1、流式所需细胞数
问:因为我做流式需要做很多次,就想到用六孔板做,六孔板的一个孔内的细胞数够不够做一次流式用?有没有人用过这个方法?请大家给个建议。
丁香网友zhaoyihenglk认为:足够了!流式检测所需的细胞的数量级105,而六孔板长满能达106。
问:请问用96孔板作的转染可以做流式细胞仪分析么?做流式细胞仪分析要用多少微升的悬液?谢谢!
丁香网友zhaoyihenglk认为:一般我们使用500微升的悬液上机检测!!!
问:请问流式检测的最小的细胞数量是多少,如果小于一个细胞的话是否就不能采用流式检测了。流式要求的细胞的最小体积是多少,我最近收集了少量细胞团,30-50 微米,因为将细胞团中的各个细胞分离开较难,是否可以用于流式的检测?
丁香网友XTYang认为:如果不能将细胞分散成单个细胞悬液的话是无法用流式细胞法分析的。
丁香网友swarm认为:检测时最少要有2000个细胞,但最初准备样品时,如果只做外标,样品比最少细胞数大一个数量级即可;但要是需要作内标的话,固定液和穿膜液粘度大,细胞损失也多,而且,穿膜液一般对细胞还有损伤,故样品细胞数要比最少细胞数大2个数量级!做流式,细胞必须是单细胞悬液,成团细胞可用胰酶处理,或是在细胞样品中加2mM的EDTA,防螯合。
问:请问流式检测的最小细胞数是多少?如分离出两种细胞,一种细胞数很少,但体积很大,另一种细胞是其数量的10-20倍,是否可以用流式同时检测呢?
丁香网友XTYang认为:记得有人研究用针头取样后进行流式分析的文章,所以细胞数应该是可以很少的.在大量细胞中检测低频率事件(即你例子中的第一种细胞)正是流式的优点.关键是你的第一种细胞在大小,密度或荧光标记上和其他大量细胞有区别,并且细胞团能用酶解或机械方法处理成单细胞悬液.
问:流式能检测含多种细胞的标本吗?细胞碎片影响流式检测效果吗?怎样在检测前去除细胞碎片?
丁香网友swarm认为:能检测含多种细胞的标本因为流式本身能根据细胞的大小及细胞内容物颗粒大小(即所谓的流式仪所用的前向光和侧向光)来区别不同的细胞群而通常做研究时是荧光标记你感兴趣的亚群进行分析含有碎片会有一点点影响,但用空白样品(未作任何荧光标记的样本)选定你想研究的细胞群体时,即可排除细胞碎片,因为碎片所反映的前向光和侧向光和完整的细胞基本不相同。
2、Western和RT-PCR所需细胞数
问:我是实验新手,拟在细胞上行WB和RT-PCR,由于实验基础太差,不知道细胞水平行WB和RT-PCR所需多少细胞,一般用多大的板子培养才能提足所需蛋白和RNA,请园子里的朋友们不吝指教,多谢!
丁香网友zhangyuelin1999认为:我做过WB的,细胞数目要达到10*6个,这样提出的蛋白就可以了!因此一般的六孔板就可以了!24孔板,96孔的感觉有点小了,空间太小细胞长就不好了!先前要计个数的,然后进行蛋白定量的!悬浮的就直接离心得沉淀,裂解得蛋白的就可以了,贴壁的要用到细胞刮子。RT-PCR 就不太清楚了,祝实验顺利!
丁香网友everever认为:看你要养的细胞是哪种了,有的细胞的体积就很小,而有的细胞则铺得很开。做RT-PCR用两步法即先抽RNA经反转录再做PCR一般要用到1ug的总RNA。(1ug经反转录成20ul体系后一般可做至少50次20ul体系的PCR)常规做WB一个孔道上样要10*5个细胞。但也和你的目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。你最好和你们实验室做过相关实验的人讨论一下。
问:我初次作RT-PCR 和Western,请教要使用多少转染后的细胞呢?转染效率是多少?瞬时转染是否可以传代呢?对检测有多大的影响?
