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中国水产科学

Journal of Fishery Sciences of China

第16卷第5期2009年9月

Vol.16 No.5September 2009

收稿日期：2009-02-07；修订日期：2009-03-02.基金项目：国家海洋局第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目（海三科2008011）.作者简介：宋海霞（1977-），女，硕士，助理研究员，主要从事海洋动物生殖生理方面的研究. Tel：0592-*******；E -mail：songhaixia@https://www.wendangku.net/doc/3b18158369.html,

17β-雌二醇对鲻早期精子发生的影响及其作用机制

宋海霞，翁幼竹，方永强

（国家海洋局 第三海洋研究所，福建 厦门361005）

摘要：应用组织学和免疫组织化学的方法，对17β-雌二醇（E 2）影响鲻（Mugil cephalus ）早期精巢的精子发生及其作用机制进行了研究。饲喂含15 mg/kg和50 mg/kg 17β-雌二醇的饲料60 d，以不添加17β-雌二醇的饲喂组为对照。结果表明，幼鲻投喂含E 2饲料前，

对照组和实验组精巢均属早期精巢，胞囊中原始的精原细胞占优势，Sertoli细胞紧贴精原细胞。投喂含E 2饲料后1个月，低剂量组（15 mg/kg ）的4尾幼鲻均出现精原细胞的有丝分裂，有丝分裂细胞的数量多于高剂量组（50 mg/kg ），对照组精巢未见精原细胞的有丝分裂，说明E 2能够诱发精原细胞的分裂。实验结束后投喂E 2组精巢发育处在小生长期，可见精巢中有初级精母细胞存在于精小叶中，而对照组刚刚出现精原细胞的发育分化。用雌激素受体α和β亚型抗体进行免疫组织化学染色发现，对照组和实验组早期精巢中的精原细胞和sertoli细胞均显示强的免疫阳性反应，这为E 2诱发精原细胞有丝分裂的作用机制提供了新的形态学证据。[中国水产科学，2009，16（5）：712-717]关键词： 鲻；精子发生；17β-雌二醇；免疫组织化学

中图分类号：S91 文献标识码：A 文章编号：1005-8737-（2009）05-0714-06

鲻（Mugil cephalus ）广泛分布于热带与亚热带海域，为世界性养殖鱼类，也是中国东南沿海地区重要的养殖鱼类之一。由于鲻在水产养殖中占有的重要的地位，从1930年开始，世界各国就开展了人工繁殖实验，中国台湾于1977年获得鲻人工繁殖成功，但尚未取得生产性突破[

1-2]

。有关鲻生殖细胞的发生及其内分泌调控，已有许多学者进行了研究。何大仁等

[3]对厦门杏林湾鲻性腺进行了组织学研究。林君卓等[4

]

和洪万树等[5]

对鲻精子发生过程进行了组织学和超微结构的观察，将其精巢发育过程划分为5个时期，揭示了鲻精子发生的生物学特点。方永强等[6]

研究发现，17α-甲基睾酮可诱发鲻精巢的精子发生和释精，并发现间质细胞在精子发生中起着重要的作用。最近，O Donnell等[7]

在对啮齿类的研究中发现，雌激素在精子发生中起着重要的作用，从而提出把雌激素物质看作为“雄性激素”的新概念。此后，Bouma等[8

]

利用漂浮器官培养系统进一步发现，17β-雌二醇（E 2）能够增强精子发生之前未成熟虹鳟间质细胞的增殖。近10年来，关于雌激素影响鱼类精子发生及其作用机制已成为研究鱼类精巢发育内分泌调节的新热点[

9-14]

，而国内有关雌激素影响鱼类精子发生的研究则少见报道，因此，在笔者前期研究雄激素诱发鲻精子发生工作的基础上[6]

，进一步探讨17β-雌二醇对鲻早期精子发生的影响及作用机制，旨在为鱼类精子发生的内分泌调控提供新的资料。1　材料与方法1.1　实验鱼

6月中旬从龙海海水鱼类养殖场购买100多尾雄性鲻带回实验室，该鲻取自同批野生鱼苗，经人工养殖2个多月后体长10 cm左右、体质量20.5～22.10 g，性腺刚开始发育。将该鱼随机分为高剂量组、低

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宋海霞等：17β-雌二醇对鲻早期精子发生的影响及其作用机制

剂量组和对照组3个组，每组30尾，每组设2个平行。各组分开养殖在小的养殖池中，暂养1周待恢复摄食后，开始进行实验。

1.2　含雌激素饲料的配制

高剂量组和低剂量组17β-雌二醇（Estradiol-17β，E2，美国Sigma公司产品）的添加剂量分别为50 mg/kg和15 mg/kg饲料。其配制方法是预先将雌二醇溶解在医用100％酒精中，然后均匀喷在颗粒饲料上，反复混合均匀，而对照组饲料仅喷洒不含雌激素的等量酒精，用处理过的饲料分别投喂3组鲻，每天上午800左右各组分别投喂质量为体质量1%的处理饲料，待摄食完毕，下午300左右再投喂正常饲料，每天饲料投喂总量不超过体质量的2.5%～3％，实验持续60 d。

