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实验12-微生物菌种常用简易保藏法

实验12-微生物菌种常用简易保藏法
实验12-微生物菌种常用简易保藏法

实验15 微生物菌种保藏方法

一、实验原理

为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力,使其存活,和丢失,不污染,不发生变异。根据微生物自身的生物学特点,通过人为的创造条件,使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中,以使微生物的生长受到抑制,新陈代谢作用限制在最低范围内,生命活动基本处于休眠状态,从而达到保藏的目的。

常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备,操作简便易行,故为一般实验室及生产单位所广泛采用。

常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏,并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖,从而延长保藏时间。

液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上,覆盖一层已灭菌的液体石蜡,再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用,使外界空气不与培养物直接接触,从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长,从而延长保藏时间。

含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油,然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂,甘油透入细胞后,能强烈降低细胞的脱水作用,而且,在-20或-70℃条件下,可大降低细胞代谢水平,但却仍能维持生命活动状态,达到延长保藏时间的目的。

沙土管保藏法,将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上,经培养后,制后孢子悬浮液,无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中,孢子即吸附在沙土上,将沙土管置于真空干燥器中,通过抽真空达到吸干沙土管中水分,然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖,从而延长保藏时间。

二、操作步骤

(一) 斜面传代保藏法

l.贴标签取各种无菌斜面试管数支,将注有菌株名称和接种日期的标签贴上,贴在试管斜面的正上方,距试管口2~3cm处。

2.斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上,细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞,而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。

3.培养细菌37℃恒温培养18~24h,酵母菌于28~30℃培养36~60h,放线菌和丝状真菌置于28℃培养4~7d。

4.保藏斜面长好后,可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌,管口棉花应用牛皮纸包扎,或换上无菌胶塞,亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。

保藏时间依微生物种类而不同,酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2~6个月,移种一次;而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异,污染杂菌的机会较多。

(二) 液体石蜡保藏法

l、液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,12l℃湿热灭菌30min,于105~110℃烘箱中lh,以除去石蜡中的水分。

2、接种培养同斜面传代保藏法。

3、加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上,加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。

4、保藏棉塞外包牛皮纸,将试管直立放置于4℃冰箱中保存。

利用这种保藏方法,霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右,酵母菌可保藏1~2年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。

5、恢复培养用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种,在试管壁上轻靠几下,尽量使油滴净,再接种于新鲜培养基中培养。由于菌体表面粘有液体石蜡,生长较慢且有粘性,故一般须转接2次才能获得良好菌种。

(三) 沙土管保藏法

l、沙土处理

(1)沙处理:取河沙经40目过筛,去除大颗粒,加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2~4h(或煮沸30min),以除去有机杂质,然后倒去盐酸,用清水冲洗至中性,烘干或晒干,备用。

(2)土处理:取非耕作层瘦黄土(不含有机质),加自来水浸泡洗涤数次,直至中性,然后烘干,粉碎,用100目过筛,去除粗颗粒后备用。

2、装沙土管将沙与土按2:1,3:1或4:1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm×100mm,装置约7cm高,加棉塞,并外包牛皮纸,12l℃湿热灭菌30min,然后烘干。

3、无菌试验每10支沙土管任抽一支,取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中,在最适的温度下培养2~4d,确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌,经重新灭菌后,再作无菌试验,直到合格。

4、制备菌液用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上,用接种环轻轻搅动,制成悬液。

5、加样用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1~0.5mL加入沙土管中,用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。

6、干燥将含菌的沙土管放入干燥器中,干燥器内用培养皿盛P

2O

5

作为干燥剂,可再用

真空泵连续抽气3~4h,加速干燥。将沙土管轻轻一拍,沙土呈分散状即达到充分干燥。

7、保藏沙土管可选择下列方法之一来保藏:

(1) 保存于干燥器中;

(2) 用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存;

(3) 将沙土管取出,管口用火焰熔封后放入冰箱保存;