丁香网友lym569认为:一般转染效率达到50%的话,一个24孔班板的细胞足够做RT-PCR 和Western了,你可以做一个6孔板转染或2个24孔细胞转染.瞬时转染可以传代,但传代后所转染的细胞会越来越少.你传代的目的是什么?如果想稳定表达的话,你应该作稳定转染。
问:你的“一般转染效率达到50%的话,一个24孔班板的细胞足够做RT-PCR 和Western了”是不是可以这样理解:转染效率50%,24孔板上每个孔均长满细胞。一半细胞用作RT-PCR ,另一半用作Western。再弱弱的问:是刚好够吗?您的建议:你可以做一个6孔板转染或2个24孔细胞转染。24孔板2个是为了保险。那6孔板是??
丁香网友lym569认为:转染效率50%,24孔板上每个孔均长满细胞。一半细胞用作RT-PCR ,另一半用作Western 足够用了. 做2孔是其中一孔做RT-PCR ,另一孔做Western,这样操作起来比较方便,一个24孔板上的细胞够你做几次Western了.如果用6孔板,你只转染一个孔就可以,看你喜欢哪种了。
3、MTT细胞数问题
问:本人准备做SKOV3和SMMC-7721的MTT实验,请问MTT实验中96孔板中的合适细胞数或者浓度。
丁香网友rfei8510认为:调整细胞浓度至1×105/ml,分别加入96孔板,每孔
加200μL使每孔细胞数目是2×104个。
请教:各位在做MTT时,如何尽量保证各孔细胞数基本一致?混匀细胞所用容器是培养皿还是储液器?储液器用的是一次性的还是可重复使用的,哪家公司的,价格?
丁香网友clearair00认为:MTT检测时各孔细胞数的均一可比是关键。首先要保证收集细胞的分散混匀,贴壁细胞要消化完全,悬浮集落细胞团块要吹散充分,最好显微镜下观察确定。其次微量取液操作要规范、稳定,建议选用精密度较高的微量移液器和质地优良的Tip头。至于混匀细胞的场所是选择培养皿还是储液器,抑或其它容器,应该没有很大的影响,只要方便操作且不影响细胞活力即可灵活选用。额外补充一句,MTT检测结果的影响因素除上面提及的方面外,每孔接种细胞的密度也是保证获取有意义和正确结果的重要一环,具体的接种细胞密度要根据不同的实验目的和观察效应的差异进行调整、确定。
请问做MTT时,96孔板中每孔的细胞数是多少啊?为了照相每次我都在加MTT前将扳子的培养液甩掉,照完相后加70微升的无血清培养液(为了节省)和20微升的MTT,不知道这样对结果有没有影响?
丁香网友偷懒的猪认为:不同的细胞,不同的药物作用时间或是影响因素,要求接种的细胞数会不同。一般是1000-10000个,看你的细胞的生长速度,体积大小,都会有影响的。我做的几个不同的肿瘤细胞系,多数种3000-5000个,药物作用48-72小时是可以的,细胞数太少,读数太低,误差会增大。细胞数太多,细胞长满了以后脱落,OD值和活细胞之间就不再是线性关系了,也会使结果失真。我们这里也有人种1000/孔,但我试过2500/孔,作用48小时,OD值就特别小了。MTT的影响因素太多了,还要自己好好摸索,愿你好运!
我在用MTT法作细胞的生长曲线,现在遇到了几个问题,希望有人能帮我解决。(1)OD值转换成细胞数的方法?
(2)我得出的OD值都是在2-3之间,准确吗?
(3)我不知道选择哪个波长490和570的,就选了两个?570的值比490的高,我该用哪个值?
丁香网友ryochan 认为:
(1)OD值转换为细胞数似乎不太好操作,就像楼上战友说的那样,影响因素比较多,单个细胞活性与MTT转化量是有关系的,所以需要有一个标准细胞活性的参照才能计算细胞数。
(2)OD应该在0.2~1之间线性度最好,2-3就不太好了,有时候<1.5也凑合了。
(3)标准的MTT,DMSO溶的话,吸光度峰值应该在570nm,线性度最高,但是多数实验室酶标仪的滤光片配置都没有这个数值,所以似乎大家就用490nm来替代了,理论上说线性度不如570nm,但是因为相差不算太多,也可以代用。
丁香网友忆歆人认为:可以先通过配制梯度浓度的细胞数,利用MTT法测OD值,将细胞数同OD值之间建立线性关系,即一标准曲线。再根据标准曲线,通过OD 查找对应的细胞数!