1.3　样品制备

实验开始前先从各组取雄鱼2尾，作为实验前精巢的发育水平对照，实验开始后每2周抽样检查各实验组和对照组鱼性腺发育情况，第1次各组取2尾，之后各组取4尾，60 d后将动物全部处死。实验鱼先用丁香酚麻醉，然后打开腹部仔细分离位于腹腔背面的线状精巢，一侧精巢放入Bouin-Hollane氏液中，另一侧精巢放入不含醋酸的Bouin氏液中，分别固定6～8 h，系列酒精脱水，Paraplast包埋，连续横切片，切片厚5～6 μm，苏木精-伊红染色，用于观察鲻精巢发育的形态特点和分析E2对其精巢发育的影响。

1.4　免疫组织化学

切片经脱蜡水化后，浸入3％H2O2-甲醇液中10 min，以灭活内源性过氧化物酶。按SABC（抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物）法进行免疫组织化学反应。蒸馏水轻洗后，在0.01 mol/L PBS（pH 7.2～7.4）中浸泡5 min，然后滴加110（V/V）的正常山羊血清封闭液，室温下孵育10～20 min，以减少非特异性染色。滴加第一抗体，兔抗人雌激素受体亚型α和β抗体（分别以体积比1600和1300稀释），4 ℃孵育36～48 h。 PBS轻洗后，滴加SABC复合物，在室温下孵育30～40 min，PBS轻洗，最后用3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色10～20 min。对照实验切片采用PBS、正常兔血清替代第一抗体进行同步孵育，染色结果为阴性。

2　结果与分析

2.1　鲻早期精巢的形态结构

饲喂E2前抽样解剖实验组（高剂量、低剂量）和对照组鲻精巢，切片观察精子发生情况。结果显示，3组精巢形态结构和发育水平类似。其精巢均为线条状，外被一层薄的结缔组织，生殖上皮随结缔组织向内延伸，在精巢内形成许多管状的精小管，这些精小管在精巢内互相连接形成精小叶，最后这些输出小管汇合形成一条大的输精管，开口在直肠与输尿管之间的泄殖乳突上。切片观察结果显示，鲻精子发生的排列方式属叶状结构（Lobular structure），它们均为早期发育精巢，其共同特点是多个精原细胞（通常3～5个，有的多达8个）被结缔组织包裹在一起，呈不规则形或长椭圆形，细胞沿管周排列，形成胞囊结构（图版Ⅰ-1）。胞囊内可见2种类型精原细胞：一种是原始的精原细胞（Primordial spermatogonia，或称为A型精原细胞），其特点是细胞体积大，为卵圆形或椭圆形，紧贴生殖上皮，胞径15.38～19.24 μm，核径8.78～12.09 μm，核居中或偏于一侧，有1个核仁，着色较深，核质分布较均匀，核膜清晰，胞质着色差。另一种是B型精原细胞，靠近生殖上皮，细胞为椭圆形，胞径8.45～12.32 μm，核径5.12～7.84 μm，核位于中央，有1个大的核仁，居中或偏于一侧，核质嗜碱性很弱，细胞质不着色（图版Ⅰ-2）。精原细胞外为Sertoli 细胞所包围，Sertoli细胞在光镜下只能见到细胞核，为不规则形、椭圆形或长形，在光镜下常可见Sertoli 细胞紧贴精原细胞（图版Ⅰ-1、2、3）。此时，在生精小管内有多个胞囊组成，在早期胞囊中可见原始的精原细胞与Sertoli细胞紧密排列。

2.2　17β-雌二醇对精巢发育的影响

在7月上旬，实验组（高剂量、低剂量组）和对照组雄鱼精巢切片没有显著差异。但从7月15后进行精巢切片观察发现，实验组精巢发育出现明显的变化，用高倍和油镜观察均发现低剂量组4尾鲻早期精

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中 国 水 产 科 学

巢中均出现精原细胞的有丝分裂，其特征为核内染色质的凝集（图版Ⅰ-4、5），而高剂量组虽然也见精原细胞的有丝分裂，但进入分裂的精原细胞数量显然没有低剂量组多（图版Ⅰ-6），而对照组在多个切片中均未见此现象（图版Ⅰ-7）。8月中旬，对低剂量和高剂量实验组组织切片的观察结果显示，此时精巢发育为Ⅱ期，其特点是除靠近生殖上皮有多层精原细胞以及紧贴其边缘的Sertoli细胞外，还可见初级精母细胞位于精小叶的中部，表明精巢发育进入小生长时期（图版Ⅰ-8、9）。对照组精巢也出现进一步发育，表现在精原细胞开始发育分化，有少数初级精母细胞分散在精小叶中，但精巢发育仍处于Ⅰ-Ⅱ期（图版Ⅰ-10）。

