酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定

一、酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定

一、实验原理

1.超声波破碎细胞的实验原理

频率超过15～20kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250W），通过超声波发生器和换能器的作用, 将电能转换为声能，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而起到破碎细胞等物质的作用。2.采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在270～280nm具有一个紫外吸收高峰。在一定范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯比尔定律。由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及所处的微环境不同，故蛋白质溶液在280nm的吸光度值不同。3.血球计算板使用原理

计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

a.16格×25格的血球计数板计算公式:

细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数

b. 25格×16格的血球计数板计算公式:

细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数

二、实验流程图

1.啤酒酵母的破碎

啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数（采用紫外分光光度计定性检测蛋白）→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容测OD

280

器中，浸没超声发射针1 cm ；频率中档超声4 s，间歇6 s，80-120次；0.5 ml 悬液稀释1000倍，电子显微镜观察、计数；另取1.5 ml酵母破碎液12000 r/min

定性检测蛋白的释放情况；留4 ℃离心10 min取上清，紫外分光光度计测OD

280

取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。

2.大肠杆菌细胞的破碎

啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数定性检测蛋白→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容器，浸没超声发射针1 cm；频率中档超声4 s，间歇5 s，80次；取1.5 ml细胞悬浮液12000 r/min 4 ℃离心

定性检测蛋白的释放情况；留取50 ul上2 min取上清，紫外分光光度计测OD

280

清加入 2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。

三、实验结果

四、实验分析

细胞破碎方法综述

细胞破碎方法综述 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法 1前言 目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。 自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。 2细胞破碎技术 2．1高压匀浆破碎法（homogenization） 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 2．2振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振汤机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便. 2．3高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。 2．4超声波破碎法（ultrasonication）

细胞破碎技术—超声波破碎

细胞破碎技术——超声波破碎法 摘要： 细胞破碎技术的基本概念及其基本方法，重点介绍了从超声波破碎仪及超声波破碎常见的问题与解决方法上介绍了超声波破碎法。 关键词：细胞破碎方法超声波破碎仪常见问题 正文： 一、细胞破碎阻力 细菌——几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个胺基酸组成，如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-赖氨醯-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-胺基酸与二氨基庚二酸存在。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 酵母菌——酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 真菌——霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 植物细胞——对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网路，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网路系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网路之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 二、细胞破碎各类方法 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破

细胞破碎技术

四、细胞破碎 某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。 (一)机械破碎法 机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。 1．高压匀浆破碎法 Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。使用高压匀浆法时应注意，高压匀浆器的操作温度上升约2～3℃／10MPa，为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多级破碎操作中，为有效防止温度上升，保护产物活性，需要在级间设置冷却装置。 影响高压匀浆器破碎的主要因素包括压力、温度和通过均浆器阀的次数。升高压力有利

细胞破碎技术与方法

细胞破碎技术与方法 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 由于细菌、酵母、真菌、植物都有细胞壁，但成分不同，且同类细胞结成的网状结构不同，因此其细胞壁的坚固程度不同，总体呈现递增态势。动物细胞虽没有细胞壁，但具有细胞膜，也需要一定的细胞破碎方法来破膜，达到提取产物的目的。 细胞破碎的方法主要分为化学法和机械法两大类。具体如下： 化学法 渗透冲击破碎法 ? 方法：渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 反复冻融法 ? 方法：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃)，然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 酶溶破碎发法

? 方法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。 ? 特点： a) 此法适用多种微生物 b) 具有作用条件温和 c) 内含物成分不易受到破坏 d) 细胞壁损坏的程度可以控制 ? 存在的问题： a) 易造成产物抑制作用 b) 溶酶价格高 c) 酶溶法通用性差 化学试剂法 ? 方法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。SDS(十二烷基磺酸钠)是典型的阴离子表面活性剂 ? 特点：提取核酸时，常用此法破碎细胞。 ? 存在的问题： a) 时间长，效率低; b) 化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用 通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 方法技术原理效果成本应用 化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜 动物组织均质物或细胞 悬液 酶消化法 细胞壁被消化，使细 胞破碎 温和昂贵细菌或酵母