(4) 将沙土管装入有CaCl

等干燥剂的大试管中,塞上橡皮塞或木塞,再用蜡封口,放入

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冰箱中或室温下保存。

8.恢复培养使用时挑取少量混有孢子的沙土,接种于斜面培养基上,或液体培养基内培养即可,原沙土管仍可继续保藏。

此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌,可保存2年左右。但不能用于保藏营养细胞。

(四) 含甘油培养物保藏法

1、首先将甘油配为80%浓度

2、将80%甘油按1ml/瓶的量分装到一甘油瓶(3ml)中,121℃灭菌20分钟。

3、将要保藏的菌种接种到新鲜的斜面(也可用液体培养基振荡培养成菌悬浮液)。

4、在培养好的斜面中注入少量无菌水,刮下斜面的培养物振荡,使细胞充分分散成均匀的悬浮液,并且细胞浓度约为108-1010/ml。

5、将菌悬液吸取1ml于上述装好的甘油的无菌甘油瓶中,充分混匀后,使甘油终浓度为40%,然后置-20℃(-80℃)保存,液体培养的菌液到对数期直接吸取1ml于甘油瓶中。

三、实验报告

1、微生物菌种保藏的目的是什么?

2.试述上述菌种简易保藏法的优、缺点。

16周微生物菌种常用简易保藏法

试验准备:

斜面4支,甘油1瓶,液体石腊1瓶

17周微生物试验考试一

准备内容:

显微镜,中内点接法接种放线菌、酵母菌、细菌培养物各2个平板,霉菌平板6个,棉兰染液,吸水纸、擦镜纸、接种针,酒精及酒精灯,盖玻片、载玻片,标签纸

18周微生物试验考试二

准备内容:

霉菌、细菌菌种5各支、接种针,酒精及酒精灯,标签纸,PDA试管斜面培养基50支,无菌室,恒温培养箱等。

张镜

2005-6-6

微生物菌种保藏及复壮

微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中,具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易,如何利用优良的微生物菌种保藏技术,使菌种经长期保藏后不但存活健在,而且保证高产突变株不改变表型和基因型,特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力,即很少发生突变,这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多,但原理基本一致,即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法,挑选优良纯种,最好是它们的休眠体,使微生物生长在代谢不活泼,生长受抑制的环境中。具体常用的方法有:蒸馏水悬浮或斜面传代保藏;干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏;超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法,只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中,将容器封好口,于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养,然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏,此法简单易行,且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。

因此要求最好在基本培养基上传代,目的是能淘汰突变株,同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏,以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏,一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存,每3个月移接一次;酵母菌于4~6℃保存,每4~6个月移接一次;霉菌于4~6℃保存,每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效,可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏,操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长,然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油,矿物油的用量以高出培养物1cm为宜,并以橡皮塞代替棉塞封口,这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时,应对需保藏的菌株预先作试验,因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源,还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏,为了预防不测,一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上,如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等,以保藏菌种。以沙土保藏用得较多,制备方法为:将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡

实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察

实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 1葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌,有气泡并变为黄色;右边为大肠杆菌, 2V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP,图为右边为大肠杆菌,溶液变红,为阳性菌。 3吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌,出现红色阳性菌;右边为产气杆菌,颜色不变,阴 性菌。 4硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液,如过溶液变红说明有亚硝酸盐,为硝酸盐还原阳性菌,如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂,如果变蓝,说明此菌为阴性菌;如果不变色,说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌. 右下方恶臭假单胞菌,加入革里斯试剂A、B后不变色,再加入二苯 胺试剂后变蓝,为阴性菌;左上方大肠杆菌为红色。 5柠檬酸盐实验 直接观察斜面,斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌,不变者为阴性菌.

左边产生蓝色,产气杆菌阳性;右边为大肠杆菌,阴性。 6明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌. 左边为大肠杆菌,出现透明圈,阳性;右边为枯草杆菌,阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌.

实验12-微生物菌种常用简易保藏法

实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力,使其存活,和丢失,不污染,不发生变异。根据微生物自身的生物学特点,通过人为的创造条件,使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中,以使微生物的生长受到抑制,新陈代谢作用限制在最低范围内,生命活动基本处于休眠状态,从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备,操作简便易行,故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏,并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖,从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上,覆盖一层已灭菌的液体石蜡,再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用,使外界空气不与培养物直接接触,从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长,从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油,然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂,甘油透入细胞后,能强烈降低细胞的脱水作用,而且,在-20或-70℃条件下,可大降低细胞代谢水平,但却仍能维持生命活动状态,达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法,将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上,经培养后,制后孢子悬浮液,无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中,孢子即吸附在沙土上,将沙土管置于真空干燥器中,通过抽真空达到吸干沙土管中水分,然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖,从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l.贴标签取各种无菌斜面试管数支,将注有菌株名称和接种日期的标签贴上,贴在试管斜面的正上方,距试管口2~3cm处。 2.斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上,细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞,而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3.培养细菌37℃恒温培养18~24h,酵母菌于28~30℃培养36~60h,放线菌和丝状真菌置于28℃培养4~7d。

