免疫组织化学及其应用
免疫组织化学及其应用
浙江大学病理学与法医学研究所
周韧
1．免疫组织化学的历史、现状和发展
1．1．历史
●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当
时科学与技术发展的相应水平上的.
●医学的目的: 解除人体的病痛
●核心: 诊断和治疗。
任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、
更可信、更有权威性。
●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。
病理诊断发展过程的主要事件
年代作者事件
1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书
1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告
1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书
1829年 Horner 首篇病理论文
1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文
1858年Virchow 发表《细胞病理学》
1863年 Paget 发表《外科病理学》
1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书
1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》
1919年 Ewing 发表《肿瘤病》
1924年 McFarland 发表《外科病理学》
1926年 Karsner 发表《人体病理学》
1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书
1951年电镜应用于病理诊断
1974年免疫组化用于病理诊断
●诊断病理学开始于19世纪
●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜
●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。
1．2．免疫组织化学的发展
1．2．1．免疫学的发展
1．2．2．单克隆技术的出现
●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。
常规苏木素伊红（HE）染色
几百种的“特殊染色”
●免疫组织化学产生：
抗原抗体结合原理
●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。
主要的发展过程
年代研究者事件
1941年 Coons 实用免疫荧光技术
1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术
1970年 Sternberger 抗体酶标记技术
1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫
1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术
1981年 Hsu ABC法
90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免
疫组化法
诊断免疫组化
●开始于70年代，
●发展高峰是80年代，
●90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。
●国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及。
2．免疫组织化学的相关理论和技术
2．1．免疫组织化学的工作原理
●已知的特异性抗体或抗原能特异性结合
●通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金
属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）
●借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部
位确定组织、细胞结构
抗原和抗体
抗原(antigen)
1、全抗原(complete antigen)
2、半抗原(hapten)
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
●纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔）
●多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
●特异性不如单克隆抗体好，有时会造成抗体的交叉反应
●但能广泛用于石蜡包埋组织切片。原因是
单克隆抗体(monoclonal antibody)
●单克隆抗体是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。
●大多数为小鼠。其优点为特异性强、抗体产量高。
●单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇，这一抗原决定簇可以是抗原分
子上的无关抗原决定簇，
●在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。
●单克隆号的来源
总之，任何一种免疫组织化学方法，欲获得令人满意的染色结果，除该方法本身所具有的特点（高度敏感）外，还必须选择具有高度特异和稳定的优质抗体。
（三）抗原与抗体的关系
抗原引起机体产生免疫反应
决定免疫反应的特异性
产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质
利用抗体可以检测抗原物质
（四）抗原与抗体的反应
免疫反应血清学反应。
1、抗原与抗体的结合是高度特异性的结合
在一定的条件下可以解离。
2、一个抗体分子有两个抗原结合点（称两价）
一个抗原的分子上则可有许多个结合点（称为多价）。