细胞破碎技术的研究与进展

合肥学院Hefei University 生物分离工程课程综述 题目: 细胞破碎技术的研究与进展 系别: 专业: 学号: 姓名: 2013年4月1日

细胞破碎技术的研究与进展 摘要：本文主要概述细胞破碎方法中的高压匀浆法和珠磨法, 讨论了两种方法的特点及存在的问题, 并对它们进行了比较, 最后概括了细胞破碎技术的发展方向。 关键词：细胞破碎技术；高压匀浆法；珠磨法；发展方向 1引言： 自年代初重组技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃, 生物产品的数量越来越多，许多具有重大应用价值的产品应运而生，如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一等, 它们的基因分别在宿主细胞如（大肠杆菌或酵母细胞）内克隆表达成为基因工程产物，从而提高了产量，降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质如上述药物经克隆表达后都属胞内物质，分离提取这类产物时，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤，破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。 2 细胞破碎技术的概述： 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。细胞的机械破碎主要有高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎法和超声波破碎法等方法，本文主要介绍高压匀浆法和珠磨法。 3 高压匀浆法： 高压匀浆法]1[是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高 压泵和匀浆阀组成。它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。 3.1破碎机理 同所有的机械破碎方式一样，高压匀浆法破碎细胞实质上是将细胞壁和膜撕裂，靠胞内的渗透压使其内含物全部释放出来。破碎的难易程度无疑由细胞壁的机械强度决定，而细胞壁的机械强度则由微生物的形态和生理状态决定。因此细胞的培养条件, 包括培养基限制型或

浅谈常用细胞破碎方法

浅谈常用细胞破碎方法 随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下： 关键词：细胞破碎机械法酶法 （一）细胞破碎的定义 1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 2.破碎各种细胞的主要阻力： 2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度; 2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度; 2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。 (二) 细胞破碎的方法 1.机械法 1.1高压匀浆破碎法（homogenization） 高压匀浆器（High pressure homogenizer） 操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。 操作方式：单次或多次循环 出口温度：20℃左右 压力：55－70Mpa 适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度：20%左右。☆团状和丝状菌，不宜使用。 注意事项： （1）操作温度：↑２－３℃/10MPa （2）对料液作冷却处理。 （3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，

第三章 细胞破碎技术

第二章细胞破碎和分离提取技术 2．1细胞破碎技术 许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质，这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出来，然后进行分离纯化。如图所示： 图胞内产品的分离纯化过程 2．1．1细胞破碎方法及机理 破碎细胞的目的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大渗透性）或破碎、释放其中的目标产物，主要采用的方法有机械法和非机械法两大类，图1列出了一些主要方法： 破碎方法 固体剪切作用液体剪切作用干燥处理溶胞作用 珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法 撞击法 图1 细胞破碎方法分类 机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，化学破碎则利用化学或生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下，使细胞膜破裂而释放胞内物质，各作用力细胞破碎机理如图2 2.1.2机械方法破碎 机械破碎处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高，是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受到挤压，剪切和撞击作用，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、

撞击破碎法和超声波等方法。 2.1.2.1 珠磨法（Bead milling ） 珠磨法是一种有效的常用的机械破碎方法，珠磨机是珠磨法所采用的设备，其结构示意图3，细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，在珠磨机中，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。 珠磨法破碎细胞可采用间歇式连续操作，研究表明，两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为： t k l S 11 n ?=- 其中， t 在间歇操作时，为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即R V t =，其中V 为悬浮液体积m 3，Q 为悬浮液流量m 3/S ，S 为破碎率，k 为破碎 速率常数，与许多因素有关。 珠磨法破碎受许多操作参数的影响，总结在表1中： 同一进料速度，细胞浓度越高，则破碎率越高，所需能耗越低；同时我们也能发现，破碎率越高所需能耗越大（同一悬浮液中）即破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗增加，且产生较多热量，引起浆液温度升高增加制冷量，因而总能量消耗增加。 珠磨法操作简便稳定，破碎率可控制，易放大，在实验室和工业规模上已得到应用，适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别是对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞。 2.1.2.2高压匀浆法（high-pressure homogenization ） 高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高压泵和匀浆阀组成，结构简图见图5，它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放，高速匀浆破碎的动力学方程为： ()b a 1n P N k l ??= 其中S 为破碎率，且max R R R =；k 为破碎速度常数，p 为动力，且上述参数s,k,a,b,p 等随微 生物种类和培养条件的不同而有所差异。 影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，图6是操作压力和循环次数对破碎的影响。由图可知，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力，因此，工业生产中常采用的压力为55－70Mpa 。 高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。