2.3　雌二醇诱发精原细胞分裂的机制

用雌激素受体α和β亚型抗体对鲻早期精巢进行免疫组织化学研究。结果显示，对照组与低、高剂量组精巢的精原细胞和Sertoli细胞对这2种受体亚型显示免疫活性，阳性物质定位在沿胞膜分布的胞质或细胞核（图版Ⅰ-11～14），这为研究17β-雌二醇诱发精原细胞有丝分裂的机制提供了形态学证据。3　讨论

鱼类精子发生由3个主要时相组成，即精原细胞有丝分裂增殖，精母细胞成熟分裂和精子形成[9]。研究表明，雄性鱼类精子发生的内分泌调节像其他脊椎动物一样，也受到腺垂体分泌的黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激激素（Follicle stimulating hormone，FSH）调节，LH通过它的靶细胞—Leydig细胞（间质细胞）受体的表达，产生类固醇激素11-酮基睾酮（11-ketotestosterone，11-KT）（被公认为硬骨鱼类一种潜在雄激素）激活精子发生[10-11]。长期以来一直认为雄激素中主要是11-KT能够激活精原细胞的增殖。然而，最近研究表明，鱼类精子发生，从精原干细胞更新到精子成熟都是受类固醇激素的控制。日本学者Miura等[12]以日本鳗鲡（Anguilla japonica）为模型来研究鱼类精子发生，采用埋植和离体器官培养技术，发现E2可有效地诱导日本鳗鲡在体精巢和离体培养精巢组织精原细胞干细胞的分裂，并且这种分裂可被三苯氧胺（Tamoxifen，一种抗雌激素受体药品）所抑制，这表明雌激素在精子发生早期是一种不可缺少的“雄激素”。Miura等[13]还使用离体精巢悬浮器官培养系统来揭示类固醇激素诱发鳗鲡精子发生的内分泌机制，研究结果有力地证明了精原细胞干细胞的更新受天然雌激素E2的调节，而11-KT则起诱导和促进作用。Bouma等[8]利用离体漂浮器官培养系统还发现，将浓度为18.3 nmol/L的E2加入到培养基能明显增加虹鳟间质细胞的增殖。而此前先用雌激素受体拮抗剂处理则无这种增殖效应。他们认为E2能够增强精子发生之前未成熟虹鳟间质细胞的增殖。本研究通过将E2拌在饲料中投喂性腺刚分化的雄性幼鲻，持续投喂1个月后，发现低剂量和高剂量组均出现精原细胞的有丝分裂，且低剂量组精原细胞分裂数量多于高剂量组，而对照组精巢则没有出现这种变化。从而证实，投喂E2也能够有效诱导精原细胞的增殖。同时，本研究还进一步观察到E2有促进精子发生的作用，其证据为实验结束（60 d）后检查精巢组织切片，实验组精巢已进入小生长时期，精巢中出现初级精母细胞，而对照组精巢则没有观察到以上现象。关于E2诱导精原细胞增殖的机制，本研究的结论与Miura等[12-13]和Bouma 等[8]的结论一致，即E2首先必须通过与其相应受体结合，诱发细胞生理效应。应用雌激素受体拮抗剂使E2的生理效应消失就是一个例证。但是，这些学者没有进一步检查实验鱼精巢中精原细胞是否存在雌激素受体，为此，本研究采用免疫组织化学技术对雌激素2种亚型受体进行定位，结果发现，实验组和对照组幼鲻早期精原细胞均存在这2种亚型受体，阳性物质定位在胞核和沿胞膜分布的胞质。此结果不但证实了雌激素受体在鲻性腺的定位[14]，还为Miura 等[12]和Bouma等[8]提出的E2诱导精原细胞增殖的作用是通过其受体介导这一推断提供了新的证据。本研究认为E2诱导幼鲻精原细胞的有丝分裂机制还十分复杂，不仅仅简单地是E2通过雌激素受体的介导就能够诱导精原细胞的有丝分裂，因为E2和11-KT

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宋海霞等：17β-雌二醇对鲻早期精子发生的影响及其作用机制

的作用还受到Sertoli细胞产生的其他因子的调节[13]。本实验也观察到Sertoli细胞存在雌激素受体，提示E2的作用与Sertoli细胞功能之间存在密切关系，它们内在的复杂关系有待深入研究。　

参考文献：

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[3] 何大仁，肖金华，石燕飞.厦门杏林湾普通鲻鱼性腺组织学研究[J].