3、抗原的抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见
的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。（BIGBEE现象）
2．2．免疫组织化学的应用范围及优点：
2．2．1．应用范围：
(1)提高病理诊断准确性
(2)对疾病的预后和治疗的意义
激素
(3)癌基因蛋白的应用
(4)对肿瘤增生程度的评价
(5)微小病灶的发现
微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）
(6)在肿瘤分期上的意义
(7)指导肿瘤的治疗
(8)免疫性疾病的辅助诊断
(9)病原微生物的检测
2．2．2．免疫组化优点：
(1)特异性强
(2)敏感性高
(3)定位准确、形态与功能的结合
3．免疫组织化学的常用方法
3．1．标本的预处理
取材：（原则上）三对照，常用两对照（内对照）
保存：-40℃～-80℃
固定
玻片处理：
3．2．抗原修复：
抗原破坏的原因
抗原修复方法
A、化学方法：
胰蛋白酶
proteinase
B、物理方法
单纯加热法：
高压加热法：
微波方法：（幻灯）
柠檬酸盐缓冲液
C、修复方法的评价
CSA法 1:50 IgD
CSA法 1:200 IgD
CSA法 1:500 IgD
CSA法 1:1000 IgD
CSA法 1:5000 IgD
3．3．常用免疫组织化学方法：
A、一步法
B、二步法
C、三步法
D、多步法
间接法
金银法
PAP和BigBee
APAAP
ABC法
EnVision法
BT法（CSA：Catalyzed signal amplification）
1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000, 1:106
B、二步法
C、三步法
PAP
APPAP
D、多步法
E. ABC法
F. EnVision
G. CSA法（Catalyzed signal amplification）
BT法
CSA原理图
CSA法 1:50 IgD
CSA法 1:200 IgD
CSA法 1:500 IgD
CSA法 1:1000 IgD
CSA法 1:5000 IgD
H. 免疫组化在细胞凋亡检测中的应用
TUNEL法检测凋亡
（ Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick-end-labling ）
TdT介导的dUTP缺口末端标记
TUNEL染色：直接法
参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：
（1）切片脱蜡至水，双蒸水、PBS液洗；
（2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加热. （3）PBS液洗 5min×3次；
（4）每张切片滴加20ug／ml蛋白酶K液，放于湿盒中37℃孵育15min；
（5）切片置于0.3%H2O2-甲醇液中室温放置20-25min；
（6）滴加TUNEL反应混合液，37℃湿盒中孵育60-90min；
TUNEL反应混合液主要成分：Bio-11-dUTP
TdT酶
（7）PBS液洗5min×3次；
（8）滴加链霉菌素—辣根过氧化物酶液（用PBS液稀释成1:200）37℃湿盒中孵育30min，
（9）滴加新鲜配制的DAB-H2O2液，镜下观察2-10min显色；
（10）自来水充分洗涤；
photoes
I. 免疫组化在原位杂交中的应用
3.4 重要的染色步骤的要点
重要的染色步骤的要点：
ABC法（卵白素—生物素—过氧化物酶连结法）
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗—ABC。最后用底物显色剂显色。
步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；
(2)PBS冲洗，5min×3次；
(3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min；
(4)PBS冲洗，5min×3次；
(5)每张切片滴加非免疫动物血清20min；
(6)每张切片滴加第一抗体，60min；
(7)PBS冲洗，5min×3次；
(8)每张切片加滴加生物素化二抗，60min；
(9)PBS冲洗，5min×3次；
(10)每张切片滴加ABC复合物，60min；
(11)PBS冲洗，5min×3次；
(12)新鲜配制的DAB溶液，3～10min；
(13)自来水冲洗，复染，中性树胶封固。
PAP法
用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联结，最后用底物显色剂显色。
步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；
(2)PBS冲洗，5min×3次；
(3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min；
(4)PBS冲洗，5min×3次；
(5)每张切片滴加非免疫性动物血清，20min；
(6)每张切片滴加第一抗体，60min；
(7)PBS冲洗，5min×3次；
(8)每张切片滴加第二抗体，60min；
(9)PBS冲洗，5min×3次；
(10)每张切片滴加PAP复合物，60min；
(11)PBS冲洗，5min×3次；
(12)新鲜配制的DAB溶液，3～10min；
(13)自来水中洗，复染，中性树胶封固。
SP法（链霉菌抗生物素蛋白─过氧化物酶连结法）
用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成SP法。染色原理同ABC法。国外其他公司亦将此法注册为LSAB法，LAB-SA法和SABC法等。因SP最早建立和报道，其标记技术不断提高，以其稳定染色时间比同类方法短和价格较低而在我国逐渐普及。
步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；
(2)PBS冲洗，5min×3次；
(3)3%过氧化氢甲醇溶液，10min；
(4)PBS冲洗，5min×3次；