细胞破碎方法

机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。 1.组织捣碎机 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。 由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。 2.匀浆器 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 3.研钵 多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。 4.细菌磨 是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。 物理法 主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有： 1.反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。 2.急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。 3.超声波处理 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进

细胞破碎方法简述

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细胞破碎方法简述 2010-04-26 09:27:19|?分类：电泳资料 |标签： |字号大中小订阅 本文引用自啸月天狼《细胞破碎方法简述》 更多相关资料请查看 分离膜是指能以特定形式限制和传递流体物质的分隔两相或两部分的界面。膜的形式可以是固态的，也可以是液态的。被膜分割的流体物质可以是液态的，也可以是气态的。膜至少具有两个界面，膜通过这两个界面与被分割的两侧流体接触并进行传递。分离膜对流体可以是完全透过性的，也可以是半透过性的，但不能是完全不透过性的。膜在生产和研究中的使用技术被称为膜技术。随着科学技术的迅猛发展和人类对物质利用广度的开拓，物质的分离已成为重要的研究课题。分离的类型包括同种物质按不同大小尺寸的分离；异种物质的分离；不同物质状态的分离等。 在化工单元操作中，常见的分离方法有筛分、过滤、蒸馏、蒸发、重结晶、萃取、离心分离等。然而，对于高层次的分离，如分子尺寸的分离、生物体组分的分离等，采用常规的分离方法是难以实现的，或达不到精度，或需要损耗极大的能源而无实用价值。 具有选择分离功能的高分子材料的出现，使上述的分离问题迎刃而解。膜分离过程的主要特点是以具有选择透过性的膜作为分离的手段，实现物质分子尺寸的分离和混合物组分的分离。膜分离过程的推动力有浓度差、压力差和电位差等。膜分离过程可概述为以下三种形式： ①渗析式膜分离料液中的某些溶质或离子在浓度差、电位差的推动下，透过膜进入接受液中，从而被分离出去。属于渗析式膜分离的有渗析和电渗析等； ②过滤式膜分离利用组分分子的大小和性质差别所表现出透过膜的速率差别，达到组分的分离。属于过滤式膜分离的有超滤、微滤、反渗透和气体渗透等； ③液膜分离液膜与料液和接受液互不混溶，液液两相通过液膜实现渗透，类似于萃取和反萃取的组合。溶质从料液进入液膜相当于萃取，溶质再从液膜进入接受液相当于反萃取。 膜分离技术是利用膜对混合物中各组分的选择渗透性能的差异来实现分离、提纯和浓缩的新型分离技术。膜分离过程的共同优点是成本低、能耗少、效率高、无污染并可回收有用物质，特别适合于性质相似组分、同分异构体组分、热敏性组分、生物物质组分等混合物的分离，因而在某些应用中能代替蒸馏、萃取、蒸发、吸附等化工单元操作。实践证明，当不能经济地用常规的分离方法得到较好的分离时，膜分离作为一种分离技术往往是非常有用的。并且膜技术还可以和常规的分离方法结合起来使用，使技术投资更为经济。 膜分离过程没有相的变化(渗透蒸发膜除外)，常温下即可操作；由于避免了高温操作，所浓缩和富集物质的性质不容易发生变化，因此在膜分离过程食品、医药等行业使用具有独特的优点；膜分离装置简单、操作容易，对无机物、有机物及生物制品均可适用，并且不产生二次污染。由于上述优点，近二三十年来，膜科学和膜技术发展极为迅速，目前已成为工农业生产、国防、科技和人民日常生活中不可缺少的分离方法，越来越广泛地应用于化工、环保、食品、医药、电子、电力、冶金、轻纺、海水淡化等领域 细胞破碎方法简述随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃．很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当