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[5] 洪万树，翁幼竹，林君卓，等.鲻鱼精子发生和形成的超微结构研究

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[6] 方永强，李正森.17α-甲基睾酮刺激鲻鱼精子发生机制的初步研

究[J]. 海洋与湖沼，1989，20（1）：10-14.[7] O Donnell L，Robertson K M，Jones M E，et al. Estrogen and

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716 第16卷

中 国 水 产 科 学

Effects and mechanism of estradiol-17β on early spermatogenesis of grey mullet，Mugil cephalus

SONG Hai-xia， WENG You-zhu， FANG Yong-qiang

（The Third Institute of Oceanography of the State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China）

Abstract：Using histological and immunohistochemical methods，the effects and mechanism of estradiol-17β（E

）on

2 early spermatogenesis of grey mullet，Mugil cephalus were investigated. Experimental groups were fed with commercial diet containing 15 mg/kg（low dosage）and 50 mg/kg（high dosage）estradiol-17β for 60 days. Control group was fed with basic feed without additive. Results indicated that testises of experimental and control groups were both in the same developmental level at the beginning of the experiment，and the primordial spermatogonia absolutely predominated in cyst with sertoli cells clinging to spermatogonia. After 1 month feeding，mitosis in spermatogonia could be observed in experimental groups with mitosis cell number in low-dose group significantly more than that in high-dose group，and no mitosis was observed in control group. Above results showed E2 could hasten cell ’s division. At the end of the experiment，primary spermatocytes cound be found in seminiferous lobules of testis in experimental group. However，at the same time spermatogonia just began to differentiate in control group. Estrogen receptor α and β subtypes in the early testis of grey mullet were localized in spermatogonia and sertoli cells by using immunohistochemical method，which provided morphological evidence for deeply studying the mechanism of E2 in inducing spermotogonia’s mitosis. [Journal of Fishery Sciences of China，2009，16（5）：712-717]

Key words：Mugil cephalus；spermatogenesis；estradiol-17β；immunohistochemistry

图版Ⅰ

1：精原细胞（箭头），sertoli细胞（粗箭头）×560. 2：低剂量组鲻精巢，A型精原细胞（箭头A ），B型精原细胞（箭头B ），sertoli细胞（粗箭头） ×840. 3：高剂量组精巢，原始精原细胞（箭头），sertoli细胞（粗箭头）×840. 4：低剂量组投喂17β-雌二醇30 d后，可见精原细胞有丝分裂（箭头）×840. 5：图4的放大，可见有丝分裂前期的染色质凝集（箭头）×1 200. 6：高剂量组可见少数有丝分裂精原细胞（箭头）×750. 7：对照组鲻精巢未见精原细胞有丝分裂×560 . 8：投喂结束后，低剂量组鲻精巢进入小生长期，可见初级精母细胞（箭头）×700. 9：投喂结束后，高剂量组精巢可见初级精母细胞（箭头）×840 .10：投喂结束后，对照组精巢出现精原细胞的变化×700. 11：对照组雌激素受体α亚型定位于精原细胞核或胞质（箭头）以及sertoli细胞（粗箭头）×280. 12：低剂量组雌激素受体α亚型定位于精原细胞核（箭头）或胞质以及sertoli细胞（粗箭头）×450. 13：对照组雌激素受体β亚型定位于精原细胞核（箭头）和sertoli细胞（粗箭头）×840. 14：高剂量组雌激素受体β亚型定位于精原细胞核（箭头）和sertoli细胞（粗箭头）×750.

Plant Ⅰ

1：spermatogonium （arrow ），sertoli cell （thick arrow ），×560. 2：Testis of grey mullet in low -dose group，type A spermatogonium （arrow A ），type B spermatogonium （arrow B ），sertoli cell （thick arrow ），×840. 3：Testis in low -dose group. Primordial spermatogonia （arrow ），sertoli cell （thick arrow ），×840. 4：Spermatogonia， in mitosis after feeding estradiol -17β for a month （arrow ），×840. 5：Magnification of figure 4，chromatin condensation in mitotic prophase （arrow ），×1 200. 6：There were few spermatogonia in mitosis （arrow ）in high -dose group，×750. 7：There were no spermatogonia in mitosis in control group，×560. 8：Testis of grey mullet in low -dose group entering into primary spermatocyte stage （arrow ） at the end of feeding，×700. 9：Primary spermatocytes in high -dose group at the end of feeding，×840. 10：Spermatogonia in control group changed at the end of feeding，×700. 11：ER -α were localized in nucleus or cytoplasm of spermatogonia （arrow ） and in sertoli cells （thick arrow ）in control group，×280. 12：ER -α were localized in nucleus or cytoplasm of spermatogonia （arrow ） and in sertoli cells （thick arrow ）in low -dose group.×450. 13：ER -β were localized in nucleus （arrow ）of spermatogonia and sertoli cells （thick arrow ）in control group，×840. 14：ER -β were localized in nucleus （arrow ）of spermatogonia and sertoli cells （thick arrow ）in high -dose group，×750.