请教一下细胞数目是怎么调的,我的方法如下:先需7-8X104/ml的细胞浓度,把培养瓶中的细胞消化后,离心,弃去上清液,沉淀中加入少量培养基,制成细胞悬液,另取一预先消毒的大口瓶,加入培养基,所加培养基的量以超过自己所设计的96孔板上所需的接种量少许为宜,然后,用吸管吸取少量悬液,滴入大口瓶中,用玻璃计数板计数,四个大格平均数为7-8个,如果不够,继续滴加初始悬液,最终制成7-8X104/ml的细胞悬液。刚开始做MTT,还不太熟,请大家指教。不知道这种方法对不对?
丁香网友hualey认为方法太复杂了,他的方法:正常消化,观察细胞明显收缩后,倒掉胰酶,用少许培养基轻轻荡洗细胞,弃去培养液,加入少许培养液吹打细胞,使之从壁上掉下,转移至离心管中用直头滴管吹打成单细胞,细胞计数,测得的密度除以所要求的密度,得到要稀释的倍数,稀释。主要不同在于如果先稀释,可能会浪费培养基,至于其它操作,也可能是个人习惯问题,希望对你有帮助。
丁香网友jjw703 认为:调细胞浓度我们做的很多,方法和战友hualey的基本相同。不同的是我们实验室在消毒细胞培养瓶的同时,还消毒一批小的瓶子,从10ml到20ml,这可以用来调细胞浓度。具体方法是消化收集细胞,转入消毒好的小瓶子,然后细胞计数,得到一个原始浓度。根据你所要的浓度的细胞悬液的量来稀释。比如你调的原始细胞浓度是2.4×10 5/ml,需要最终细胞浓度8×10 4/ml 一共10ml,那么你就可以取原始细胞悬液3.3ml于另一个消毒好的小瓶子中,再补加6.7ml培养液。我们的方法,一是可以节省离心管,而是可以节省培养基。另外说个体外话,做MTT一定要细胞悬液浓度均匀,所以接种空板时,每加一排孔,都要混匀,把人为操作的误差减少到最低限度。
问:是否初始浓度的细胞,不用知道具体的体积?
丁香网友wolfskin认为:
(1)贴壁细胞胰酶消化,7-8ml培养基吹打呈单个细胞悬液;
(2)取1.5ml离心管,PBS 450ul,细胞悬液50ul,即稀释10倍后计数;
(3)计算密度,换算所需稀释倍数。
目前在养细胞,加不同刺激因素作用于细胞,通过MTT测OD值,观察刺激因素对细胞活力的影响。但作了很多次,除第一次结果OD值均在1以下,其他都有
1点几,2点几,有时甚至高达6.0(此时细胞加了MTT20UL/孔后,上清液就变成混浊紫色),而老板说数值太大,一般OD值应小于1。我每次接种细胞密度大概有3-5x105个/ml,是否密度太大?不知各位战友作MTT数值一般多少?此外,为什么有很多次在我刚加了MTT后有些孔上清就变灰紫色,,抚育4h后更多孔上清变色,都看不清孔底的结晶了,是细胞活力太差还是MTT出现问题?
丁香网友essie2003认为:
(1)密度有点大了,你得OD值偏大应该和细胞数量关系很大,小于等于105左右比较合适。
(2)据国外资料OD570在0.7-1.2之间比较可信,但我们这里做的大多在0.3-1.0之间,很少做到1.0以上。
丁香网友song111jun认为:96孔板接种时密度最好在104-105之间,因为96板每一孔长满时消化下来就105左右,你的接种密度肯定高了,我用5x104/ml 接种SW480测的结果还可以。你同时考虑一下你的细胞生长速度,最好在细胞处于对数生长期时检测。
问:用MTT法测细胞生长周期,计算倍增时间时还是需要用到细胞数,那怎样把OD值换算成细胞数呢?