细胞破碎方法

细胞破碎（clasmatosis）的方法 2010-02-20 21:00:42 来源：易生物实验浏览次数：615 网友评论0 条 不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。 关键词：细胞细胞破碎clasmatosis 不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。具体如下： 一、细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，通常破碎细胞后，先分离各组分，以防干扰，这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的，细胞器的分离，一般采用差速离心法，此法是利用细胞各组分质量大小不同，在离心管不同区域沉降的原理，分离出所需组分，分离得到的细胞器，其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。 二、细胞器的分离有时需要将组织细胞破碎，然后根据待分离的细胞器的理化特性，选择适当的分离方法。一般采用差速离心或密度梯度离心的方法达到分离细胞器的目的。 三、破碎方法： (1)杆状玻璃匀浆器法：该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管 组成。使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力使玻杆移动使组织细胞破碎。 (2)高速组织捣碎机法：使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中，至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解，用冷却水降温更好。 (3)超声波处理法：超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶 液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。 (4)化学裂介法：在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。 (5)反复冻融法：组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后，于37℃融化，经3-4次冻融周期，可使细胞破碎。 另外，部分细胞器的分离一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。

细胞破碎技术

细胞破碎技术 细胞破碎技术是我们根据国际九十年代最新技术研制成功的新产品。对粘度低于 0.2Pa.s，温度低于80摄氏度液体物料（液-液相或液-固相）的均质乳化，如乳品、饮料、化妆品、药品等产品的均质、乳化，细胞破碎技术有很好的适用性，下面小编给大家介绍一下细胞破碎技术。 1、细胞破碎技术工作原理 样品必须经过严密的金刚石制备分散阀门，并承受超高压力能量狭缝瞬间释放所产生的剪切、空穴、碰撞三种均质分散效应，同时样品始终享受着低温水浴的冷却或恒温（4~6℃间任意调整），使之处理后的样品颗粒均匀纳米化且不易抱团；4-80℃间任意可调也可通过升温改变样品流动性，便于制备与分散。 2、细胞破碎技术用途

适用于：高等院校、科研所、化工、涂料、新材料、新能源、生物医药等行业使用 石墨烯，纳米碳管、碳粉制备与分散； 纳米高分子材料制备与分散； 纳米涂料制备与分散； 纳米电池液、浆料制备与分散； 纳米油墨制备与分散； 纳米染料制备与分散； 纳米油漆制备与分散； 纳米药物制备与分散； 其他??????????? 3、细胞破碎技术设备操作说明 整套机器设备安装到位后，检查各系统联接无误（进水管/出水管、排水管、冲洗水管、电源、电路），观察物料样品是否通过透明胶管进入主机进口，冷却循环水是否正常运转流通，然后操作相关按钮，使主机正常工作。 具体步骤见下： （1）接通总电源，整机通电。将钥匙插入工作/锁定转换孔，并旋到工作位置。 （2）进样杯中加满纯净水或缓冲液，按“液压泵”“开”按钮（绿色），油泵启动，供油压力输入主附油缸。 （3）按“主机”“开”按钮，机器正常运转（往复运动）。 （4）顺时针缓慢调节调压阀，使低压表、高压表压力同步上升，根据样品种类，调节破碎压力（200Mpa以下）。 （5）当纯净水或缓冲液到达进样杯颈部时，按“主机”“关”按钮，机器停止运转。将待破碎样品加入进样杯中，按“主机”“开”按钮，细胞破碎开始。经均质阀破碎后的样品，沿循环冷却管路冷却后，从出样口流出，样品一次破碎完成（可根据需要，进行多次破碎）。（6）样品破碎完后，逆时针调节调压阀，使右边低压表至“0”位，加入纯净水或75%酒精进行清洗，直至出样清澈。