宋海霞等：17β-雌二醇对鲻早期精子发生的影响及其作用机制SONG Hai -xia et al： Effects and action mechanism of estradiol -17β on early spermatogenesis of grey mullet，Mugil cephalus

1

234

56789

1011121314

B

A

17β-雌二醇对鲻早期精子发生的影响及其作用机制

作者：宋海霞， 翁幼竹， 方永强， SONG Hai-xia， WENG You-zhu， FANG Yong-qiang

作者单位：国家海洋局,第三海洋研究所,福建,厦门,361005

刊名：

中国水产科学

英文刊名：JOURNAL OF FISHERY SCIENCES OF CHINA

年，卷(期)：2009，16(5)

被引用次数：0次

参考文献(14条)

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4.林君卓.翁幼竹.方永强鲻鱼精子发生的组织学研究 2001(01)

5.洪万树.翁幼竹.林君卓鲻鱼精子发生和形成的超微结构研究 2001(05)

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7.O'Donnell L.Robertson K M.Jones M E Estrogen and spermatogenesis 2001

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9.Schulz R W.Miura TI Spermatogenesis and its endocrine regulation 2002

10.Holderaft R W.Braun R E Hormonal regulation of spennatogenesis 2004

11.Schulz R W.Cavaco J E B.Santos E M C,onadotropins,their receptors,and the mgulation of testieular functions in fish 2001

12.Miura T.Miura C.Ohta T Estradiol-17beta stimulates the renewal of spermatogonial stein cells in males 1999

13.Miura T.Miura C Japanese eel:Amodel for analysis of spermatogenesis[Review 2001

14.方永强.张为民.翁幼竹17β-雌二醇促进鲻鱼性腺发育的作用机制:雌激素受体的定位 2003

相似文献(4条)

1.期刊论文林君卓.翁幼竹.方永强.洪万树.LIN Jun-zhuo.WENG You-zhu.FANG Yong-qiang.HONG Wan-shu鲻鱼精子发生的组织学研究

-台湾海峡2001,20(1)

本文报道用组织学方法研究了不同季节鲻鱼的精巢结构和精子发生过程．结果表明，鲻鱼精巢属于叶状结构．根据精子发生的特点，分为5个时期：精原细胞增殖期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精子形成期和精子成熟期．依雄性鲻鱼精子发育和成熟的季节来看，厦门鲻鱼繁殖季节为每年11～12月，系一次性排精类型．文中详细描述各级生精细胞的特征，并讨论了Sertoli细胞在精子发生中的生理作用．

2.学位论文李名友青鳉piwi和vasa基因的表达模式和功能分析2008

在大多数动物里，早期的胚胎发育产生两大类细胞：体系细胞和种系细胞。种系细胞源于原始生殖细胞(PGC)，PGC是从早期胚胎的体细胞中分化而来的，经过长距离的跋涉迁移到生殖腺，然后形成精子和卵子，精卵结合产生新的个体，从而保证物种的延续和进化。因此了解生殖细胞的形成、发育及其命运维持的分子机制对操作生殖细胞极为关键。作为生殖细胞的标记基因，piwi和vasa的表达模式和功能分析在物种间广为研究。本文旨在以青鳉为模式生物，研究piwi和vasa的表达模式及其在鱼类生殖细胞形成与发育过程中的作用。