丁香网友martin20032758认为:设对照组的OD值为X,实验组OD值为Y。计数对照组的细胞,取均值Z后,则实验组的细胞数为YZ/X
丁香网友zsc78认为:我用MTT法测过细胞生长周期,在细胞密度低的时候还可以,但当细胞增殖到一定数量时,OD值跟细胞数不成比例。建议细胞不要接种太密,在细胞长满之前结束实验。
4、免疫组化细胞数问题
问:我培养的原代细胞,做细胞组化,可发现,做好后,细胞数目比培养时少了很多(大约只剩下不到一半了)。是什么原因呀?过程如下:
(1)原代培养的成年大鼠神经细胞(神经元),培养3-4周。
(2)吸去培养液,37度0.01MPBS清洗3次各5 分钟。
(3)1%多聚甲醛固定30分钟。
(4)封闭液封闭(0.5%Triton X-100、4%羊血清、1%BSA、 PBS配制)室温孵育60 分钟。
(5)加1:500稀释的一抗,4℃湿盒过夜,PBS清洗标本 3次各5分钟。
(6)3%H2O2孵育 10分钟,以消除内源性过氧化物酶,PBS清洗标本 3次各 5 分钟。
(7)加二抗,室温孵育60分钟,PBS清洗标本3次各 5分钟,
(8)加ABC,室温孵育60分钟,PBS清洗标本3次各 5分钟。
(9)加DAB显色液,显色8分钟,加PBS终止反应。
说明:
(1)我在吸去培养液前,观察了一下细胞,数目很多。等我做的第8步完成时,即在DAB显色前,在观察,发现细胞已经丢失了近2/3了。我每次清洗都是很轻的。基本就固定在一点吸液加液。
(2)我培养细胞时,没有在培养板的孔内放载波片,所以上述操作均在培养板上进行。
(3)我在细胞原代培养过程中,细胞数量没有丢失现象。尽管我仅用5ug/ml
的多聚赖氨酸铺板。
丁香网友dongwp认为:31%多聚甲醛固定30分钟应用4%多聚甲醛固定,如果固定不充分,细胞就不能很好的黏附于培养板上,所以在染色的过程中被逐渐洗去?。
问:我们有个技术员告诉我(这个技术员可是在美国NIH做过的)他曾经加过4%的多聚甲醛,但结果细胞全部卷起来了。所以告诉我,多聚甲醛的浓度一定要低!我才加1%的。
丁香网友dongwp认为:那是因为直接加入冷的固定液,细胞受冷收缩的缘故,并非是因为多聚甲醛的浓度。细胞吸去培养液,37度0.01MPBS清洗3次。加入的多聚甲醛也必须是预温的,然后可以室温或4度固定。
5、透射电镜所需细胞数
问:请问培养细胞做透射电镜所需的细胞数目。
丁香网友散木认为:透射电镜一张片子一般只能看十来个,最多几十个细胞。关键是看你怎么做,做什么。是离心成团后固定、切片,还是做细胞爬片再制片。如果你仅仅是在透射电镜下看一下,只要看到就行的话,则:1、如果你你离心成团后固定、制片,那么细胞数就要多点。10的5次方个细胞能离心成肉眼可见的团。肯定是足够了。2、如果是细胞爬片的话,可以用四分之一的玻片放在24孔板里做。这样的细胞数也足够了。如果你还要比较,或者你要观察的现象的特殊形态出现的机率低的话,则另当别论了,一般最好要多做些。
丁香网友hzbzh0722做过的电镜方法:
(1)收集细胞,如果是贴壁细胞先消化后再收获。预冷的PBS洗一次。
(2)600~800转低速离心5Min,去掉细胞碎片。
(3)PBS重悬,1500离心10Min,使细胞压缩成团,大小以一个芝麻粒大小为宜。这时你可以根据你的细胞数再调整一下。太多或太少都不好。
(4)2.5%的戊二醛固定后送电镜
当然后面的制片由专门做电镜的老师来完成了,好像很复杂,我们自己搞不定的。用的是那种很小的筛网。一般细胞多的时候,一个筛网上的细胞可以达到200个,也就是我们通常说的一张片子上的细胞。对你来说应该足够了吧。
丁香网友jessie2003 认为:
(1)一般来说扫描电镜多用细胞爬片,而投射电镜多将细胞消化(指贴壁细胞)、离心、固定。
(2)具体数目好像也没什么规定,尽量不要少,我记得我做的时候每个样本用25ml的培养瓶长满消化的。
(3)关于固定剂,一定要用电镜专用的戊二醛,我记得当时买的400元左右,当然跟电镜室老师要点也行。
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1.标本制备: 2.最小化非特异性结合: 二、凋亡 1.凋亡的检测方法:和其它 2.PI染色法 3.Annexin V 法 4.TUNNEL法 三、细胞因子 1.激活的细胞因子 2.CBA 四、血小板 1.活化 2.活化检测 3.网织血小板 五、红细胞 1.网织红细胞 2.PNH 3.胎儿红细胞 六、肿瘤学 1.DNA 细胞周期 2.蛋白 3.多药耐药 4.微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞/ml),在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1.荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2.在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3.在使用第一抗体之后,将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面,但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合,或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2 存在的条件下,将新鲜组织或片段一般是不能利用或很难制作。因此,在NaN 3
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究,而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养,因此在样本制备,上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇(用无菌蒸馏水配制) 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子,振摇鞘液筒,确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接,否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处,并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管(若不使用浓缩器)。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门(画一个空门使机器进行分选操作)。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉,点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满(每管注满需要9min ),点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次,共需要1h。 13、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水,振摇鞘液筒,倒掉液体,反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水,盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满(每管注满需要9min),点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次,共需要1h。 20、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管(最左)中收集15 mL PBS后取下,使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞,则应用无菌技术,用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管,将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤 分享 首次分享者:☆秋秋☆已被分享29次评论(0)复制链接分享转载举报一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机、台式机)和综合型(又称大型机、分析型)。B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA 和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,?多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1.流式细胞仪的分析速度: 一般流式细胞仪每秒检测1000~ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。 3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm~0.5μm。 4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5.