细胞破碎方法简述

细胞破碎方法简述 2010-04-26 09:27:19| 分类：电泳资料| 标签：|字号大中小订阅 本文引用自啸月天狼《细胞破碎方法简述》 更多相关资料请查看https://www.wendangku.net/doc/3f18940493.html, 分离膜是指能以特定形式限制和传递流体物质的分隔两相或两部分的界面。膜的形式可以是固态的，也可以是液态的。被膜分割的流体物质可以是液态的，也可以是气态的。膜至少具有两个界面，膜通过这两个界面与被分割的两侧流体接触并进行传递。分离膜对流体可以是完全透过性的，也可以是半透过性的，但不能是完全不透过性的。膜在生产和研究中的使用技术被称为膜技术。 随着科学技术的迅猛发展和人类对物质利用广度的开拓，物质的分离已成为重要的研究课题。分离的类型包括同种物质按不同大小尺寸的分离；异种物质的分离；不同物质状态的分离等。 在化工单元操作中，常见的分离方法有筛分、过滤、蒸馏、蒸发、重结晶、萃取、离心分离等。然而，对于高层次的分离，如分子尺寸的分离、生物体组分的分离等，采用常规的分离方法是难以实现的，或达不到精度，或需要损耗极大的能源而无实用价值。 具有选择分离功能的高分子材料的出现，使上述的分离问题迎刃而解。膜分离过程的主要特点是以具有选择透过性的膜作为分离的手段，实现物质分子尺寸的分离和混合物组分的分离。膜分离过程的推动力有浓度差、压力差和电位差等。膜分离过程可概述为以下三种形式： ①渗析式膜分离料液中的某些溶质或离子在浓度差、电位差的推动下，透过膜进入接受液中，从而被分离出去。属于渗析式膜分离的有渗析和电渗析等； ②过滤式膜分离利用组分分子的大小和性质差别所表现出透过膜的速率差别，达到组分的分离。属于过滤式膜分离的有超滤、微滤、反渗透和气体渗透等； ③液膜分离液膜与料液和接受液互不混溶，液液两相通过液膜实现渗透，类似于萃取和反萃取的组合。溶质从料液进入液膜相当于萃取，溶质再从液膜进入接受液相当于反萃取。膜分离技术是利用膜对混合物中各组分的选择渗透性能的差异来实现分离、提纯和浓缩的新型分离技术。膜分离过程的共同优点是成本低、能耗少、效率高、无污染并可回收有用物质，特别适合于性质相似组分、同分异构体组分、热敏性组分、生物物质组分等混合物的分离，因而在某些应用中能代替蒸馏、萃取、蒸发、吸附等化工单元操作。实践证明，当不能经济地用常规的分离方法得到较好的分离时，膜分离作为一种分离技术往往是非常有用的。并且膜技术还可以和常规的分离方法结合起来使用，使技术投资更为经济。 膜分离过程没有相的变化(渗透蒸发膜除外)，常温下即可操作；由于避免了高温操作，所浓缩和富集物质的性质不容易发生变化，因此在膜分离过程食品、医药等行业使用具有独特的优点；膜分离装置简单、操作容易，对无机物、有机物及生物制品均可适用，并且不产生二次污染。由于上述优点，近二三十年来，膜科学和膜技术发展极为迅速，目前已成为工农业生产、国防、科技和人民日常生活中不可缺少的分离方法，越来越广泛地应用于化工、环保、食品、医药、电子、电力、冶金、轻纺、海水淡化等领域 细胞破碎方法简述 随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃．很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。 1 高压匀浆法 设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，英国ADV公司和美国Microfluidics公