Piwi基因最早是从果蝇卵巢中分离出来的，对生殖干细胞的增殖和分裂有调控作用，其功能在进化上具有保守性。目前青鳉piwi的研究还没有报道，本研究克隆到的青鳉piwi基因(opiwi)cDNA全长为2.9kb，编码857个氨基酸，在N端和C端分别具有保守的PAZ结构域和PIWI结构域。系统树显示opiwi属于piwi亚族，和斑马鱼的piwi相似性最高。Opiwi和人的piwi基因具有相似的基因结构和染色体分布。Opiwi RNA是母源性的，在整个胚胎发育过程都有表达。在早期的胚胎发育过程中，Opiwi RNA和蛋白均匀分布在每个卵裂球；在体节期，opiwi除了在PGC大量表达外，我们还发现其在眼睛、脑以及尾部等体细胞也有微弱表达。oPiwi蛋白以颗粒状分布在PGC的核周。在成体组织里，opiwi RNA和蛋白虽然在性腺大量表达，在眼和脑神经系统也有表达。在性腺里，opiwi RNA和蛋白仅在生殖细胞里有表达，而在其他体细胞则没有表达。在卵子发生过程中，opiwi在卵原细胞和早期的卵母细胞大量表达，随着卵子发育，其表达逐渐下降，在成熟的卵母细胞里，其信号呈点状或薄层分布；在卵母细胞里，opiwi和线粒体共定位于卵子的生殖质结构巴尔氏小体(Balbiani body)；我们还发现在卵原细胞里，oPiwi蛋白以中空的颗粒分布在其核周；此外oPiwi蛋白除了在细胞质有分布外，在细胞核也有分布，其细胞核定位和PCNA(proliferating cell nuclearantigen)及线粒体相同。在精子发生过程中，opiwi RNA和蛋白在精原细胞和精母细胞大量表达，opiwi的RNA在精子细胞和精子里没有信号，而其蛋白在精子细胞和精子里持续表达，且和线粒体共定位于生精细胞的生殖质结构拟染色体(chromatoid body)；oPiwi蛋白在精原细胞的细胞质和细胞核都有分布，而在其他生精细胞则只在细胞质有分布。oPiwi还以中空的颗粒结构分布在精原细胞的核周。在干细胞系中，opiwi RNA和蛋白都有大量表达，其蛋白在细胞质和细胞核均有分布。此外，我们还发现opiwi3'非编码区

(3'untranslatedregion，3'UTR)在囊胚晚期(9hpf)就能特异性地标记PGC，而目前报道最早能区分青鳉PGC的nanos3' UTR则是在原肠早期(13hpf)。我们通过减少或增加opiwi的表达来研究其功能，PGC用nanos启动子驱动的绿色荧光和vasa启动子驱动的绿色荧光双标记(NgVg)，这样我们可以从原肠中期就可以追踪PGC的发育。结果表明注射opiwi的

Morpholino(MOpw)消减opiwi的表达对PGC发育和早期胚胎发育以及体细胞发育具有双重作用：MOpw导致PGC数目减少以及异位PGC，同时早期的胚胎发育和晚期胚胎发育的体细胞的发育也受影响；体外细胞培养表明，注射MOpw导致PGC和体细胞的分裂受阻。而MOpw和opiwi的RNA共注射能挽救MOpw的表型。进一步的实验表明是母源性的opiwi影响生殖细胞的发育和早期的胚胎发育，而合子性的表达仅影响晚期胚胎的体细胞发育。过量表达正常或缺失去掉PAZ结构域的RNA也影响生殖细胞发育和胚胎发育。因此，opiwi除了影响青鲻的生殖细胞的形成发育这一高度保守的功能外，我们还发现其在体细胞的发育也起着重要作用。

Vasa是进化上功能保守的翻译调控因子。它最初从果蝇中分离出来，对前后轴的极化和生殖细胞的形成是必需的。vasa同时在其他物种的生殖细胞的发育也起着重要作用，但它在早期的胚胎发育和生殖细胞的发育中的具体功能还不清楚。迄今，青鳉的vasa RNA仅见于生殖细胞，vasa启动子的活性亦是生殖细胞特异的，其蛋白的表达尚无详细的报道。本研究表明vasa RNA和蛋白的表达模式和opiwi基本一致，即是母源性的，在胚胎发育的原肠前期表达很强，随后开始降低。在早期的胚胎发育过程中，vasa均匀分布在每个卵裂球；在器官发生期，vasa除了在PGC大量表达，此外还在体细胞如脑、躯干和尾部也有表达。Vasa蛋白和oPiwi蛋白以中空的颗粒分布在PGC以及性原细胞的核周。在成体组织中，vasaRNA除在性腺大量表达外，在体细胞也有微弱表达。Vasa RNA和蛋白仅在性腺的生殖细胞有表达。在卵子发生，vasa RNA和蛋白在整个卵子发生都有表达，且和oPiwi共定位于巴尔氏小体。Vasa蛋白在卵母细胞的细胞质和细胞核都有分布。在精子发生阶段，vasa RNA和蛋白在精原细胞和精母细胞大量表达，vasa RNA在精子细胞和精子里没有信号，而其蛋白在精子细胞和精子也有微弱表达。Vasa蛋白在精原细胞的细胞质和细胞核都有分布，而在其它生精细胞仅在细胞质有表达。在精子细胞和精子阶段，Vasa和oPiwi共定位于拟染色小体。与其表

达模式相对应的是，vasa在青鳉鱼PGC的发育和体细胞的发育过程中具有双重作用。注射MO消减vasa的翻译表达，PGC不能迁移到目的地一生殖腺。单个细胞的体内体外实验表明消减vasa的表达不改变PGC的动性，存活能力和分裂。即使在性腺外的异位PGC也具有动性，能够存活和分裂。将注射MOvas的胚胎的细胞在中囊胚时期移植到同样时期的野生型胚胎