(5)每张切片加1滴或50μl非免疫性动物血清，10min；
(6)每张切片加1滴或50μl的第一抗体，60min；
(7)PBS冲洗，5min×3次；
(8)每张切片加1滴或50μ生物素标记的第二抗体，10min；
(9)PBS冲洗5min×3次；
(10)每张切片加1滴或50μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，
10min；
(11)PBS冲洗5min×3次；
(12)每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～
10min；
(13)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。
3．5．各种方法的评价
A、不同酶标记敏感性比较
B、常用免疫组织化学敏感性比较
单纯间接法：
优点：
1、简单、经济
2、无BigBee现象
缺点：
1、敏感性差
2、内源性Ig干扰：二抗是一抗的动物种和类特异的抗体，有可能由于内源性
Ig干扰产生背景。
●PAP法
优点：
1、高敏感性
2、高特异性
缺点：
1、适应性差，针对不同的种属的一，必须有相应的桥和复合物。
2、内源性Ig干扰：①2nd Ab接在内源性Ig上，②PAP接在内源性Ig上。
3、BigBee效应：bell-shaped curve
●ABC法：
优点：
1、高敏感性
2、适应性强：同样的ABC复合物可用于各种抗体的检测中
3、BigBee效应相对弱些
缺点：
内源性Ig干扰
4．免疫组织化学的质量控制及注意事项
4．1．Ab的保存和配制
保存性分装
即用型
配制：选最佳点
4．2．正确的设计和结果判断
4．2．1．阳性对照：已知的阳性对照
4．2．2．内对照：
4．2．3．阴性对照：
(1)用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤
目的：用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。
(2)如果大规模使用抗体，一张切片的阴性区，可能就是另一张切片（不同Ab）
的非特异性染色对照。
正确设计对照方法
免疫组化技术设有：
●阴性对照
●阳性对照
●抑制对照
●吸收对照
●自身对照
在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对照即可。
出现假阳性的几种原因
1、抗体的稀释度不正确、浓度太高。BigBee现象
2、部分多克隆抗体由于特异性等问题将出现异常表达，如S100、Lysozyme、
Myoglobin等可在鳞状上皮细胞中表达。
出现假阴性的几种原因
1、抗体和检则试剂盒配对是否合理。如单克隆抗体（多为鼠），其检测试剂盒
应该用鼠的试剂盒，多克隆抗体（多为兔）应该用兔的试剂盒。
2、抗体的浓度太低。
3、孵育的时间太短。
4、固定和温度。
5、染色步骤是否正确。
6、染色过程中切片过分干燥。
BIGBEE图
出现背景着色的几种原因
1、内源性过氧化酶没有完全阻断。
2、正常动物血清使用不合理，如第二抗体为羊抗鼠IgG，应该用羊的正常血清。
3、脱蜡不够彻底。
4、组织粘贴剂使用不当或太浓。
5、PBS冲洗不够。
6、抗体稀释不合理，浓度太高。
7、底物显以时间太长。
显示剂的合理使用和增强方法
目前最常用的显示剂
●DAB
●AEC
●AP-Red和Fast-Blue
前两种仅能用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的如PAP、ABC和SP
后两种仅能用于碱性磷酸酶（AP）系统的如APAAP和SAP
由于AEC溶于酒精，所以封片时不能用中性树胶，以免退色，而只能用甘油明胶或市售的AEC封片剂。
显示剂的增强方法主要在DAB显示时加上一些金属离子如镍、铜和钴等，现已有市售的产品，不必自己配制。
4．4．底物的选择（幻灯）
DAB: 3.3’-diaminobenizidine
AP: Alkaline phosphatase
AEC
N-AS-Bi-P /NF
N-AS-OL-P /FB.BB
N-AS-OL-P /FB.BN
N-AS-OL-P /FB.RR
N-AS-OL-P /FR.Violet
底物图
（幻灯）
（幻灯）
（幻灯）
（幻灯）
（幻灯）
（幻灯）
（幻灯）
结果判断标准
由于影响因素很多，如不同厂家生产的同一种抗体特异性和敏感性的差异、所用的检测试剂盒特异性和敏感性的差异、技术熟练程序以及固定包埋等，其结果判断的标准化问题尚难统一。
有一些原则必须掌握：
阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性
●间质清晰，无背景着色。
●阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。
●参考评价：
<5% - ， 5%-25% + ， 25%-50% ++， >50% +++
4．3．内源性干扰：
4．3．1．内源性Ig：
人组织中有各种水平的内源性Ig存在，可与二抗有交叉反应。
Dako公司单用高纯化的Biotin标记的F(ab’)2片段，是Ra a mo IgG（重链、轻链的特异片段），这个Ab被广泛的用人正常血清吸附减法交叉反应。
由于CAS系统的高敏感性，与内源性Ig交叉反应仍可检测到，由于内源性Ig的背景染色，最好在血管、淋巴管周围、结缔组织、血管外空白阴性对照染色体识别。
某些类型的上皮，如消化道上皮也可有内源性Ig（IgA）。内源性Ig的染色增加也可以是抗癌修复造成。因此，恰当的阴性对照试剂和阴性对照切片是必须的，室内源性Ig存在时，用来解释阳性结果。
4．3．2．内源性Biotin：
内源性结合活性Biotin可在肝小叶和肾小管上皮中存在。推荐使用Dako-Biotin-Blodcing系统（code No X0590）
内源性HRP：或假HRP活性：
在血红蛋白、肌球蛋白、细胞色素、触酶中存在。还有嗜酸的细胞中，可用3% H2O2来。
4．3．3．内源性AP：
Levamisole 可作为抑制剂
4．3．4．其他：
HBV感染的患者的组织，及HBsAg+患者的组织，有地HRP非特异性阳性。