三种微藻细胞破碎方法的比较

[7]梅景良,马燕梅,张红星.夏、冬两季黑鲷消化酶活力的比较[J ].中国海洋大学学报,2005,35(6):1001-1004. [8]黎军胜,李建林,吴婷婷.样品处理对罗非鱼和银鲫肠道消化酶活性测定的影响[J ].水产学报,2004,28(6):738-740. [9]M C Hidalg o ,E Urea ,A Sanz.C om parative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits.Proteolytic and amylase activities [J ].Aqu aculture ,1999,170:267-283. [10]白东清,乔秀亭,乔之怡.pH 对丁　仔鱼和稚鱼肠及肝胰脏蛋白酶活性的影响[J ].水利渔业,2006,26(1):3-4. [11]王晓梅,戴伟,许童.丁　肠道及肝胰脏组织学研究[J ].水产科学,2005,24(3):13-15.[12]M Fur é,M C Hidalg o ,A l ópez ,M G arcia -G alleg o.Digestive enzyme ac 2tivities in Activities sturgeon Acipenser naccaii and rainbow trout Oncorhynchus myliss .A com parative study[J ].Aqu aculture ,2005,250:391-398.[13]Fevzi ,Y ilmaze.Reproductive biology of the tench T inca T inca (L.,1758)inhabiting P orsuk Dam Lake (K utahya ,Turkey )[J ].Fisheries R esearch ,2002,(55):313-317. [14]关胜军,吴锐全,谢骏.大口黑鲈主要消化器官淀粉酶活力的研究[J ].浙江海洋学院学报,2006,25(4):381-383. [15]倪寿文,桂远明,刘焕亮.草鱼、鲤、鲢、鳙和尼罗罗非鱼肝胰脏和肠道蛋白酶活性的初步探讨[J ].动物学报,1993,39(2):160-168. [16]Dhage K P.S tudies of the digestive enzymes in the there species of major Carps of India[J ].Biol .Sci .,1968,11:63-74. [17]周景祥,陈勇,黄权.鱼类消化酶的活性及环境条件的影响[J ].北华大学学报,2001,2(1):70-73. [18]田宏杰,庄平,章龙珍.水温对施氏鲟幼鱼消化酶活力的影响[J ].中国水产科学,2007,14(1):128-131. [19]梅景良,马燕梅.温度pH 对黑鲷消化酶主要消化酶活力的比较[J ].集美大学学报,2004,9(3):226-229.[20]黄耀桐,刘永坚.草鱼肠道、肝胰脏蛋白酶活性初步研究[J ].水生生物学报,1988,12(4):328-333. [21]吴众望,潘鲁青,董双林.9种金属离子对缢蛏消化酶活力的影响[J ].中国水产科学,2003,10(4):297-300. [22]Hai -ying W ang ,Y ue -Jun W ang ,Qing -Y in W ang.Purification and characterization of stomach protease from the turbot (Scophthalmus maximus .L )[J ].Physiol Biochem ,2006,6(10):263-274. [23]杨蕙萍,童圣英,王子臣.皱纹盘鲍淀粉酶和褐藻酸酶的研究[J ].水产学报,1998,22(4):345-351. 三种微藻细胞破碎方法的比较 陈伟平,陈必链3 ,张艳燕 (福建师范大学生命科学学院,福建福州350108) 摘要:目的:获得最佳的微藻藻胆蛋白提取方法。方法:采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法和玻璃珠处理法等四种方法分别对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻三种藻细胞进行破碎,通过测定藻红蛋白的纯度和浓度对四种细胞破碎方法效果进行比较。结果:当细胞密度为1.000g ΠL 时,采用反复冻融法处理紫球藻和蔷薇藻时能够获得最高的藻红蛋白纯度(OD 545ΠOD 280),分别为1.250和1.669,藻红蛋白的浓度分别为29.788mg ΠL 和36.026mg ΠL ,细胞密度对藻红蛋白纯度影响较小;低浓度氯化钙溶液提取法能使念珠藻藻红蛋白的纯度(OD 545ΠOD 280)达到0.477。结论:紫球藻和蔷薇藻经反复冻融法破碎细胞,藻红蛋白纯度高,提取效果好;而对念珠藻藻红蛋白提纯采用低浓度氯化钙溶液提取法效果好。 