway, UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是一些短寿命的细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物以及变性变构蛋白等。 1.泛素-蛋白酶体途径（UPP）的构成 UPP成分十分复杂，主要包括泛素( ubiquitin, Ub)、泛素活化酶( ubiquitin-activatingenzyme, E1)、泛素连接酶( ubiquitin-conjugatingenzyme, E2)、泛素蛋白连接酶( ubiquitin-protein ligating enzyme, E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶( deubiquitinating enzyme, DUBs)等。UPP存在于所有真核生物的细胞内，是蛋白质选择性降解的主要方式。 1.1泛素( ubiquitin, Ub) 泛素是一种广泛分布在真核细胞中的高度保守的小分子球状蛋白质。1975年由Goldstein首次提出，此后不断出现有关报道[1]。单个泛素分子由76个氨基酸残基组成，相对分子质量约8.5×103，有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止其自身在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的进行。依赖于ATP的酶促反应，E1通过在Ub的羧基末端和E1自身激活位点半胱氨酸之间形成一个硫酯键而激活Ub，激活的Ub被转到E2结合酶上，然后E2在E3作用下共价结合到需要降解的胞质或胞核的蛋白上，使底物蛋白发生泛素化，形成Ub单体，多个Ub单体通过异肽键连接形成多聚Ub链，每个多聚Ub链至少含有4个Ub单体。 1.2泛素活化酶( ubiquitin-activating enzymes, E1) 泛素活化酶是单基因编码的相对分子质量分别为110×103和117×103的2个亚基，存在于细胞核

泛素-蛋白酶体与蛋白酶体抑制剂

泛素-蛋白酶体及其抑制剂 沈子珒许啸声李稻审校 上海交通大学医学院病理生理学教研室 摘要：蛋白酶体与泛素化信号系统一起构成的泛素—蛋白酶体（UPP）是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系，参与和调控细胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶体是一个由20S 催化颗粒、11S调控因子和2个19S调节颗粒组成的ATP依赖性蛋白水解酶复合体。蛋白酶体的活性状态对细胞功能正常维持是非常重要的。26S蛋白酶体对蛋白的降解依赖于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白识别。蛋白酶体抑制剂能通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能，尤其对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。同时，利用蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性也成为免疫、炎症等研究的热点。