禽流感病毒中和实验整理
禽流感病毒中和实验及其他方法
（一）实验材料
1、中和反应实验材料
(1)病毒：
）的滴定。
一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID
50
(2)血清样品
包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。－20℃储存，避免多次反复冻融。
(3)MDCK细胞和细胞培养试剂
1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）
2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌
500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）
5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）
5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔）
25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清
3)胰酶 / EDTA
(4)其它
1)平底96孔微量培养板
2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM
66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA）
5毫升 100×抗生素
3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）
4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存
400毫升丙酮
100毫升 PBS，PH 7.2
2、ELISA实验材料
(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体
(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG
(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20
4升 PBS，PH 7.2
2毫升 TWEEN－20
(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20
867毫升PBS，PH 7.2
132毫升牛血清白蛋白
1毫升TWEEN－20
(5)底物和底物溶液：
常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD）
底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M）
底物和底物溶液：10毫克OPD
20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水）
即配即用
磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.0
58.8克柠檬酸三钠
1升蒸馏水
用盐酸调节PH为5.0
加0.015%双氧水，（临用前加入）
* 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制
(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水）
3、其他
细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）
备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma 公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。
B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。
（二）质量控制
病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。
1、血清对照
血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，－20℃保存，并避免反复冻融使用。
(1)阴性血清对照
1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。
2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病毒。
3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。
(2)阳性血清对照
1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。
2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。
* 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。
2、病毒和细胞对照
每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。
(1)阳性和阴性细胞对照
一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量
（100TCID
）的病毒进行混合培养。同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病50
毒稀释液进行混合培养。
阳性细胞对照：50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。
阴性细胞对照：100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞
(2)病毒工作液滴度检查
的100微升病毒液，然后进行2倍稀释，再与MDCK 一般第1孔加入含有200TCID
50
细胞进行混合培养。
）病毒滴度检查：50微升2倍系列稀释病毒液（第1孔为100TCID
50 +50微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞（1.5×104细胞/孔）（三）实验步骤
1、病毒滴度测定（组织培养半数感染量－TCID
滴定）
50
(1)流感病毒制备
利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝实验测定病毒的存在，
分装后－70℃冻存。
(2)病毒的稀释
1)取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）
2)第1排孔加入146微升1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、
10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔，详细操
作参见图1。
* 人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加
入2微克/毫升的TPCK－胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下
即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两
种稀释液，以获得最佳结果。
(3)MDCK细胞的准备
1)使用前2天将MDCK细胞1:100传代，使之70~90%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。
2)弃去细胞培养液，用5毫升胰酶 / EDTA洗细胞一次，然后弃去。
温箱中消3)加4到5毫升胰酶 / EDTA覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶）37℃ 5%CO
2
化10~20分钟。
4)待细胞开始脱落时，加5~10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管中，用PBS洗2次，以去除牛血清。
5)将细胞悬浮于病毒稀释液中，用1毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计数细胞数量。
6)用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升。
7)加100微升细胞（1.5×104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。
温箱中培养18－22小时。
8)在37℃ 5%CO
2
(4)测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）
1)弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。
2)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。
3)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。
4)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。
5)用ELISA检测细胞感染（参见ELISA部分）
6)利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数细胞阴性对照孔的平均OD值。
7)若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。
/100微升（参见附8)根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID
50
录和表2）。
流感病毒。
9)在进行中和实验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID
50
2、病毒微量中和实验
(1)待检血清的准备和稀释
1)检测对一种病毒的中和抗体需要10微升血清，每份血清需要进行至少1次重复测定（共需至少20微升血清/每种病毒），每块板可检测11份样品。
2)人血清需56℃加热灭活30分钟。
3)实验设计请参照图2。
4)每孔中加入50微升病毒稀释液。
5)第1排中（A1－A11）再加入40微升病毒稀释液，使之成为90微升/孔。
6)加入10微升待检血清于第1排A1－A11。
7)将待检血清作系列倍比稀释（A－H）使之成为1:10、1:20、1:40……1:1280。
(2)病毒的准备
/50微升。根据病毒特性选择是否在病毒稀释液中加入TPCK 1)稀释病毒至100TCID
50
胰酶（大约5毫升/每板）。
2)除细胞阴性对照孔（4孔）外，每孔加入50微升病毒工作液。
3)加50微升病毒稀释液于细胞阴性对照孔。
4)选择1列孔做病毒工作液滴度核实。第1孔加入200TCID
/100微升病毒工作液，
50
做系列倍比稀释，使之成100TCID50，50，25，12，6……0.7。然后每孔加入50微
升病毒稀释液，使体积至100微升/孔。
5)摇匀病毒－血清混合物，放37℃温箱作用2小时。
(3)MDCK细胞的准备。（参见病毒滴定测定部分）
加100微升细胞液（1.5×104细胞/孔）于含有病毒－血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中，37℃温箱孵育18－22小时。
* 当测定大量样品时，每叠培养板一般不超过4－5块，各叠板之间要保持一定距离，以确保混合物受热均匀，从而达到良好的中和效果。
(4)细胞的固定
1)弃去微量培养板中的细胞液。
2)250微升PBS洗细胞一次。