流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞仪分选速度>1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞,按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内 ↓ 24h后,进行所需的处理(比如加药,照射) ↓ 特定时间后终止培养,进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液,洗后的PBS和消化后的细胞,将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min(短时低速离心) ↓ 弃上清,用1.5ml预冷PBS,1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇,混匀后,于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除,加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍,将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS,加入200ul PBS和2ul的RNA酶(0.25mg/ml)(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中(PI 具有很强的粘附性,容易使细胞聚团),标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机(先开仪器后开软件) ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分:①流动室及液流驱动系统;②激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测、存贮、显示、分析系统;⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞,然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液,细胞排成单列由喷嘴中心喷出,形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交,细胞上的荧光染料被激发产生荧光(488nm激 发光源) ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析(荧光染料和细胞DNA分子特异性结合,可以检测出细胞周期各时相细胞比例) ↓ 在用第三方软件分析之前,将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
、准备工作 1,清洗偏转板,防止盐离子影响电荷加载,电流偏转。 1)用超纯水沾湿医用棉签,擦拭偏转板所有金属物件。再用干棉签擦干。 2)5ml 注射器吸超纯水,清洗缝隙。用滤纸先吸水,再用干棉签擦干。 2,鞘液桶加液 3, 喷嘴超声,喷嘴放入超纯水中,超声2min。用滤纸吸干水分,晾干。 二、开机启动 1, 启动电脑,密码BDIS,点开软件,无密码 2,机箱侧面依次打开总机开关,蓝色、红色激光。 3, 液流启动:Cytometer --- FiuidSetup 1 )气路(透明管)、液路(蓝色管) ,从乙醇桶上拔下,插到鞘 液桶 2)闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置,旋转至12 点方向 3)取下闭合喷嘴 4)将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。 4, 喷嘴压力切换:菜单栏中Sort---SortSetup --- 70um (选择当前使用的喷嘴大小) 5, 液流调整:
点开电脑界面中70um图标栏里的Stream,从打叉状态变为打勾。查看是否都处于正常状态:1)打开仪器机箱,查看液流是否流到废液槽。如果偏离,拧开两边的螺丝,左右推动使液流到达槽内,拧好螺丝。 2)查看电脑界面,液流图像是否稳定,如果有黑白灰图片变化,用棉签擦拭偏转板上方 3)查看电脑界面,液流是否在中央,如果不是,可以手动调整仪器摄像头,或者重新插好喷嘴。 4)机箱中查看激光束是否完好通过,用干棉签挡住通过位置,如果看到激光射出,则正常。然后关闭主机箱外盖。 调整液流:通过调整振幅来实现。 1)振幅Ampl,数值调大,使液流断滴在上1/3处,即2滴连续液流。 2)频率Freg ,一般不动。 3)Gap:当喷嘴为70um时,数值一般为7、8、9。100um时,为10, 、11 、12。 4)当Ampl和Gap都稳定时,把实际值(后面)手动输入到确定值的框内(前面)。 5)点击StreamSpot ,锁死数值,保持液流稳定。 Dropl :实际值和确定值,变化幅度保持在10以内。 Gap:实际值和确定值,变化幅度保持3以内。此视为稳定液流。 三、手动调补偿: 样品:Negative (双阴管),FITC(单阳),PE(单阳)
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA 碎片检测比较,使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN ,过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。
流式细胞术检测淋巴细胞表面标记 一、实验目的 1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用:初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理;能够认识流式细胞术的应用,特别是常用的一些功能。 2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程 3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析:能够基本看懂结果图,重点掌握“门”和“补偿”两个概念。 二、实验原理 1.流式细胞术(Flow Cytometry, 简称FCM)是一种可以快速、准确、客观,并且同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性(多参数)的技术,同时可以对特定群体加以分选。 特点:可检测的样本种类多样,大小范围较广(0.2~50μm);检测速度快,分析样本量大(快速、大量);细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏;采用激光作为激发光源,保证其具有更好的单色性与激发效率;利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术,保证检测的灵敏度和特异性;用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析,保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。 2. 流式细胞仪组成及原理 Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。 鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围,保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置,防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。匀速流动,保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而得到准确的细胞荧光信息。 Optics (光学系统)——激发和收集光信号。 激发系统包括:激光器、透镜和反射镜,将激光聚焦到检测区 收集系统包括:光学镜片和滤光片、光信号检测器 流式细胞仪收集的信号:(1)散射光信号:细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号,它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关,主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。FS-SS图可对未染色的活细胞进行分析或分选,但不能分析表面分子(2)荧光信号:荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同;每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管;选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 Electronics (电子系统)——数据处理系统,扩大信号,将光信号转化为电信号,处理信号并存储于电脑。 3.流式步骤 第一步:用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原(染色);第二步:带有荧光的细胞一个接一个通过激光;第三步:不同荧光基团有不同发射光谱,荧光染料选择原则:必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发、激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内、荧光素光谱的重叠应当尽量减少;第四步:复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解;第五步:光电倍增管(PMT)将光信号变成电信号;第六步:模数变换器(ADC)进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信号 4.分选基本原理
一、开机程序: 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印 机。 3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入 1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校 正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果,退出FACSComp程序。 备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件:CellQuest Pro 软件,选择“联机”。 1.