蛋白酶体的抑制剂可分为天然化合物和合成化合物两类，其中Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年研究较多的一种蛋白酶体抑制剂。 关键词：肿瘤蛋白酶体泛素蛋白酶体抑制剂PS-341 泛素—蛋白酶体通路（Ubiquitin–proteasome pathway，UPP）的蛋白酶体（proteasome）是一种具有多个亚单位组成的蛋白酶复合体，蛋白酶体沉降系数为26S，故又称26S蛋白酶体。蛋白酶体水解蛋白的前提是靶蛋白的泛素化。在UPP中，各种靶蛋白质泛素化后，先被26S蛋白酶体的19S亚单位识别，随后泛素化靶蛋白脱泛素链和变性，进入20S亚单位的筒状结构内被降解成3~22个多肽。由于蛋白酶体具有精确降解细胞内各种目的靶蛋白，进而参与基因转录和细胞周期调节，以及受体胞吞、抗原呈递等各种细胞生理过程[1]。因此，应用蛋白酶体抑制剂改变其酶切位点活性已成为抗肿瘤治疗的研究热点，蛋白酶体是影响和改变细胞功能重要的目的靶标。 1．蛋白酶体组成 1979年，Goldberg等首先报道在大鼠肝脏和网织红细胞中存在一种分子质量为700 kD的受A TP激活的中性蛋白水解酶。此后，一些在形态、功能及免疫学特征上与之相同的颗粒通过不同途径被分离出来，被统一命名为蛋白酶体[2]。在真核生物进化中，蛋白酶体具有高度的保守性，其简单形式甚至存在于古细菌和真细菌中。真核细胞内的蛋白酶体分布于胞质与胞核内，有的与内质网或细胞骨架相结合，约占细胞蛋白质总量的1％。有功能的26S蛋白酶体是由20S催化颗粒（catalytic particle, CP）、11S调控因子（11S regulator）和2个19S调节颗粒（regulatory particle, RP）组成，其分子量为2.4MD，是ATP依赖性蛋白水解酶复合体。 1．120S催化颗粒（20S CP） 人类蛋白酶体CP的沉降系数为20S，分子量700~750kD。它由α环和β环组成，每个环各有7个相同的亚单位，分别以α1-7β1-7β1-7α1-7顺序排列成圆桶状结构，20S CP中间由两个β亚单位环组成。几乎所有β亚单位都含有一个N 端前导序列，尽管此序列在20S CP装配过程中被切除，但在引导真核生物β亚单位的正确折叠以及β与α亚单位的组装中有重要作用[3]。当β亚单位的N端前导序列被切除后，Thr残基被暴露出来，Thr是酶的活性位点，分别存在于β环的内表面，使β亚单位具有类似的丝氨酸蛋白酶的催化作用[4]。例如，β亚单位N端的折叠方式允许Thr的-OH对底物发动亲核反应形成半缩醛，而Thr的α-NH3可代替丝氨酸蛋白酶中His的咪唑基作为质子受体。此外，活性位点附近的一个Lys残基与特定的丝氨酸蛋白酶中一样，也起着催化剂的作用。目前认为，在20S CP内起催化作用的亚单位主要是β1、β2、β5。不同的β亚单位的催化活性尽管不同，但能互相协调使蛋白酶体具有多种蛋白酶活性，如类糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like, ChTL)、类胰蛋白酶活性（trypsin-like，TL）、肽-谷氨酰肽水解酶活性（post-glutamyl-peptide hydrolyzing，PGPH）、支链氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。在20S CP圆桶状的两端由α亚单位环组形成，环口的中央被α亚单位(α