非免疫血清的应用：来自与二抗同系中动物的正常的非免疫血清，用于阻断步骤中，可能引起假阴性/假阳性，这是由于自身抗体。天然抗体。
5．免疫组化的工作一般常规：
5．1．临床病理学常用抗体的选用
Keratin
Vimentin
S-100
LCA
6。研究型抗体的选用原则：
定义：
生化特点：
染色体定位：
功能：
表达：
在石蜡切片中的检测：
B细胞类抗体： CD20：
定义：
CD20是第一个被识别的人B细胞中位Ig分化抗原。1984年建立于第二次白细胞CD抗原分类合成。
生化特点：
CD20是结构独特的糖蛋白，分子量33～37kDa，它含有三个广泛的疏水区，跨膜四次，长羧基端和氨基端部分定位在胞浆内，很少一部分暴露在细胞外。
染色体定位：11q12-13
功能：
CD20在B细胞中有重要作用，包括细胞周期中、细胞分化中和有丝分裂诱导下的Ig分泌。四个跨膜区和细胞内磷酸化位点使人想起膜转运器或离子通道。有些证明表明CD20本身形成钙离子通道。然而也有可能CD20是离子通道融畅中一个重要的调节成分，而是运转离子本身。
表达：
CD20表达限于正常和肿瘤B细胞。在重链重排后，骨髓前B细胞可以表达，且在B细胞成熟各个时期均持续表达，但进入浆细胞的终末分化后失去表达。大多数B细胞肿瘤表达CD20，包括将近一半的急性淋巴细胞性白血瘤。
在石蜡切片中的检测：
抗体L26在1987年报道在石蜡切片中检测B细胞，并被广泛用于这个目的。继而又表明它与细胞内CD20的表位反应。
CD79
定义：
在1993年第五次白细胞专题会议上，这个B细胞受体复合物中与Ig相关的二聚体蛋白定义为CD79。
生化特点：
CD79二聚体，分子量约70kDa，由二个多肽链构成，二个均属Ig超家簇，一个为CD79a（mb-1或Ig-α）和另一个CD79b（B29或Ig-β）。
染色体定位：
CD79a：19q13.2-13.3
CD79b：17q23
VS38c
定义：
1994年Turley首先报道了这个独特的抗体。
生化特点：
VS38c抗体识别一个64kDa的胸内抗原。
染色体定位：待查
功能：
没有关于VS38c抗体检测的抗原的有关信息。
表达：
在所有组织中，VS38c导致浆细胞的强烈的胞浆染色，其他淋巴细胞不标记。但许多上皮细胞可标记，在某些组织中内皮细胞有弱标记。
CD74
功能：
在内质网中生物合成后，很快通过与MHCⅡ相连，抑制其他多肽加载到MHC-Ⅱ上，直到它转运到内质网。CD74也认识是直接参与Ⅱ类分子从内质网转运到内吞噬体的过程，它在MHCⅡ的胞吞作用中起作用。
表达：
CD74表达在MHCⅡ阳性的细胞上，如B细胞、单核细胞、巨噬细胞、郎罕氏细胞、树突细胞，活化T细胞的各个亚群，胸腺上皮。在细胞素（如 -IF）刺激下，CD74和MHCⅡ表达增强，在炎症中内皮和上皮细胞共表达这二个分子。CD74亦在组织中的标记的分布与MHCⅡ极其类似，与它们共同被调节有关。
CD8图
功能：
与CD45其他形式一样，CD45RO胞内部分有磷酸酶活性，其主要作用是关闭象CD3这样的脱磷酸化分子引起的T细胞反应。在静息T细胞活化期间，一个异构体从
CD45RA转换为CD45RO。这提示CD45RA和CD45RO分别是处女型T细胞和记忆型T细胞的标记。
表达：
大多数胸腺细胞表达CD45RO；CD4和CD8亚群中静息T细胞也阳性；成熟的活化T
细胞也阳性。髓单核系列也可标记。但大多数B细胞是阴性。
在石蜡切片中的检测：
UCHL1是第一个报道用于石蜡中检测T细胞的CD45RO试剂。继而OPD4也有类似的反应性，识别CD45RO。虽然不是特异的针对T细胞（巨噬细胞和某些B细胞也清楚被标记），但这些抗体增加了除了CD3以外在石蜡切片中检测T细胞有价值的选择。
检测遗传特性的抗体：
大细胞间变性淋巴瘤（ALCL）约占人类非何杰金氏淋巴瘤的5%，且在儿童淋巴瘤比例较高。许多病例显示了一个转位特点，5q35上的Nucleophosmin（NPM）基因和2p23上的间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因之间发生了转位。鉴别携带有t（2;5）的ALCL在临床上是重要的，因为它的预后明显地比不带ALK基因改变的ALCL为好。
NPM-ALK融合期产物的鉴别：
ALK基因编码一个跨膜的酪氨酸激酶受体，在胚胎发育的正常组织中表达，但在成年组织中缺失，除了中枢神经系统中有弱阳性表达外。ALK1抗体可检测石蜡组织中的这个正常蛋白，但也检测NPM-ALK融合基因的杂化蛋白。它不标记除了带有t （2;5）ALK(+)-ALCL或它的变种以外的淋巴瘤。极少的带有ALK生长表达的B细胞淋巴瘤例外。
ALK1抗体的诊断性应用：
用免疫组化鉴别ALK，是一个简便的方法，鉴别带有t（2;5）的ALCL包括带上类型和小细胞变种。也可用于识别微小侵润，如侵及骨髓和淋巴结。
用于ALCL的其他抗体
大多数ALCL起源于活化和/或细胞毒T细胞。一个有用的识别ALCL的抗体方案是联合应用抗CD3，抗CD30。抗EMA和抗BMH9也是有价值的标记。
7. 抗体克隆号的意义：
例：示p53的结构图
AA序列克隆号（晶美公司）
88-109 PAb 246
156-214 240
N端 1801
Do-1
Do-7
Pab1620
372-381 Pab421
免疫组织化学技术在病理诊断中的应用题库2-0-8
免疫组织化学技术在病理诊断中的应用题 库2-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列标记可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤的是（） A.CK B.calretinin C.LCA D.CgA E.CD68 CK为上皮性标志物；calretinin为间皮细胞肿瘤标志；CgA为神经内分泌标志物；CD68为组织细胞标志物。LCA为淋巴细胞标志物，因此可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]AFP为下列哪种肿瘤的标记物？（） A.宫内膜癌 B.黑色素细胞瘤 C.肝细胞癌 D.乳腺癌 E.鼻咽癌 AFP为肝细胞癌和内胚窦瘤的标志物；HMB45和S-100为黑色素细胞的标志物；ER和PR为乳腺癌和子宫内膜癌的分化标志物。