微生物菌种保藏方法

菌种保藏 (一)、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. (二)、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. (三)、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是:150~170℃烘箱内灭菌lh;或121℃高压蒸汽灭菌60~80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1~2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1~2):1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1~1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108~1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入

菌种保存方法

菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性,因此,在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态,才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素,所以,菌种保藏方法虽多,但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种: 1.传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等(后者作保藏厌氧细菌用),培养后于4—6℃冰箱内保存。 2.液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法,能够适当延长保藏时间,它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡,一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡,另一方面可阻止氧气进入,以减弱代谢作用。 3.载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体,如土壤、沙子、硅胶、滤纸上,而后进行干燥的保藏法,例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4.寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物,如病毒、立克次氏体、螺旋体等,它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代,此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5.冷冻保藏法 可分低温冰箱(-20—-30℃,-50—-80℃)、干冰酒精快速冻结(约-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。 6.冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度(-70℃左右)下快速冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水 分(真空干燥)。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液,以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌,放线菌和霉菌; 肉膏蛋白胨斜面培养基,灭菌脱脂牛乳,灭菌水,化学纯的液体石蜡,甘油,五氧化二磷,河沙,瘦黄土或红土,冰块、食盐,干冰,95%酒精,10%盐酸,无水氯化钙; 灭菌吸管,灭菌滴管,灭菌培养皿,管形安瓿管,泪滴形安瓿管(长颈球形底),40目与100目筛子,油纸,滤纸条(0.5×1.2cm),干燥器,真空泵,真空压力表,喷灯,L形五通管,冰箱,低温冰箱(-30℃),液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1.斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月,移种一次。酵母菌两个月,细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异,因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多。 2.液体石蜡保藏法 (1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌30分钟,然后放在40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用。 (2)将需要保藏的菌种,在最适宜的斜面培养基中培养,使得到健壮的菌体或孢子。 (3)用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡,注入已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准(图Ⅶ-12),使菌种与空气隔绝。

国内外微生物保藏中心缩写

ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心,武汉大学 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心,华中农业大学 CMBGCAS 海洋微生物中心 HKUCC 香港大学保藏中心,香港大学 CUHK 香港中文大学保藏中心,香港中文大学 BCRC 台湾生物资源保藏研究中心,台湾新竹 国外 ATCC(American Type Culture Collection)美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。 该中心保藏有藻类111株,细菌和抗生素16865株,细胞和杂合细胞4300株,丝状真菌和酵母46000株,植物组织79株,种子600株,原生动物1800株,动物病毒、衣原体和病原体2189株,植物病毒1563种。 另外,该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC(IFO)是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株,真菌568株,酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心

设计实验:微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术

设计实验:微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一.实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”,防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法,其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多,常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长,并且产气产酸,使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长,形成黑紫色的菌落,有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌(呈红色)。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存,不污染其它杂菌,及可保持其形态特征和生理性状,减少变异,防止衰老,以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休,如孢子;芽孢等等,并且要创造一个低温;干燥;缺氧;避光和缺少营养的环境条件,以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物,应使其新陈代谢处于最低状态,又不会死亡,从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种:污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基:乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂(EMB)、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材:接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂:革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三(95%乙醇)、 革兰氏四(蕃红);试剂:医用液体石腊(比重0.83~0.89)。 四.试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a.涂布平板法:将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面,置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b.平板划线法:经培养后挑取单个菌落,接种环以无菌操作沾取少许菌落,在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果