植物NADPH酶联免疫分析(ELISA)

植物NADPH酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，

混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)

4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)

1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）

蛋白酶体

蛋白酶体 蛋白酶体(Proteasome)是一种巨型蛋白质复合物，主要作用是通过打断肽键来实现降解 细胞不需要的或受到损伤的蛋白质。 简介

蛋白酶体在真核生物和古菌中普遍存在，在一些原核生物中也存在。在真核生物中，它位于细胞核和细胞质中。[1] 能够发挥这一作用的酶被称为蛋白酶。蛋白酶体是细胞用来调控特定蛋白质的浓度和除去错误折叠蛋白质的主要机制。经过蛋白酶体的降解，蛋白质被切割为约7-8个氨基酸长的肽段；这些肽段可以被进一步降解为单个氨基酸分子，然后被用于合成新的蛋白质。[2] 反应过程 需要被降解的蛋白质会先被一个称为泛素的小型蛋白质所标记（即连接上）。这一标记反应是被泛素连接酶所催化。一旦一个蛋白质被标记上一个泛素分子，就会引发其它连接酶加上更多的泛素分子；这就形成了可以与蛋白酶体结合的“多泛素链”，从而将蛋白酶体带到这一标记的蛋白质上，开始其降解过程。[2] 分子结构 从蛋白质结构上看，蛋白酶体是一个桶状的复合物，[3] 包括一个由四个堆积在一起的环所组成的“核心”（右图中蓝色部分），核心中空，形成一个空腔。其中，每一个环由七个蛋白质分子组成。中间的两个环各由七个β亚基组成，并含有六个蛋白酶的活性位点。这些位点位于环的内表面，所以蛋白质必须进入到蛋白酶体的“空腔”中才能够被降解。外部的两个环各含有七个α亚基，可以发挥“门”的作用，是蛋白质进入“空腔”中的必由之路。这些α亚基，或者说“门”，是由结合在它们上的“帽”状结构（即调节颗粒，右图中红色部分）进行控制；调节颗粒可以识别连接在蛋白质上的多泛素链标签，并启动降解过程。包括泛素化和蛋白酶体降解的整个系统被称为“泛素-蛋白酶体系统”。 作用 蛋白酶体降解途径对于许多细胞进程，包括细胞周期、基因表达的调控、氧化应激反应等，都是必不可少的。2004年诺贝尔化学奖的获奖主题就是蛋白质酶解在细胞中的重要性和泛素在酶解途径的作用，而三位获奖者为阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和欧文·罗斯。 [4] 发现 在发现泛素-蛋白酶体系统之前，细胞中的蛋白质降解被认为主要依赖于溶酶体，一种膜包裹的囊状细胞器，内部为酸性环境且充满了蛋白酶，可以降解并回收外源蛋白质以及衰老或损伤的细胞器。[2] 然而，在对网织红血球的研究中发现，在缺少溶酶体的情况下，ATP依赖的蛋白质降解依然能够发生；这一结果提示，细胞中存在另一种蛋白质降解机制。1978年，一些研究者发现这一新的降解机制有多种不同的蛋白质参与，在当时被认为是新的蛋白酶。[5] 随后在对组蛋白修饰的研究工作中发现，组蛋白发生了意外的共价修饰：组蛋白上的一个赖氨酸残基与泛素蛋白C-端的甘氨酸残基之间形成了共价连接，但其对应的功能未知。[6] 而后又发现先前鉴定的一个参与新的降解机制的蛋白质，ATP依赖的蛋白质水解因子1（ATP-dependent proteolysis factor 1，APF-1），实际上就是泛素。[7]

蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂对骨髓瘤骨病的治疗作用

USA,2005,102(39):13944-13949. [15]M u raka m iY,Y asud a T,Saigo K,et a.l Co m prehens i ve ana l ysis of m i cro RNA exp ress i on patt erns i n hepatocell u l ar carci no m a and non -t um orous tiss ues[J].On cogene,2006,25(17):2537-2545. [16]Ku tay H,B ai S,Datta J,et a.l Down regulati on ofm i r-122i n t h e roden t and hu m an hepatocell u l ar carci no m as[J].J C ell B io- ch e m,2006,99(3):671-678.[17]C i afre SA,Gal ard i S,M ang i ola A,et a.l E xtensive m odu l ati on of a s et ofm icro RNA s i n pri m ary gliob l ast oma[J].B ioche m B i ophys R es Co mm un,2005,334(4):1351-1358. [18]Chan J A,Krichevs ky A M,K os i k KS.M icro RNA-21i s an ant-i apoptotic f act or i n hum an gli ob l ast o m a cells[J].C ancer Res, 2005,65(14):6029-6033.(编校:田媛) 蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂对骨髓瘤骨病的治疗作用 于亚平 The effect of proteaso m e i nhi bitor and i m muno modulatory drugs on m yel o ma bone disease YU Ya-p i n g D e p ar t m ent of H e matology,N anjing GeneralH osp it a l of N anjing M ilit ary Comm and,PLA,N anj i ng210002,China. =Ab stract>M ulti p l e m yelo m a is character i zed by ex tensive bone destructi on w it h little o r no new bone for m ation.O ve r the last decade,nove l agents hav e been used in the m anage m ent o fMM.I mm uno m odulato ry drugs(I M i D s),such as tha li dom i de and lena lidom ide and pro teaso m e i nh i b itor,bortezom i b,have s hown s i gnificant anti-m yelo m a acti v ity i n both new ly diagnosed and re lapsed/refracto ry MM.Besides t he ir po ten t e fficacy ag ainst m ye l om a ce lls,these agents m odify t he i nteracti ons bet w een m ali gnant plas ma ce ll and bone m arro w m icroenv iron m ent,and alter abno r m al bone m etabo li s m i n MM.T h i s rev ie w summ arizes av ail able da ta for t he effect o f I M i D s and borte zo m i b on bone re m ode ling o fMM pa ti ents and t he ir possible role i n t he m anagem ent o fm ye l om are lated bone disease. =K ey w ords>m yelo m a;thali do m i de;lena li do m i de;proteasom e inh i bito r M odern O nco logy2009,17(02):0376-0380 =指示性摘要>多发性骨髓瘤(MM)以广泛骨破坏而少有新骨形成为特点。过去的10余年中,以沙利度胺和 来那度胺为代表的免疫调节药和以硼替佐咪为代表的蛋白酶体抑制剂等新型治疗方法引入临床,这类药物 在对初治和复发/难治MM发挥强效抗肿瘤作用的同时,尚能改变恶性浆细胞和骨髓微环境间的相互反应, 从而影响MM的异常骨代谢,对骨髓瘤骨病发挥有益的治疗作用。本文综述此类新药对MM病人骨重塑的 影响及在骨髓瘤骨病治疗中可能的作用。 =关键词>骨髓瘤;沙利度胺;来那度;蛋白酶体抑制剂 =中图分类号>R733.3=文献标识码>A=文章编号>1672-4992-(2009)02-0376-05 骨髓瘤骨病(m ye l om a bone d i sease,M BD)是骨破坏增加,但没有新骨代偿性形成的结果。约80%的多发性骨髓瘤(MM)病人在病程中并发M BD,表现为骨痛,溶骨性病变,病理性骨折和高钙血症。溶骨性破坏是骨髓瘤病人最为痛苦的表现,严重影响病人的生活质量。即使无病生存数年的病人,其骨髓瘤相关的溶骨性病变亦不会修复,是MM治疗中的主要难题之一。 1M BD的发病机制 M BD是骨髓瘤细胞与破骨细胞和成骨细胞间复杂的相 =收稿日期> 2008-03-26 =作者单位> 南京军区南京总医院血液科,江苏南京210002 =作者简介> 于亚平(1963-),男,湖南岳阳人,博士,主任医师,主要从事内科血液病专业。互作用所致。组织形态学定量研究发现,骨髓瘤细胞促进破骨细胞的骨吸收作用,而抑制成骨细胞活性,从而造成骨吸收和形成间的平衡失调,此为M BD的主要特点[1]。 正常情况下,核因子J B配体受体活化剂(receptor ac t-i va t o r o f nuc lear factor-kappa B li gand,RANKL)和其诱饵受体护骨素(osteoprotegerin,O PG)调节破骨细胞的形成、活性和骨吸收。骨髓瘤细胞通过增加RANKL的表达和降低O PG 的表达而破坏两者间的平衡,RANK L的增加有利于破骨细胞的形成和激活,从而使骨吸收增加。应用OPG或可溶性RANK结构以改变上述平衡能防止B M D的发生[2]。除了RANKL和OPG外,骨髓瘤细胞还能产生巨噬细胞炎症蛋白-1A(m acrophage i nfla mm a t o ry prote i n-1A,M IP-1A)和M IP -1B,两者均能促进破骨细胞的骨吸收。M IP-1A以依赖RANKL的方式发挥作用。其它能增强破骨细胞形成和活性