3)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。
4)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。
5)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。
3、酶联免疫吸附实验（ELISA）
ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物
时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应，即形成有色的产物，便
可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。该方法具有特异性、敏感性、快速性和
简易性等优点。在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG
抗体）与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结
合，HRP酶催化OPD，使无色底物形成橙黄色化合物，再由ELISA检测仪测定吸
光度值，从而获得中和抗体滴度。
(1)实验操作
1)用250微升PBS洗涤微量培养板3次，以去除残余的丙酮。
2)用封闭液1：4000（或最佳稀释度）稀释抗体1（抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体）
3)每孔加入稀释后的100微升抗体1，室温作用1小时。
4)用250微升洗涤液洗板4次以除去抗体1。
5)用封闭液1:2000（或最佳稀释度）稀释抗体2（HRP标记的羊抗鼠IgG）。
6)每孔加入稀释后的100微升抗体2，室温作用1小时。
7)用250微升洗涤液洗涤板6次以除区抗体2。
8)每孔加OPD底物100微升（10毫升OPD+20毫升柠檬酸缓冲液+10微升30%双氧水，即用即配）。
9)室温放10分钟左右显色，直至细胞阳性对照孔变橙黄色，而细胞阴性对照孔尚未变色时，每孔加1M硫酸100微升终止反应。
10)在ELISA测定仪上（490纳米）读出每孔OD值。
(2)结果判定
下列公式用于判定中和反应结果
（细胞阳性对照平均OD值—细胞阴性对照平均OD值）／2+细胞阴性对照平均OD值=X
X=细胞半数感染阈值，每孔OD值低于X值时，判定为中和反应阳性，中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的和抗体滴度。
* 在特殊情况下可用目测法判定结果，即加底物后，肉眼下出现橙黄色反应的为阴性。
无色为阳性。待检系列稀释血清中无色孔的最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。
* 流感病毒中和实验的质量控制
a.阴性血清对照孔的OD值应该与阳性细胞对照孔的OD值无明显差别。
b.病毒工作液滴度检测孔，上数3－5孔呈阳性反应，显示正常病毒量。
若超过5孔阳性，则为病毒过量，若少于3孔阳性，则为病毒量不足。
c.阴性细胞对照孔的OD值一般小于0.2，阳性细胞对照孔的OD值一般在1左右。
d.每次测定中，阳性血清对照的中和抗体滴度应该在2倍之内波动。
4、操作注意事项
(1)待检人血清需56℃30分钟灭活，动物血清需RDE处理。
(2)待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。
(3)每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照OD值过低，须对病毒进行重新滴定。
(4)MDCK细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化（代数过高）。因此，必须在10代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。
(5)牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。
(6)病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时，该实验采用37℃作用2小时，但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。
(7)在ELISA过程中，每步都要洗涤，以保证结果可靠。
(8)选择合适的抗体稀释浓度，一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗体进行ELISA测定，以获得最佳稀释度。
(9)正确控制显色时间，以降低背景染色。
(10)大量测定时，为稳定培养液的PH值，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少PH变化对细胞的不利影响。
(11)在缺少病毒特异性抗体的情况下，可用细胞病变观察或测量培养板中每孔血凝活性来替代ELISA方法，但细胞培养时间须从18－22小时增至2－4天。
4、病毒TCID50 滴度的计算
组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用Reed－Muench方法计算。
(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）
(2)计算阳性和阴性孔的累积数。
阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4）
(3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100
(4)计算距离比例
距离比例=（大于50%的阳性百分比－50）/（大于50%的阳性百分比－小于50%的阳性百分比）=（75－50）/（75－0）=0.3
TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数的对数=5+0.3×0.5=5.15