(2)对实验样本进行命名; (3)对实验通道进行预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。 备注:如果界面被关闭,重新调出步骤: 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具(一般选择散点图),Inspect 界面会自动弹出,对几个常用选项进行设定:将散点图选中(用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形),将 更改横纵坐 备注:第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC 。 (1一般获取10000个细胞。 (2 ( 3)将所有补偿调为0 (4)将非 52 (5)FSC和SSC (6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀,上机,功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号,第一个图:让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域;其他三个 散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域。通过移动通
样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL
流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定过夜。 4、离心,弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室温避光孵育30min。 9、混匀,过300目筛网,置流式管中, 4℃冰箱保存,待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。 3、加入2ml预冷PFA,PFA的浓度根据细胞的特点进行调节,4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的(4-9) 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、以冷PBA 1ml,离心洗涤,弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次,以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保存,待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul,对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心,弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次,以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。
流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称:流式细胞仪 生产厂家:美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法: 一.开机程序 1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。 2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。 4.如果需要打印,打开打印机电源。 5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。 7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。 二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。 3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析。 三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。 4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周
一、样品制备 1、取样(大约1×106 cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl的Rnase(GenScript试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl的PI染液(GenScript试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells, 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDBY,5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H(选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术,用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 目录 * 1 原理 * 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见 原理 一束单色光(通常是激光)照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点,其中一个和激光在同一直在线(称作前散射(FSC)),其它几个和激光垂直(旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器)。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射,同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录,根据各检测器亮度的波动(每个细胞会显出一个散射或荧光的峰)就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关,而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度(比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度)。 可以检测的参数有: 细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA(细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等)、RNA 染色体分析和分选(文库构建、染色体涂染)、蛋白质、细胞表面抗原(CD标记)、胞内抗原(各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等)、核抗原、酶活性、pH,胞内离子化的钙、镁,膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)(定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化)、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合(DNA/表面抗原等等) 流式细胞仪(flow cytometer) 流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计(FACS,Fluorescence Activated Cell Sorter)。现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒,并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。 流式细胞仪和显微镜比较像,但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。 一个流式细胞仪包括五个组成部分: * 细胞流动系统:液流(鞘液(sheath fluid))携带细胞,使颗粒以串流形式通过光束。 * 光源:有通常的灯(汞或氙)、高功率水冷的激光源(氩、氪、染料激光)、低功率气冷激光(氩(488nm),红氦氖(633nm),绿氦氖,氦镉(紫外))、偶极激光(蓝、绿、红、紫)。 * 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统:产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统,线性或对数放大。 * 计算机,用于分析信号。 早期的流式细胞仪主要是实验设备,但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同,主要的厂商和品牌如下: * Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms) * Becton, Dickinson: (FACS's): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform) * Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms) 应用 流式细胞术在很多领域中都有应用,包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中,