泛素蛋白酶体

泛素—蛋白酶体途径代谢异常与2型糖尿病发生的关系 随着社会的进步发展，人们生活水平的提高，糖尿病(diabetes mellitus,DM) 的发病率逐年增高。据统计2011年全球糖尿病患者总数约 3.66 亿[1]，到2030 年患病人数预计将达到 5.52 亿，这其中 85%～90%为 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)，而中国、印度和美国为世界糖尿病三大国[2]。T2DM以及其相应带来的并发症已成为严重威胁人类机体健康的主要慢性病之一，不仅给患者身心带来巨大困扰，而且增加了患者家庭乃至社会的医疗负担。T2DM主要表现为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷而非胰岛B细胞自身免疫破坏。然而其确切发病机制尚未明确。近年来，人们发现在肥胖、糖尿病等众多机体代谢紊乱情况下，胰岛素靶器官中泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）活性明显上调，并且表现出相应的病理表现[3]，UPS在T2DM及其并发症的发生、发展过程中起了重要作用。现将其机制作一综述。 1. 泛素—蛋白酶体系统的组成 UPS由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶（ubiquitin—activating enzyme, E1 ）、泛素结合酶（ubiquitin—conjugating enzyme, E2）、泛素蛋白连接酶（ubiquitin—protein ligase, E3 ）、蛋白酶体及其底物（蛋白质）构成，其对靶蛋白的降解是一种三级酶联反应过程。通过UPS，细胞几乎可以对其内在的任何一种蛋白质进行高度特异性的降解，整个过程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解两个部分组成[4]【4】。泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程，泛素化修饰涉及泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3 的一系列反应。首先在 ATP 供能的情况下，泛素分子 C 端的 Gly 残基与 E1 激活酶上的 Cys 残基结合，将泛素激活；接着，激活酶将活化的泛素分子通过转酰基作用转移到 E2 结合酶的 Cys 残基上，二者以硫酯键连接；之后，随着泛素连接酶识别靶蛋白，E3 连接酶分别结合着携带着泛素分子的 E2 结合酶和待泛素化修饰的底物蛋白，在连接酶的作用下，泛素分子从结合酶上转移到底物蛋白上，完成泛素化修饰。在此过程中，E3 连接酶尤其重要，它决定着泛素化修饰的时间性和特异性。根据连接在靶蛋白上的泛素分子的连接方式和数目，可以将泛素化修饰分为单泛素化修饰和多聚泛素化【5】。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 1.1泛素(Ub) Ub是1975 年由 Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞内高度保守的多肽，单个泛素分子是由76个氨基酸组成，分子量约85kD , 泛素以共价键与底物蛋白连接，它的主要功能是标记待降解的蛋白质，使其被转运至蛋白酶体，进而发生降解【6】。泛素也可以标记跨膜蛋白，比如受体，将其从细胞膜上除去。泛素分子中散布着7个赖氨酸残基，这些残基可以作为其他泛素共价结合的位点。经过几轮结合后，泛素链将会变得很长，这样有助于对“标记”蛋白的识别【7】。泛素化蛋白可被泛素解离酶识别，而将泛素分子从底物蛋白上水解下来，重复利用【8】。 1.2 参与泛素化降解的酶 E1是一种广泛表达的多肽，大约1100 个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。有2个亚型，是由同一个mRNA 在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。目前在脊椎动物中已发现的E1只有一个，有数目不等的E2和大量的E3；E1酶可以激活所有的E2酶，每个E2酶又可以与多个E3酶相互作用【9】。E1首先与ATP结合，然后与泛素相互作用，催化泛素C端腺嘌呤化并释放焦磷酸，使其C端甘氨酸残基与E1的半胱氨酸残基形成高能硫酯键而获得活性，E1—泛素结合的中间体再将泛素转移给E2s，形成E2-泛素中间体。