常用研究细菌的实验技术

大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行,而微生物由于个体微小,在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性,微生物的物种(菌株)一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中,在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture),而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果,因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。相应的,微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术,因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。实际上,正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界,并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。 1 微生物的分离和纯培养 1.1 无菌技术 微生物通常是肉眼看不到的微小生物,而且无处不在。因此,在微生物的研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”,防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique),它是保证微生物学研究正常进行的关键。 (1) 微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish,Petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具,在使用前必须先行灭菌,使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌,也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌,它可以杀灭所有的生物,包括最耐热的某些微生物的休眠体,同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌,特别是空气中的杂菌污染,试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口,通常采用棉花塞,也可采用各种金属、塑料及硅胶帽,它们只可让空气通过,而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成,这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 (2) 接种操作 用接种环或接种针分离微生物,或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养,是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染,因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行,其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作(图2—1),或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作(图2—2)。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。

实验室常用的细菌作用及其选择

第一篇:JM109,DH5a,BL21这些感受态有何区别 1:DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2:BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT, hsdS(rBB-mB-),gal, dcm(DE3) 3:BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal, dcm(DE3,pLysS ,Camr 4:JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac -proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15] 5:TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80 ,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 ,araΔ139Δ(ara-leu)7697, galU ,galK ,rps, (Strr) endA1, nupG 6:HB101菌株 该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验

微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏方法 1、传代保存法:有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时,会很快死亡,因此在这种情况下,只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时,培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地,大多数菌种的保藏温度以5℃为好,像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存,而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便,但其缺点也很明显,如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时,菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种,工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法:该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥,并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法:即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种,如: ①土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液,立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥,然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

实验三细菌的分布与消毒灭菌

实验三细菌的分布与消毒灭菌【目的】 ①了解细菌广泛分布于自然界及正常人体,树立“有菌观念”,从而认识无菌操作对于微生物学及医学实践的重要性。 ②了解正常人体中寄居着种类繁多的细菌,正常情况下不引起人类疾病,称为正常菌群。 ③熟悉外界因素对细菌的影响,学习常用的消毒灭菌方法。 ④了解不同细菌对外界因素具有不同的抵抗力。 一、细菌的分布检查 (一)空气中的细菌检查 【材料】 普通琼脂平板培养基。 【方法】 ①取普通琼脂平板一只开启皿盖,培养基面向上放于实验桌上,暴露5~ 30min后盖好。 ②置37℃培养18~24小时后观察结果。 【结果】(填表10-1) 平板培养基表面或多或少有菌落生长。 (二)地面水中的细菌检查 【材料】 地面水(河水、井水或池水)、高层琼脂培养基、1ml无菌吸管、灭菌培养皿。 【方法】 ①以无菌吸管吸取1ml地面水,加入灭菌平皿中。 ②将已溶化且冷至45℃左右的高层琼脂倾注人上述平皿中,加盖后轻轻摇动,使水与琼脂充分混匀,静凝。 ③37℃ 24小时后取出观察,计数菌落。 【结果】(填表10-1) (三)衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查 【材料】 普通琼脂平板培养基。 【方法】 取普通平板一个,用蜡笔在平板背面玻璃上划成四等分,并贴上标签(图 10-1)。然后以无菌操作法,用衣袖角、票证、头发及手指或指甲污物,在平板培养基表面相应部位轻轻涂抹,置37℃培养24 【结果】填表 培养基表面涂抹处有菌落生长。衣服、票证、头发、

手指皮肤上的细 菌检查 (四)正常人体咽喉部的细菌检查 【材料】 血液琼脂平板培养基、灭菌棉拭、接种环、酒精灯。 【方法】 取灭菌棉拭一支,在被检查者咽喉部轻轻涂擦后,再涂于血液琼脂培养基—侧,然后改用灭菌接种环作分离划线接种。盖上皿盖,37℃孵育24小时(或者采用咳喋法)。 【结果】(填表10-1) 琼脂平板表面有菌落生长。其中占优势的是一种细小菌落,其周围有草绿色的不完全溶血环。此为咽喉部的正常菌群—甲型链球菌。 (五)实验结果观察(填表) 二、消毒灭菌试验 (一)煮沸与高压灭菌法 【原理】 高温对细菌有明显的致死作用,主要机制是凝固菌体蛋白质,也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌细胞膜功能受损及菌体电解质浓缩有关。 湿热灭菌法所需温度比干热法为低,时间较短。尤其是高压蒸气灭菌,因增加压力而提高沸点,灭菌效果最佳。有芽胞的细菌由于对热的抵抗力比无芽胞细菌强,所以只有采用高压蒸气灭菌法才能将芽胞彻底杀灭。 【材料】 琼脂平板两块、肉汤管两支、大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌肉汤培养物。 【方法】 ①取琼脂平板两块,用记号笔分别在二平板底部玻面上,注明大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌,并分别将二块平板底玻璃面划分三等份,于每块平板的三等份上分别注明对照、加热100℃ 10min及加热121℃ 20min。 ②取肉汤管二支,分别注明加热100℃ l0min及加热121℃ 20min,用毛细吸管吸取大肠埃希菌肉汤培养物,于上述二支肉汤管中各加入菌液一滴。混匀,再用接种环于二支肉汤管的任何一管中取一环菌液接种于大肠埃希菌平板的对