TCID50=10-5.15/100微升
100TCID50/50微升＝10-2.8
100TCID50/50微升=1:631稀释
(5)稀释系数的对数
1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7。
五、流感实验室检测中应注意的若干问题
1、禁止在同一实验室，更不应在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。
2、禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。
3、接种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70℃或以下保存，以便需要时可进行复查，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。分离阴性的标本应随时弃之。
4、严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。
5、向国家流感中心送毒株时，量至少需5 ml，同时需自己保存一些，以便寄送过程发生意外时可继续补送。
6、流感病毒在-20℃～-40℃时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。
7、鸡胚中分离出的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系，一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。
8、寄送毒株时一定需附上送检表。寄送毒株需及时，尤其鉴定不出的，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心。
禽流感病毒检测方法研究进展
禽流感检测方法研究进展 郑胜男本硕21 摘要:禽流感是一种可以感染多种禽类和人的烈性传染病,其病毒亚型众多,宿主范围广，容易发生变异和重组，由于各亚型之间无交叉反应性,使得禽流感病毒的检测工作较为困难。目前，该病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，同时,人们也正致力于用一些新兴检测方法来检测禽流感病毒。现就禽流感病毒的检测方法做一综述。关键词:禽流感病毒;检测方法;AIV；血清;诊断；分子生物； 禽流感是由正黏病毒科、A型流感病毒属中的不同亚型引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。目前已知禽流感病毒的血凝素包括16种亚型，[1]神经氨酸酶包括9种亚型。其中H5和H7亚型常为高致病性的禽流感病毒。 1.病原学检测方法 1 .1病毒分离与鉴定 病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，以细胞发生病变，鸡胚死亡或培养物尿囊液具有凝集红细胞特性作为判定依据作初步鉴定，也可用针对NP的单抗,用免疫荧光染色作病毒的初步鉴定。[2]确诊还需其它辅助检测手段。其检测结果准确可靠，灵敏，极少量病毒也可检出。但其操作程序繁
杂，费用高，实验室要求高，耗时费力，周期长，检测时间需1～3 周，大面积应用推广受到较大限制。 1 .2电镜检测技术 用电镜技术或免疫电镜技术诊断禽流感病毒，可以在电子显微镜下清楚观察到粒子形态，确定病毒的有无。[3]、[4]电镜技术快速、准确，但检验结果与样品制备技术、取病材料的部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。 2.免疫学检测 2 .1血凝(HA )和血凝抑制(HI)试验 HA 和HI 简单、快速、特异性好，但是操作繁琐费时，不能用已知HA亚型的抗血清检出禽流感新的HA亚型。HI试验是WHO进行全球流感监测所采用的普及方法。[5]一般先将可疑病料接种适龄鸡胚或细胞进行病毒分离，然后用HA试验检测出培养物是否具血凝素活性，再用已知阳性血清进行HI试验来验证。[6] 2 .2琼脂扩散试验(AGP) AGP试验是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，适用于鉴定所有A型流感病毒。AGP试验操作简单，既可以定性又可以定量。但敏感性差，易有有假阳性。现已在AIV快速定型双扩散法[7]基础上建立了AGP诊断试剂盒。AGP试验可以用敏感性、准确性良好的尿素- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为补充或辅助诊断手段。 [8] 2 . 3乳胶凝集试验(LAT)
禽流感病毒的传播途径
禽流感病毒的传播途径 至今由禽鸟传人的禽流感有三种：甲型H5N1、甲型H7N7及甲型H9N2。禽流感主要通过横向传播，即通过易感禽类与感染禽类的直接接触或与病毒污染物的间接接触而传播，如被污染的饮水、飞沫、饲料及其他被污染的蛋筐、蛋盘、运输工具等。被病毒污染的羽毛和粪便是重要的传染物，因为病毒含量高而且存活时间长，应特别注意。该病能否垂直传播，目前尚无足够的证据，但从自然感染禽流感病毒的鸡蛋蛋黄、蛋清及蛋壳中均能分离到病毒，所以感染鸡群的蛋不能用作孵化，不经消毒处理的不能运至非疫区。人感染禽流感的主要传播 主要经呼吸道传播，通过密切接触感染的禽类及其分泌物、排泄物，受病毒污染的水等，以及直接接触病毒毒株被感染。在感染水禽的粪便中含有高浓度的病毒，并通过污染的水源泉由粪便-口途径传播流感病毒。目前还没有发现人感染的隐性带毒者，尚无人与人之间传播的确切证据。 人类对禽流感的研究和防治工作已有100多年的历史。目前研究结果表明，禽流感病毒中缺乏人流感病毒的基因片段，除非禽流感病毒与人流感病毒发生基因重组，否则它很难侵犯人类，导致人与人间传播。人禽流感的发生，目前只可能是因接触的病禽而感染。人感染病毒的几率很小。