小分子靶点药物蛋白酶体抑制剂Bortezomib

小分子靶点药物蛋白酶体抑制剂Bortezomib 目前认为，肿瘤发生的特征在于调节细胞生长、分化、功能和凋亡的正常细胞信号通路发生了异常改变。其中，蛋白质的降解起着非常重要的作用。这一过程包括溶酶体途径和蛋白酶体途径。溶酶体属于细胞器，参与胞外和跨膜蛋白的降解过程；蛋白酶体参与胞内蛋白的降解过程医学教育网搜集整理。真核细胞26S蛋白酶体是分子量达2.4 Mda的ATP依赖性蛋白裂解复合体。它由20S催化核心和分别位于两端的19S调节亚单位组成。尽管泛素化过程并不是所有蛋白的降解方式，蛋白酶体可识别并降解被带有泛素化标记的蛋白，其中包括细胞周期和细胞凋亡调节蛋白，例如细胞周期素、Caspases、Bcl-2和NF-κB。与正常细胞相比较，恶性肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂更为敏感。其部分机理在于肿瘤的发生与细胞周期和凋亡检查点突变的逆转与旁路重建有关；另外，恶性肿瘤细胞也更依赖于蛋白酶体体系去除异常蛋白以及依赖NF-κB通路的激活而维持肿瘤细胞的耐药性和放疗抵抗性。蛋白酶体抑制剂不但可直接诱导肿瘤细胞的凋亡，还对标准化学治疗和放射治疗具有增敏作用以及可逆转肿瘤细胞的抗药性。Bortezomib是一种蛋白酶体抑制剂，能够特异性抑制哺乳动物细胞内26S蛋白酶体的类胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin-like）活性，对细胞一系列信号转导通路产生影响，最终诱导肿瘤细胞死亡。一项多中心Ⅱ期开放性临床研究显示，在202例复发性和顽固性多发性骨髓瘤患者中，其中92%的患者先前至少接受过3种药物治疗，并且先前治疗对91%的患者无效。共193例患者可评价临床疗效。结果示有效率（CR+PR+MR）为35%，中位总生存期为16个月，中位缓解时间为12个月[44]。基于该项研究，2003年5月，美国FDA批准千年制药公司Bortezomib注射剂（Velcade）上市，用于治疗先前至少用过2种药物治疗和最近1次治疗显示病情加重的多发性骨髓瘤。它是美国近十年来第一个被批准用于多发性骨髓瘤的药物，同时也是第一个蛋白酶体抑制剂药物。ASCO 2004报告的一项多中心III期随机对照临床研究显示，Bortezomib治疗多发性骨髓瘤患者可延缓肿瘤进展、改善生存，而且毒副作用轻于地塞米松，已成为复发性多发性骨髓瘤的标准治疗。 蛋白酶体抑制剂Bortezomib在治疗恶性淋巴瘤方面，多名学者在2003年ASH会议上报告了蛋白酶体抑制剂Bortezomib单药治疗单药治疗惰性淋巴瘤的II期临床研究、单药治疗套细胞淋巴瘤的II期临床研究、联合EPOCH方案治疗非霍奇金淋巴瘤的II期临床研究和联合Doxil （脂质体阿霉素）的I期临床研究。在2004年ASCO会议上，纪念Sloan Kettering 癌症中心Connor等报告了蛋白酶体抑制剂Bortezomib治疗复发性或难治性惰性淋巴瘤的临床研究[45-46]。在25例患者包括了3例小淋巴细胞性淋巴瘤、9例滤泡性淋巴瘤、11例套细胞淋巴瘤和2例边缘区淋巴瘤。其中24例先前接受过以下化学治疗：60%的患者接受过CHOP +/- R方案治疗；20%的患者接受过CVP +/- R方案治疗；15%的患者接受过以嘌呤类药物为基础的化学治疗；12%的患者接受过外周血干细胞支持下的大剂量化学治疗；还有8% 的患者接受过放射免疫治疗。Bortezomib的用法是1.5 mg/m2，每周两次，连用两周，每三周重复。除一例出现III度感觉和运动神经毒性外，其他患者均未出现III度或IV度的毒性。结果小淋巴细胞性淋巴瘤患者均在第二或第四个疗程后达到肿瘤稳定。在9例可评价疗效的滤泡性淋巴瘤患者中，6例均达到肿瘤缓解，其中1例达到持续完全缓解。2例边缘区淋巴瘤患者在治疗2疗程后达到部分缓解。在10例可评价疗效的套细胞淋巴瘤患者中，5例达到部分缓解。提示蛋白酶体抑制剂Bortezomib对惰性淋巴瘤的某些亚型具有肯定的疗效。另外，目前正在开展蛋白酶体抑制剂Bortezomib单药治疗霍奇金淋巴瘤以及联合Bcl-2反义寡核苷酸G3139治疗恶性淋巴瘤的I/II期临床研究