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于小圆细胞肿瘤的描述，下列错误的是（） A.是一类细胞形态为小圆形的细胞 B.常规诊断基本可以明确诊断 C.免疫组化诊断胚胎性横纹肌肉瘤首选Desmin D.原始间叶性肿瘤诊断困难，可采取排除法 E.免疫组化诊断尤因肉瘤首选CD99 小圆细胞恶性肿瘤是病理学从镜下形态的分类，不能说明肿瘤的组织来源，需要免疫组化进一步诊断。 (吉林快3 https://www.wendangku.net/doc/3f10694812.html,)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列免疫组化结果有助于诊断皮肤Merkel瘤的是（）。 A.Vimentin（+），CK（+），NSE（-） B.Vimentin（-），CK（-），NSE（+） C.Vimentin（-），CK（+），NSE（-） D.Vimentin（-），CK（+），NSE（+） E.Vimentin（+），CK（-），NSE（+） 皮肤Merkel瘤可同时表达CK、NSE，而Vimentin常呈阴性反应。
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
免疫组化原理
免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体的保存： 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
免疫组化技术全程原理
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
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一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项
文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分 文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话： 是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是 项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。 如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。 1.对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。 2.定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
《酶组织化学与免疫组织化学》习题
《酶组织化学与免疫组织化学技术》习题第一部分组织学技术和免疫组织化学技术 一、选择题 （一）A1型题(标准型) 1.C 2.B 3.A 4.C 5.A 8.B 9.C 10.D 14.A 23.D 1.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.免疫染色 D.设立对照试验 E.结果判断 2.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.抗体 C.标记物 D.固定剂 E.洗涤液 3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是 A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。 D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950 B.1960 C.1970 D.1980 E.1990 5.PAP复合物中的酶是 A.辣根过氧化物酶 B.碱性磷酸酶 C.葡萄糖氧化酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶 8.PAP法中的“桥”是 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.第四抗体 9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术 A.1961
B.1975 C.1981 D.1985 E.1990 10.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.链霉素亲和素 14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色 A.4℃ B.20℃ C.40℃ D.37℃ E.50℃ 23．PAS反应是检测组织内的： A.核酸 B.脂 C.蛋白质 D.多糖 E.抗原 一、填空 1、免疫组织化学中最常用的标记物是__荧光素________、___酶_________ 、____生物素和亲和素_______、___________。原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。 2、常用的粘附剂有__________、____________ 、__________等。 3、抗原决定簇是指_____________分子表面的、具有活性的___________。 4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_____________，使其发生反应，形成_____________，能在显微镜下观察。常用于检测__________、____________ 、__________等。 5、酶组织化学是利用酶对其____________的催化作用，生成__________，再与某种__________反应，形成____________沉淀，检测___________分布及活性的方法。常用的方法有___________ 、___________、____________、__________和____________。 6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应PAS。 7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用________和________法。 8、免疫组化中最常用的制片方法是________和________。 9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_________、_________ 和_______。