关键词:藻红蛋白;提取;细胞破碎;微藻 中图分类号:Q814.1;Q936;Q949.29 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)01-0055-04 Evaluation of Different Cell Disruption Processes on Microalgae CHE N Wei -ping ,CHE N Bi -lian 3 ,ZH ANG Y an -yan (C ollege of Life Sciences ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350108,China ) Abstract :Objective :In order to get the best extraction process of B -phycoerythrin from microalgae.Methods :F our kinds of cell disruption pro 2cesses (diss olving -bulging ,freezing and thawing ,low concentration of calcium chloride extraction and beading treated )were used to disrupt three microalge (Porphyridium cruentum ,Rhodella reticulata and Nostoc punctiforme ).The purity and concentration of B -phycoerythrin (B -PE )were used in the assay.R esults :By using freezing and thawing ,the highest purity of B -PE for Porphyridium cruenum and Rhodella reticu 2lata were obtained when cell density reached 1.000g ΠL.The purity and concentration of B -PE for Porphyridium cruentum were 1.250and 29.788mg ΠL ,for Rhodella reticulata were 1.669and 36.026mg ΠL ,respectively.Nostos punctiforme cells ,which was treated with low concentration of calcium chloride extraction ,reached the highest purity of B -PE (OD 545ΠOD 280=0.477)when cell concentration was 1.000g ΠL.Conclusion :By using freezing and thawing ,the highest purity of B -PE and the higher extract yield for Porphyridium cruenum and Rhodella reticulata were ob 2tained.Low concentration of calcium chloride extraction can be used for obtainning higher purity of B -PE from Nostos punctiforme .K ey w ords :B -phycoerythrin ;extraction ;cell disruption ;microalgae 收稿日期:2007-09-24;修回日期:2007-10-29 基金项目:福建省发展和改革委员会项目资助(闽计投资[2003]203)作者简介:陈伟平(1982-),男,福建漳州人,硕士生,从事海洋微藻研究,E -mail :cw p045@https://www.wendangku.net/doc/3f18940493.html, ;3通讯作者:陈必链,E -mail :chenbil @https://www.wendangku.net/doc/3f18940493.html, 。 藻胆蛋白是红藻和蓝藻所特有的、通过线性四吡咯发色团和脱辅蛋白相互结合的捕光色素蛋白。根据色素蛋白不同的吸收光谱特性,藻胆蛋白可以分成藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等三种。除了别藻蓝蛋白外,其他两种均有B -、b -、R -等类别,C -藻红蛋白、C -藻蓝蛋白和R -藻蓝蛋白在结构上存在相当明显的差异,因而光谱也存在一定的区别[1]。藻胆蛋白是一种从藻类中提取的天然蛋白质,是一种安全无毒的蛋白产品。目前已在许多领域得到应用,如功能食品、天 然色素、肿瘤治疗和荧光探针等[2-4] ,还作为光敏剂用于光动 力治疗癌等方面[5] 。高纯度的藻胆蛋白的零售价约为每毫克 50美元[6] 。 藻胆蛋白属于胞内可溶性蛋白,要提取分离藻胆蛋白,必须破碎藻细胞,使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来,获得藻胆蛋白粗提液,并保持其活性。藻胆蛋白粗提液中杂蛋白含量较高,还需进一步纯化。因此分离破碎藻细胞,获得藻胆蛋白粗提液是藻红蛋白分离纯化的第一步工作也是关键的一步工作。反复冻融法是非机械破碎的方法,具有方便,对热敏性物质没有损害,不受外源性杂质污染等优势特性,因而应用广泛。而对于蔷薇藻的细胞破碎方法文献报道较少。因此本论文采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法、玻璃珠处理法等多种方法对不同浓度的紫球藻、蔷薇藻、念珠藻三种微藻进行破碎提取,通过不同方法结果比较,选择制备藻胆蛋白粗提液的最佳破碎方法,增加细胞破碎的藻红蛋白得率,为藻红蛋白工业化提纯奠定基础。 1　材料与方法 1.1　材料1.1.1　实验材料 紫球藻(Porphyridium cruentum )、蔷薇藻(Rhodella reticula 2ta )、念珠藻(Nostoc punctiforme )藻种购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。