，PGC不能迁移到生殖腺。并且，注射MOvas，还会导致早期发育阶段胚胎大量死亡，活着的胚胎也伴随大量体系细胞的死亡；将注射MOvas后的胚胎的细胞在原肠早期分离出来，在体外培养第四天，也观察到大量的体细胞死亡。因此，我们推测vasa在青鳉的胚胎发育过程中具有双重作用：在生殖细胞的发育过程中，它对生殖细胞的迁移是必要的、自主性的

；在体系细胞中，它在原肠期胚胎分层和体细胞的维持方面起着重要作用。我们还证实了生殖腺外异位的PGC和体外培养的PGC有维持着它自身特性的能力，即PGC的特性是自主性的。

综上所述，opiwi和vasa主要在青鳉的生殖细胞里表达并起作用，同时我们也证实这2个基因在体细胞发育具有新功能。

3.期刊论文洪万树.翁幼竹.林君卓.方永强.戴燕玉鲻鱼精子发生和形成的超微结构研究-海洋学报2001,23(5)

用透射电子显微镜研究了鲻鱼精子发生和精子形成过程.结果表明,鲻鱼早期精巢有两种类型的精原细胞,即A型和B型,在B型精原细胞可见核旁有类核周体(nuage),可视为精原细胞向初级精母细胞发育分化的一个重要标志.初级精母细胞减数分裂早期同源染色体配对明显可见,精子细胞之间存在着间桥联系.鲻鱼成熟精子的特点是细胞核呈马蹄形,核凹较浅

,核前端无顶体,核内染色质呈粗颗粒状,核膜与质膜之间有较大的空隙.中段较短,近端中心粒和远端中心粒互相垂直.精子尾部细长,横切面为典型的"9+2"双联微管结构,两侧有侧鳍.

4.学位论文曹谨玲奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的克隆及分子生物学特征和功能分析2007

罗非鱼是原产于非洲的热带鱼类，现已成为世界性的主要养殖鱼类。在生产上，罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快40-50％，因此提高罗非鱼雄性率具有重要实践意义。在各种罗非鱼杂交组合中，奥尼杂交鱼的雄性率最高，为95％，但根据染色体决定性别理论，其雄性率应为100％。由于鱼类的性别决定机制是多样的和易变的，较高等动物要复杂得多，因而通过分子生物学的研究从基因水平进行探讨，是一条揭示罗非鱼性别控制机理的好途径，为进一步提高罗非鱼雄性率奠定基础。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了奥利亚罗非鱼的DMO和DMT基因，并对它们的表达特性进行了研究，这将有助于了解奥利亚罗非鱼的性别决定机制，从而采取人为控制措施，对奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交产生全雄杂交后代的理论研究和生产实践具有重要意义。

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢分离、克隆DMO和DMT基因，并进行序列测定与生物信息学分析。结果表明，DMO基因cDNA序列全长1571 bp[不含poly(A)]，包括148 bp 5’非翻译区，1230 bp阅读框以及含Poly(A)信号AATAAA的193 bp3’非翻译区[不包括Poly(A)]，阅读框共编码409个氨基酸，与尼罗罗非鱼DMO进行比较

，同源性为96.3％，说明DMO在同物种间差别较小。而与尼罗罗非鱼，红鳍东方豚，虹鳟，青鲻，鼠，人等动物的DMRTl进行比较，同源性分别为

：25.7％，25.8％，24.3％，29.7％，22.5％，22.0％。DMT基因cDNA序列全长1260 bp，包括74 bp 5’非翻译区，879 bp阅读框以及含poly(A)信号AATAAA的307 bp 3’非翻译区

，阅读框共编码292个氨基酸。序列同源性分析表明，不同进化地位动物的DMRT1基因DM域编码序列存在高度同源性，显示DMRT1基因在系统进化上高度保守。生物信息学分析结果表明，DMO蛋白具有两个亲水性螺旋卷曲区域，97～112，155～168氨基酸区域，没有信号肽，含有两个跨膜结构域，发生跨膜运动。DMT蛋白不含螺旋卷曲区域，没有信号肽，是一个非跨膜的亲水性稳定蛋白，该蛋白以游离形式存在于细胞质内，不会发生跨膜运动。DMO和DMT包含两个相同的保守的功能结构域，分别行使性别调控，使DNA形成二聚体和结合回纹结构的功能。DMO和DMT都含有多个磷酸化位点，推测它们可能在细胞信号传导中发挥作用，且其生物活性可能接受信号途径中多种信号的调控。DMO蛋白N-端第

