RNA提取protocol

TRIzol 提取RNA

实验试剂：

TRIzol、氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC水

实验用具：

4℃离心机，1mL、200uL、100uL移液器，1.5mL、200uL EP管，一次性手套、口罩等

操作步骤

1. 样品处理

取新鲜或-70℃冻存小鼠视网膜尽量剪碎，每50-100 mg组织加入1 ml TRIzol，匀浆仪进行匀浆处理。（可先加200uLTRIzol直接用移液枪打碎视网膜，再加TRIzol至1mL）

可选步骤：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而RNA存在于上清中。对于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。吸取上清备用。

2. 将匀浆样品反复吹打几次，在室温条件下静置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

3. 向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml TRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3min。

4. 4℃12,000 rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相（约600μl）转移到一个新的离心管（自备）中。

5. 在得到的水相溶液中加入0.5mL异丙醇（每使用1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇），颠倒混匀，室温放置10分钟。

6. 4℃ 12,000 rpm离心10分钟，弃上清。

7. 加入75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。每使用1 ml TRIzol用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤一次。

8. 4℃7500rpm离心5分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。

9. 室温放置5分钟，晾干。加入30-100 μl无RNase的水，充分溶解RNA（可55~60℃溶解10min），得到的RNA分装于200uL EP管中（每管10uL）。测浓度后保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。