第14章 微生物的保存技术

第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如,当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时,为发展疫苗、抗生素和化学药品,人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究,关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中, 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物(U.S.Congress 1981),微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源,保存微生物的目的,不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来,并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段,还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物,为人类造福。为此, 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心(ATCC),英国的 国家典型菌种保藏所(NCTC),日本的大阪发酵研究所(IFO)等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会(CCCCM)。 微生物的保存方法很多,根据不同的微生物菌(毒)株或不同的实验要求,可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种,再创造 一个适合其长期休眠的环境条件,诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等,使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率(Halliday,Baker 1985)。然而,所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失,还需要开发出不仅能 减少代谢率,而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录(Halliday,Baker1985)。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录,还包括对保存物的 定期复苏和培养记录,以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法(Gherna 1981;Halliday,Baker 1985;Malik 1990;Rudge 1991)。这两种方法均可保存相当长的时期(通常可长达30年)。其他保存微生物的方法还有:低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等(Gherna 1981)。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术(Day,Mclellan 1995)。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌/酵母目录册》中,记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存(Gherna等 本章作者:田保平,韦剑珊,俞乃胜

微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏注意事项 摘要:一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等),创造最有利于休眠状态的环境条件,如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等,使菌体的代谢活性处于最低状态,同时也应考虑到方法经济、简便 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性,人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。保藏时,一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等),创造最有利于休眠状态的环境条件,如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等,使菌体的代谢活性处于最低状态,同时也应考虑到方法经济、简便。由于微生物种类繁多,代谢特点各异,对各种外界环境因素的适应能力不一致,一个菌种选用何种方法保藏较好,要根据具体情况而定。 菌种保藏要获得较好的效果,需注意如下三个方面: 1、菌种在保藏前所处的状态 绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体,如孢子或芽孢。保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短,保存时容易死亡;培养时间长,生产性能衰退。一般以稍低于最适生长温度下培养至孢子成熟的菌种进行保存,效果较好。 2、菌种保藏所用的基质

斜面低温保藏所用的培养基,碳源比例应少些,营养成分贫乏些较好,否则易产生酸,或使代谢活动增强,影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净,以防其中含有过多的有机物,影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。冷冻干燥所用的保护剂,有不少经过加热就会分解或变性的物质,如还原糖和脱脂乳,过度加热往往形成有毒物质,灭菌时应特别注意。 3、操作过程对细胞结构的损害 冷冻干燥时,冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶,对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构,加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加,而且容易导致菌种变异,造成菌种性能衰退。

菌种的衰退、复壮和保藏

第五节菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求,否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。 由于微生物的多样性,不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性,迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此,在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株,则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏,以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 一、斜面冰箱保藏法 一种短期、过渡的保藏方法,用新鲜斜面接种后,置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。保存期3月到6月。 二、沙土管保藏法