一般认为任何年龄均具有易感性，但12岁以下儿童发病率较高，病情较重。与不明原因病死家禽或感染、疑似感染禽流感家禽密切接触人员为高危人群。 单纯型流感 仅有上呼吸道卡他性炎症变化，黏膜可见充血、水肿及淋巴细胞浸润。纤维上皮细胞变性、坏死、脱落。 肺炎型流感 肺脏是暗红样水肿。气管、支气管内有血性分泌物、黏膜充血，其纤毛上皮细胞坏死脱落，黏膜下层灶性出血、水肿和白细胞浸润，肺泡中有纤维蛋白渗出液，含中性粒细胞及淋巴细胞。肺中叶肺泡有出血，肺泡内可有透明膜，肺组织易分离出流感病毒。 严重并发症型流感 主要病理改变为肺实变。由于肺间质水肿、间质负压减小，增加小气道陷闭倾向，导致肺不张；肺泡膜表面活性物质减少，肺泡亦陷隐闭；加之肺充血，使肺容量减小和肺顺应性下降，导致急性呼吸急迫综合征等严重并发症。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构
禽流感病毒致病机制的研究进展
文献综述 禽流感病毒致病机制的研究进展 摘要：禽流感对畜禽养殖业造成巨大经济损失，并对人类健康造成威胁，已成为各国公共卫生关注的人畜共患病。本文从禽流感病毒（Avian Influenza Virus.AIV）的分子学特性，跨越种属的传播机制以及各基因组份与致病性的作用等方面进行简述。 关键词：禽流感病毒；传播机制；致病机制 １前言 禽流感（Avian Influenza.AI）是由正粘病毒科A型流感病毒（Avian Influenza Virus. AIV）引起的禽类急性传染病，被世界动物卫生组织和我国《家畜家禽防疫条例》列为A类烈性传染病。禽流感病毒根据其核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）抗原性及其基因特性的不同可划分为A、B、C型。其中A型流感病毒感染范围最广、危害最大，常以流行性的形式出现，并能引起世界性人流感的大流行。A型流感病毒也可以从各种动物体中分离到，例如人、猪、马、海洋哺乳动物、猫、狗和鸟类等[1]。根据对鸡致病性的不同，AIV可以分为高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza.HPAI）和低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza.LPAI）。高致病性AIV由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率达100%，其感染禽类达88种，主要是鸡、鸭、鹅，除此之外，还可感染猪、猫、狗、老虎等哺乳动物和人类，是一种人畜共患病，对各国的公共卫生构成严重的危害[2]。近年来不断增加的H5N1亚型禽流感病毒（AIV）直接感染人、致人死亡的事件不断增加。本文对禽流感病毒致病机制的研究进展综述如下，以期提高人们对公共卫生学意义上禽流感防控紧迫性的认识。 ２AIV生物学特征 流感病毒属正黏病毒科，是一种呈球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，其基因组分为8个节段，编码血凝素（hemagglutinin, HA)），神经酰胺酶（neuraminidase, NA），基质蛋白（matrix protein,M）M1和离子通道M2，非结构（nonstructrual,NS）蛋白NS1和NS2，核蛋白（nucleo protein,NP）以及三个聚合酶PB1、PB2（polymerase basic1, 2）和PA（polymerase acidic）以及新发现的与有道细胞凋亡有关的PB1-F2蛋白[3]等10种蛋白。根据核蛋白和基质蛋白的抗原性不同，流感病毒被分为甲型、乙型和丙型，AIV 属于甲型流感病毒。甲型和乙型流感病毒的主要抗原表位位于跨膜糖蛋白HA和NA，根据这些糖蛋白抗原性的差异，甲型流感病毒可分为16个H亚型（H1- H16）和9个N
禽流感的预防知识讲座
魏官庄小学 如何预防H7N9禽流感病毒知识讲座禽流感病毒普遍对热敏感，对低温抵抗力较强，65℃加热30分钟或煮沸(100℃)2分钟以上可灭活。病毒在较低温度粪便中可存活1周，在4℃水中可存活1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0的条件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上。 一、流行病学 (一)传染源。目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。 (二)传播途径。经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。 (三)易感人群。目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。 (四)高危人群。现阶段主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前1周内接触过禽类者。 二、临床表现 根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。 三、H7N9的症状和预防
1. 病情表现为典型的病毒性肺炎，起病急，病程早期有高热(38度以上可给予物理降温，如冰敷，乙醇擦浴，降温毯等。儿童禁用水杨酸类解热镇痛药)，咳嗽等呼吸道感染症状。起病5-7天出现呼吸困难。 2. 对鸡肉等彻底煮熟，不要吃半生不熟鸡蛋。 3.尽量不接触活禽鸟和猪等。 4. 病毒在100℃中一分钟可被消灭。 5. 加强身体锻炼，增强自身的身体的免疫力 6. 要勤开窗，不要因为害怕pm2.5而把窗户紧闭，导致空气不流通。 7. 避免去人多的地方，现在病毒虽还没有变异到人传人，但年老体弱和幼儿抵抗力差，还是要注意的好。 8. 在家的时候，采用熏醋的方法在家庭中用于预防不耐酸的流感病毒、副流感病毒、呼吸道病毒等所引起的感冒有一定效果。 9. 春夏转换季节，一定要注意保暖，千万不要觉得，天气变暖了，就可以少穿衣服，不要着凉了。 10. 早睡早起，生活要规律，不要再暴饮暴食，多吃蔬果，不抽烟，少喝酒，养成一个好的生活习惯。
禽流感病毒的简要介绍