病理学技术(主管技师)：免疫细胞化学技术考点.doc
病理学技术(主管技师)：免疫细胞化学技术考点 考试时间：120分钟 考试总分：100分 遵守考场纪律，维护知识尊严，杜绝违纪行为，确保考试结果公正。 1、单项选择题 与ABC 法有关的复合物是（ ）A.抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物 B.过氧化物酶-抗过氧化物酶 C.碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶 D.链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物 E.抗体-亲和素-生物素过氧化物酶复合物 本题答案： 2、单项选择题 凝集素是指（ ）A.一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞，因而得名 B.一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的脂蛋白或 能与脂类结合的脂蛋白lE.以AS-MX 为底物、FB/FR 为发色剂时呈蓝色／红色 本题答案： 4、单项选择题 下列有关HRP 的描述，错误的是（ ）A.ICC 染色最为常用的醇 B.特异底物为AS-MX C.在酶反应部位呈棕褐色 D.常用戊二醛作为耦联剂 E.最适pH5～5.5 本题答案： 5、单项选择题 姓名：________________ 班级：________________ 学号：________________ --------------------密----------------------------------封 ----------------------------------------------线----------------------
EPOS法（）A.把生物素耦联到特异性第一抗体上，将生物素化抗体直接和ABC复合物结合 B.先用PAP法，然后用ABC法 C.先用PAP法，后用LAB法 D.抗体亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的一步法 E.HRP-多聚化合物-特异性抗体复合物一步法 本题答案： 6、单项选择题 免疫组织化学染色Envision法的原理是（）A.将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物中的亲和素替换为链亲和素，特异性更高 B.利用线状的葡聚糖分子与大量的AP或HRP酶结合，再将葡聚糖-酶复合物连接到第二抗体上，形成酶-葡聚糖-第二抗体复合物，灵敏度高 C.用AP取代PAP法的过氧化物酶而成，显色对比好 D.将游离酶和抗酶抗体制成稳定的酶-抗酶抗体复合物 E.通过复合物中亲和素的桥梁作用，将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物与生物素化的抗体结合在一起，达到检测抗原的目的 本题答案： 7、单项选择题 酶桥染色法中的桥抗体是指（）A.免疫反应系统中的特异性抗体 B.显色系统中的抗酶抗体 C.第二抗体 D.第一抗体 E.以上均不对 本题答案： 8、单项选择题 PAP-ABC法（）A.把生物素耦联到特异性第一抗体上，将生物素化抗体直接和ABC复合物结合 B.先用PAP法，然后用ABC法 C.先用PAP法，后用LAB法 D.抗体亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的一步法 E.HRP-多聚化合物-特异性抗体复合物一步法
免疫组织化学及其应用
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
免疫组化技术总结(较好)
个人免疫组化感悟（Jane） 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？ 这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37 度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。 相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。 免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。 阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。 如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。 我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。 失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。 如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过
免疫组织化学技术(ABC法)