第四部分流式细胞术分析血小板 流式细胞术分析血小板 血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术,它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法,丰富了血小板功能评估指标。 一、流式细胞仪血小板分析应用范围 1.通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成,分析血小板活化,血小板对刺激物的反应性。 2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测,分析血小板止血功能的 获得性和遗传性缺陷。 3. 结合血小板大小,检测血小板RNA含量,分析血小板成熟度,计数网织血小板。 4. 发现血小板抗体,做定性和定量分析。 二、血小板分析的临床意义 1. 血栓性疾病:活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性,非风湿 性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化,胰岛素依赖性糖尿病,子痫前期,外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板,而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。 2. 血小板缺陷性疾病:全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺 陷性疾病,如巨大血小板综合征,血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大,功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷,导致血小板聚集功能障碍 3. 贮存池疾病:原发性贮存池疾病(δ-SPD)常规用血小板聚集法检测,但特异性和灵敏度均不理想。 检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法,主观性大,操作繁琐,而且一次检测的血小板数目有限。 全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法,一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比,δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病,也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。 4. 血小板减少性疾病:破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体(PAIg)是反 映血小板的破坏的指标,虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法,但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg,只要测定104甚至103个血小板,在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平,因而用血量少,只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标,如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有
一、样品制备 1、取样(大约1×106cells ),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl 的Rnase(GenScript 试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl 的PI染液(GenScript 试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells , 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3 满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLo)w,拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput )、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur 开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDB。Y如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell 中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDB,Y 5 分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQues,t 最大化,选散点图标,打开,Plot type 选择Acq-analysis ,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H (选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type 选择Acq-analysis ,X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实 验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性,主要包括以下几个方面: 1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液(配制方法见附录); l PI染液:将PI溶于PBS(pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min,弃去
流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上,这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中,制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞,又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤:①取材:取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织,必须取瘤细胞生长旺盛部位;组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜;一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存;②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色;③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储;④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析;⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节样本单细胞悬液的制备方法 一新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上,根据各种组织成分的特点,可选择不同的分散细胞方法,以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序,但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中,解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以,在对各种不同组织进行分散选择方法时,应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 (一)酶消化法 1 作用原理: 对实体组织分散的作用原理主要有3方面:①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等;②可以水解组织间的粘多糖等物质;③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有:蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等,都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键;胶原酶能降解几种分子类型的胶原;溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键;弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用,可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项: ①酶需要溶解于适当的溶液中,而这些溶液不致于造成酶效价降低;②要注意酶的使用浓度和消化时间;③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性,胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等;④要随时注意影响酶活性的其它因素,如酶的生产批号等。 3 方法学程序 (1)将适合于酶消化的组织置于离心管中; (2)将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中; (3)一般消化20-30分钟(恒温37℃或室温),消化期间要间断振荡或吹打; (4)终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞团块,以低速成离心除去细胞碎片;
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序: 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印 机。 3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入 1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校 正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果,退出FACSComp程序。 备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件:CellQuest Pro 1.软件,选择“联机”。 Acq Connect (1)在弹出的界面中的选择数据存储路径(Directory 菜单);