安培酶联免疫分析法

安培酶联免疫分析法 安培法是酶联免疫分析中另一种常用的电化学分析技术。它是将工作电极的电为控制在被测定物质能发生氧化/还原反应的某个确定电位上，当样品中含有该物质时，就会产生可以检测的电流，通过电流的大小就可以对该物质的浓度进行测定。由于该方法常应用在色谱和流动体系的电化学检测器上，所以又称为控制电位安培检测。当色谱和流动体系中分离流出的化合物经过该检测器时，可根据所产生的电流来判断吧被测物质流出的时间，根据电流峰的大小来判断化合物的浓度。由于电化学检测器的灵敏度高、死体积小，所以在色谱和流动分析中应用广泛。只要具有电话性的物质都可以进行测定，如苯酚类、硫醇类、硝基化合物、亚胺类、醌类、吩噻嗪类有机物，可以根据所测定的化合物的电化学性质选择相应的测定电位。 安培法中最简单、最常用的模式是在恒定的电位下测定待测物质的氧化还原电流，这种恒电位测量模式可以避免双电层充电和表面瞬变效应，因而信噪比高，可以达到很低的测定下限，还可以根据需要改变电位的各种参数，采用不同的电位脉冲检测模式如示差脉冲安培法、反向脉冲安培法、三脉冲安培法，或是采用双电极或多电极检测模式，以达到检测低浓度样品的要求。 安培酶联免疫分析常用的酶-底物体系 由于安培法可以检测有电化学活性的有机物，如苯酚类，所以理论上只要酶催化反应的产物含有有些电活性基因，均可用安培法进行测定。在酶免疫分析中应用较多的是碱性磷酸酶，其酶催化水解产物为相应的醇或酚，可以用安培法进行检测，特别是电化学氧化对其测定的报道较多，采用的工作电极有碳电极、金属电极、化学修饰电极等。美国Cincinati大学的Heine-man等人在这方面做了大量工作，他们采用不同的免疫分析模式，结合不同的工作电极，以及各种电化学测定技术，测定了多种临床样品和药物。他们最早用AP电化学酶免疫分析的底物是磷酸苯酯，在酶的催化作用下发生水解反应生成苯酚，可在电极上氧化而产生氧化电流，氧化电流的大小同酶的浓度有关系，进而可用于酶免疫分析。但是由于苯酚的电化学氧化过程为不可逆过程，测定时苯酚电氧化产物会吸附在电极表面而污染电极，导致测定灵敏度下降，同时氧化电位太高而造成检测时背景电流较大，所以采用其他底物的报道日益增多。已被研究的底物有对氨基磷酸苯酯、对甲氧基磷酸苯酯、a萘酚磷酸苯酯等，其酶催化水解产物均为酚类物质，可以用安培法测定其氧化电流的大小进而测定其酶的活力。 高效液相色谱安培酶联免疫分析 高效液相色谱（HPLC）具有非常的分离效率，是一种选择性好、灵敏度高的分离分析方法。HPLC的检测器有紫外吸收检测器、示差折光检测器、电化学检测器等。由于电化学检测器具有死体积小、响应速度且具有线性响应关系好、价格便宜等优点，所以近十几年来在HPLC方面的发展十分迅速。酶催化反应后的溶液通常是混合组分，将其与HPLC联用后利用色谱加以分离并除去相应干扰物，可以有效地提高待测物质的测定灵敏度。在高效液相色谱安培酶免疫分析操作中应注意以下几个问题。 流动相和样品 在HPLC中流动相的选择非常重要，一方面它起载体作用，将酶催化反应的产物同样品中的其他物质如未反应的底物、蛋白质等进行分离：另一方面它还要作为电化学检测的支持电解质起导电作用，所以一般选择用导电性溶液作为流动相。一般反相色谱的流动相具有有极性，可用于电化学检测器，而正相色谱可以通过加电解液后柱、采用大体积的壁喷式检测器等方法来改善电化学检测器的适应性。另外在待测物质的氧化还原反应中常常会消耗或