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病理切片的制作过程

1.7.1 修整组织

将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面,各组织块不宜太大,以便固定剂穿透和组织脱水等操作,通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块,以备后用。

1.7.2 组织洗涤

组织经修整后,组织中的福尔马林等必须冲洗干净,尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林,有的不利于染色,有的产生沉淀或结晶影响观察,所以组织修整后应冲洗12h左右。

1.7.3 组织脱水

组织经洗涤后,组织中含有大量水分,由于水与石蜡不能互溶,所以必须将组织中的水分除去。

80%乙醇溶液:2h

95%乙醇溶液:1h

95%乙醇溶液:1h

100%乙醇溶液:30min

100%乙醇溶液:30min

1.7.4 组织透明

由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。

二甲苯Ⅰ:30min

二甲苯Ⅱ:10min

1.7.5 组织浸蜡

浸蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长,需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。

石蜡Ⅰ:1h

石蜡Ⅱ:1h。

石蜡Ⅲ:1h

1.7.6 组织包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡,一起倒入容器内,然后立即投入冷水中,使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时,将纸盒放在温箱旁边,用镊子夹取组织平放于纸盒底部,,再用温镊子轻轻拨动组织,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,沿壁倒入包埋用的纸盒中,速度要慢。待石蜡凝固(约30min)后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素,选择不同熔点的石蜡,新的石蜡一般要熬顿几次,以免石蜡固定后有气泡,影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。

1.7.7 组织切片

(1)从冰箱里拿出蜡块,进行修快

(2)将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

(3)将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。

(4)摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。

(5)调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。

(6)调整厚度调节器到所需的切片厚度,先调约为25um,待切平后改为5um。

(7)一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-60r/min。

(8)切成的蜡带到10-20cm长时,右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

(9)感觉效果较好的蜡片一小段,用单面刀片切取,再放入约43℃的水浴锅中展片,观察切片是否良好。

(10)切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。

1.7.8 贴片

(1)取清洁的载玻片一片,滴一滴粘片剂于玻片中央,然后用洗净的手指加以涂抹,便成均匀薄层。

(2)然后用载玻片直接去滤已经展开的蜡片,将蜡片贴在均匀的粘片剂薄层上。注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上,并使之处于稍偏玻片的一端,一端便于后面的染色步骤,另一端便于粘贴标签。

1.7.9 烘片

把载玻片摆好片位置,放在平盘上置于60℃温箱烘干,经过5小时干燥后即可取出存放于切片盒待染。

1.7.10 脱蜡

染色液多数为水溶液,因此,染色前必须将蜡脱去,使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡,逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反,但是,由于蜡片较薄,所需时间比脱水浸蜡要短的多。

(1)石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡10min;

(2)石蜡切片经二甲苯Ⅱ脱蜡10min;

1.7.11 渗水

放入100%、95%、80%等各级酒精溶液中浸泡,再放入蒸馏水中,使水渗进切片组织。

(1)无水乙醇浸泡1min;

(2)无水乙醇浸泡1min;

(3)95%乙醇浸泡2min;

(4)95%乙醇浸泡2min;

(5)80%乙醇浸泡2min;

(6)自来水洗2min;

1.7.12 染色

切片放入苏木精中染色约7min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

1.7.13 水洗

用自来水流水冲洗约2min。冲洗过程中使切片颜色发蓝,此操作要注意流

水不能过大,以防切片脱落,并可以随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

1.7.14 分化

就是将细胞质着的色褪去,使细胞核着色更加鲜明,也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液(盐酸1份+70%乙醇100份)中褪色,见切片变红,颜色较浅即可,约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键,,如分化不当会导致染色不匀,或深或浅,得到的切片染色效果差。如果染色适中,可取消此步骤。本次实验操作在0.5%盐酸乙醇中浸泡30s;

1.7.15 漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚;细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次

2min。

1.7.16 反蓝

在饱和碳酸锂中浸泡2min;再用自来水洗2min;

1.7.17 复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质,着色浓淡程度应与苏木精染细胞核的浓淡程度相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。本次操作伊红染色6min;

1.7.18 逐级脱水

(1)80%乙醇脱水30s;

(2)90%乙醇脱水30s;

(3)95%乙醇脱水1min;

(4)95%乙醇脱水1min;

(5)无水乙醇脱水2min;

(6)无水乙醇脱水2min;

1.7.19透明

将经过脱水后的切片放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二

甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。本次操作为:

(1)二甲苯Ⅰ5min;

(2)二甲苯Ⅱ10min;

1.7.20 封藏:中性树胶封存

切片经染色、脱水、透明后,即可用封藏剂将其封藏起来,目的是永久保存切片,便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等,另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明,则用树胶作为封藏剂,树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出,则常用甘油明胶作为封藏剂,可用于短期保存标本。

封藏的方法:封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

1.7.21镜检

在光镜下观察染色结果,细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

组织切片过程中的注意事项

1)固定组织所用的固定液要充足,至少相当于标本总体积的5倍以上,标本容器及其口径有适当大小,使标本能原形进行固定,避免使标本遭受挤压。

2)组织块透明在制片中是很重要的环节,如果组织不能透明,其原因可能有脱水未尽、组织太厚、透明时间不够以及与某些组织本身性质有关等。所以从多方面考虑,尽可能使组织达到透明目的,通常根据透明时间与眼观相结合判断透明程度。

3)凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制成好切片,所以制片过程中要保护好组织。

4)固定失时或固定不当的组织,染色时常出现核染色质着色浅、轮廓不清,出现程度不等的片状发白区。

5)组织脱水、透明和浸蜡过度,会造成组织过硬过脆,特别是小动物组织应严格控制。

6)切片刀不锋利,切片时会自行卷起或皱起,不能顺利连成蜡带。切片刀有缺口,易造成切片断裂、破损、不完整及刀痕等现象,不利于切片和观察。

7)组织切片机各个零件盒螺丝应旋紧,切片刀牢牢固定,否则将会产生振动,以致出现切片厚薄不匀和横皱纹等现象。