免疫组织化学技术（ABCxx） 大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和 0.03%H 2O 2的 0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含 0.03%DAB 和 0.006%H 2O 2 的Tris 盐酸缓冲液（pH 7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。 鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P< 0.01。比例尺为100 am。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P< 0.01。 免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。 HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和 B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。 比例尺为20 am。 细胞进行处理后,弃培养基,用 0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。 加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体 (1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次 10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用 488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。
免疫组织化学技术题库1-2-10
免疫组织化学技术题 库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.wendangku.net/doc/3f10694812.html,/)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是（）. A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确 上述均为免疫标记电镜的成功关键。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态（）. A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对 氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书
免疫细胞化学技术题库9-2-10
免疫细胞化学技术题 库9-2-10
问题： [单选,A1型题]应用尚无文献报道的抗血清或自己制备的抗血清进行免疫酶组织细胞化学染色时，必须设置的对照是（） A.交叉实验 B.替代实验 C.吸收实验 D.置换实验 E.阳性对照
问题： [单选,A1型题]可引起免疫酶组织化学染色假阳性的是（） A.组织内待检抗原过多 B.内源性过氧化物酶丰富 C.洗液用TBS缓冲液 D.抗体浓度过低 E.抗体特异性高
问题： [单选,A1型题]免疫酶组织化学染色中过氧化氢液的作用是（） A.提高抗原抗体的识别能力 B.减少内源性过氧化酶的活性 C.修复抗原 D.提高敏感性 E.激活抗原 https://www.wendangku.net/doc/3f10694812.html,/ 月子病
问题： [单选,A1型题]ABC法的基本原理是（） A.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第二抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 B.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第一抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 C.利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 D.利用抗生物素分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 E.利用抗地高辛分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原
问题： [单选,A1型题]BRAB法的基本原理是（） A.用生物素标记抗体，然后与生物素和酶形成复合物 B.用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来 C.用卵白素标记抗体，然后与卵白素和酶形成复合物 D.用卵白素分别标记抗体和酶，然后以抗卵白素为桥，把两者连接起来 E.用亲和素分别标记抗体和酶，然后以抗亲和素为桥，把两者连接起来
免疫组织化学技术题库1-0-8
免疫组织化学技术题 库1-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，对固定剂的要求不包括（）. A.能快速固定抗原 B.能防止抗原物质扩散 C.固定后的抗原能被抗体识别 D.具有氧化活性 E.以上均不正确 固定剂的要求为快速固定抗原、防止抗原物质扩散、固定后的抗原能被抗体识别。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]不同的胶体金颗粒有不同的适用范围，其中5nm以下颗粒适用于（）. A.标记抗原或组织化学法检测 B.液相免疫检测 C.免疫沉淀试验 D.以上都对 E.以上都不对 5nm以下的胶体金颗粒较小，可以用于标记抗原或用于组织化学检测。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。(gta5手机版 https://www.wendangku.net/doc/3f10694812.html,/)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。
免疫组织化学(荧光)方法及问题详解
目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)
1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。