1～5，41～51，65～67，86～89，98～110，154～170，183～203，205～248，258～264，284～291，293～298，270～375，389～392，402～410区域和DMT蛋白N-端第

1～9，17～28，77～84，114～123，131～139，157～184，196～207区域可能是B细胞表位优势区域。DMO和DMT的高级结构相似，都含有两个a-螺旋区域。采用荧光定量RT-PCR方法，从mRNA水平对奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的时空表达谱进行了研究。结果发现，这两个基因均从原肠胚早期开始转录，一直到出膜，都维持着较高的表达水平，但DMO表达量明显高于DMT。鱼苗性腺分化时期，激素处理可显著提高奥利亚罗非鱼的雌、雄比率，还可影响DMO和DMT基因的表达量，提示它们可能与激素调控有关。在雌、雄鱼的肝和肾等5种组织中均检测不到这两个基因转录本的存在；在脑中仅可检测到DMO基因不同强弱的转录本，呈现出很强的中枢神经系统的表达特异性。此外，在成体的卵巢和精巢中分别只可检测到DMO和DMT基因的大量表达，显示二者在性别决定和分化中的重要功能。奥利亚罗非鱼DMO基因在其中枢神经系统发育及卵巢发生和功能维持上有着重要功能；DMT基因在精巢发生和功能维持上起重要作用。

为了进一步分析这两种基因mRNA在胞内的表达情况，利用原位杂交分析了奥利亚罗非鱼端脑、下丘脑、垂体、性腺、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉等组织中DMO和DMTmRNA的表达情况，结果表明：DMO只在奥利亚罗非鱼的卵巢中表达；DMT仅在其精巢中表达。在奥利亚罗非鱼卵子发生中，DMO mRNA均匀分布于卵原细胞和各期卵母细胞的胞质中；在卵原细胞和Ⅰ、Ⅱ期卵母细胞中，随着卵母细胞的发育，DMO mRNA的杂交信号逐渐增强，最后充满整个胞质中。Ⅲ期卵母细胞中，DMO均匀分布在卵黄颗粒之间的细胞质中。Ⅳ期以上的卵母细胞胞质中，相对于前三个时期DMO mRNA的杂交信号明显减弱，整个胞质都呈现较淡的黄色，有向胞质外周皮质层迁移集中的趋势。当卵黄充满整个胞质之后，在整个卵母细胞中无DMO mRNA的杂交信号。在奥利亚罗非鱼精子发生中，DMT mRNA可在精原细胞和初级精母细胞中检测到。DMT mRNA的阳性信号在精原细胞中极为强烈，在初级精母细胞中较为微弱，而精子细胞中没有阳性信号。结果初步表明，奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因对于生殖干细胞．卵原细胞和精原细胞的维持和正常功能可能起着重要作用。

为了进一步探讨奥利亚罗非鱼DMO和DMT的功能，本研究采用RT-PCR方法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢中克隆出DMO和DMT全长cDNA片断，构建了pMAL-c2x/DMO和pMAL-c2x/DMT重组质粒，成功地表达了DMO和DMT蛋白，发现在IPTG诱导4h后，目的蛋白可达到细菌总蛋白的50％左右。同时通过免疫印迹技术证明了这两种蛋白的免疫原性。经Xa切割、Aanylose-sepharose柱层析纯化后作为抗原免疫新西兰白兔制备了DMO和DMT多克隆抗体，并进行纯化。通过对纯化多抗进行Western blot分析，结果表明获得了高特异性的DMO和DMT抗体。

为了观察DMO和DMT在组织中的表达谱，首先，本研究制备了多种组织匀浆蛋白，使用纯化的抗体进行Westem blot分析，仅分别在卵巢和精巢中检测到DMO和DMT蛋白的表达；制备奥利亚罗非鱼多种组织切片，使用纯化的DMO和DMT多抗进行免疫组织化学分析，发现DMO仅在卵巢表达，而DMT仅在精巢表达，但其特异性低于原位杂交。以上结果有助于阐明DMO和DMT的功能及在鱼类性别调控中的作用。本研究首次从奥利亚罗非鱼中克隆到性别调控基因DMO和DMT，并分析了它们的表达特征及可能的功能。奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的成功克隆及分子生物学特征和功能分析不仅为DMRT基因的分子进化和相似性比较研究提供了新的材料，而且对于进一步研究鱼类性别调控及DMRT基因的结构和功能有着重要的理论价值和研究前景。

本文链接：https://www.wendangku.net/doc/3b18158369.html,/Periodical_zgsckx200905009.aspx

授权使用：吕先竟(wfxhdx)，授权号：b39b483a-92b7-4e0c-a150-9e8a00e64e0e

下载时间：2011年2月14日

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