适合于产孢子或芽孢的微生物。 首先,将沙与土洗净、烘干、过筛,按沙与土的比例为1—2:1混合均匀,分装于小试管中,料高1厘米左右,121C间歇灭菌三次,烘干备用。一般沙80目,土80一100目。 其次,将孢子制成悬浮液,接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合,置干燥器中用真空泵抽干,冰箱内保存。 保存期1年左右。 三、菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。该法保藏温度为-20℃,为避免M受损伤致死,需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25%。 操作:①、配制浓度为50%的甘油溶液,121℃灭菌后备用;②、制备菌悬液,一般浓度为108~1010个/mL;③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀,置-20℃保藏。 四、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上,倒入一层灭过菌的石蜡油,量高出斜面1cm,然后保存在冰箱中。此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。保存期约1年 五、真空冷冻干燥保藏法 是目前国内外较理想的常用方法。其基本原理是在较低温度下(-18℃),快速地将细胞冻结,并且保持细胞完整,然后在真空中使水分升华。在这样的环境中,M的生长和代谢暂时停止,不易发生变异。菌种可保存5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备,要求亦比较严格,但由于该方法保藏效果好,对各种M 都适用。所以,都已较普遍地应用。 基本操作:将M制成悬浮液,再与保护剂混合,然后放在特制的安瓿管内,用低温酒精或干冰,使其迅速冻结,低温下用真空泵抽干,最后将安瓿管真空熔封。低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型,防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用,使M疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。

微生物菌种保藏方法

实验十 微生物菌种保藏方法 [日期:2009- 5-30]来源: 作者:孔庆学 [字体:大 中 小] 实验十微生物菌种保藏方法 菌种是一种重要的生物资源,菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变,以便于研究与应用。 (一)常规保藏方法 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异,不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态,但又不至于死亡,从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求,应该选用不同的保藏方法。一般情况下,斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用,也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面,半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏

5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.1.2.4保藏 斜面长好后,直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2半固体穿刺保藏 5.2.1流程 标记试管→穿刺接种→培养→保藏 5.2.2 步骤 5.2.2.1贴标签 取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支,贴上标签,注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.2.2.2穿刺接种 用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种,朝直立柱中央直刺至试管底部,然后又沿原线拉出。 5.2.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.2.4保藏 半固体直立柱长好以后,放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。

细菌生理生化实验

细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示: (一) 糖、醇发酵试验 原理: 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖(醇、苷)产酸(符号:+)、产气(符号:○),培养基由紫(蓝)变黄(指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果),并有气泡;有些产酸,仅培养基变黄;有些不分解糖类(符号:-),培养基仍为紫(蓝)色。 培养基配制: 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基: 蛋白胨:2g ,K2HPO4 :0.2g ,NaCl:5g ,糖(醇、糖苷):1% ,水洗琼脂:5~6g,蒸馏水:1000mL,PH:6.8~7.0,溴百里酚蓝:1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后,再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制: (NH4)2HPO4:1g ,MgSO4:0.2g ,KCl:0.2g ,酵母膏:0.2g ,糖(醇、糖苷):1%水洗琼脂:5~6g ,蒸馏水:1000mL ,溴甲酚紫:0.4%乙醇液2mL,PH:6.8~7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管,培养基高度约为4~5cm ,115℃灭菌20min。 测定的糖(醇、糖苷)类可以包括:葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖(1.5%)、半乳糖(1.5%)、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意:以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果: 用18~24h的幼龄菌种,用穿刺针接种于培养基中,适温培养1d,3d,5d后观察,颜色变黄为阳性,不变为阴性;有气泡产生为产气。 结果记录: 产酸:+,产气:○,不产酸长气:- 。 (二) 淀粉水解试验 原理: 某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。 培养基配制: 牛肉膏5g;NaCl:5g;可溶性淀粉5g;琼脂:20g;蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法: 以18~24h的纯培养物,点接于淀粉琼脂平板(一个平板可分区接种)或直接移种于淀粉肉汤中,于36±1℃培养24~48h,或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间,培养

(生物科技行业类)菌种保存和微生物常识

菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养:从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质,满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础,是生命活动的起点。 营养物:具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基:人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求:应具备6大营养要素;物质比例合适;必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则:目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法:生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤:称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类: 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基

消毒与灭菌: 消毒:消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌:杀灭一切微生物的营养体,芽胞和孢子。 方法: 一、物理的方法:加热、过滤、辐射 二、化学的方法:用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子,磺胺类药物及抗生素等。 加热法: (1)干热法:火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等,试管口和瓶口,涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气(160-170C)加热灭菌1-2h,适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性,与水的含量有关,当环境和细胞含水量越大,凝固越快。 3、注意事项: 1)培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法; 2)温度控制在<180°; 3)物品不能太挤; 4)温度降至70°时才开箱门。 (2)湿热法:原理:因为湿热中菌体吸水,蛋白质容易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低;湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法: 1、设备:高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌,也可用于玻璃器皿的灭菌。

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