禽流感的介绍与防治 林泽宇201400111040化学 摘要：禽流感是禽流行性感冒的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。一般情况下，禽流感病毒并不容易使人类发病。 关键词：禽流感、传播途径、对人致病性 1.引言： 禽流感是禽流行性感冒的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为Ａ类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。不仅是鸡，其它一些家禽和野鸟都能感染禽流感。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。一般情况下，禽流感病毒并不容易使人类发病。禽流感病毒属甲型流感病毒，甲型流感病毒根据其表面蛋白质的不同被分为Ｈ1到Ｈ15等15种亚型。世界各地的禽流感主要由高致病性的Ｈ5和Ｈ7两种亚型引起，而人对其中的Ｈ1和Ｈ3亚型易感。 2.研究历史： 连月来，以Ｈ５Ｎ１高致病性禽流感病毒为主要病原的禽流感疫情在亚洲多个国家先后暴发，其传播的范围和规模是空前的。尽管目前只在越南、泰国发现了人感染禽流感的病例，但这场成千上万只家禽病死或被宰杀的禽流感危机，无疑给人类健康带来巨大的威胁。 禽流感病毒攻击人类在历史上已非首次。有据可查的禽流感病毒直接传染人的首个病例为１９９６年的１例结膜炎患者，Ｂａｎｋｓ等对其病毒分离株（２６８／９６）进行了ＤＮＡ测序后发现，７个神经氨酸酶（ＮＡ）及内部基因与禽流感病毒高度同源，血凝素（ＨＡ）基因的全部核苷酸序列也与１９９５年从爱尔兰火鸡身上分离出的Ｈ７Ｎ７病毒株有９８．２％相同。 3.基本特征： 成分：甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）/和神经氨酸酶（N）蛋白抗原
禽流感病毒中和实验整理
禽流感病毒中和实验及其他方法 （一）实验材料 1、中和反应实验材料 (1)病毒： ）的滴定。 一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID 50 (2)血清样品 包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。－20℃储存，避免多次反复冻融。 (3)MDCK细胞和细胞培养试剂 1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞） 2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌 500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基） 5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素） 5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔） 25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清 3)胰酶 / EDTA (4)其它
1)平底96孔微量培养板 2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM 66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA） 5毫升 100×抗生素 3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升） 4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存 400毫升丙酮 100毫升 PBS，PH 7.2 2、ELISA实验材料 (1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体 (2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20 4升 PBS，PH 7.2 2毫升 TWEEN－20 (4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20 867毫升PBS，PH 7.2 132毫升牛血清白蛋白 1毫升TWEEN－20
BSL-2ABSL-2生物安全实验室病毒实验室-培训知识点说课讲解
BSL-2/ABSL-2生物安全实验室/病毒实验室培训知识点 基本要求BSL-2实验室培训 申请人具备3个月以上的细胞室工作经验；能够严格遵守本单位及实验室生物安全规程；既往无不良安全行为记录。 特别要求BSL-2+实验室培训 除满足基本要求外，还应具备以下条件：申请人参加过BSL-2实验室培训，并具备3个月以上BSL-2实验室工作经验。 特别要求ABSL-2实验室培训 除满足BSL-2+实验培训要求外，还应具备以下条件：已取得上海市实验动物上岗证；或参加过上海巴斯德研究所实验动物上岗培训并考试合格 生物安全 狭义指现代生物技术的研究、开发、应用以及转基因生物的跨国越境转移可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的不利影响。广义指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康及生态系统所产生的危害或潜在风险。 实验室生物安全 1防止发生病原体或毒素无意中暴露或意外释放的防护原则、技术和行为。 2实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区和环境受到不可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。 生物安全 防止发生病原体或毒素无意中暴露或意外释放的防护原则、技术和行为。 生物安全保障 单位和个人为防止病原体或毒素丢失、被窃、滥用、转移或有意释放而采取的安全措施。 实验室相关感染 实验室感染主要途径 注射器针头或其他污染锐器意外接种；液体溢洒和喷溅到皮肤和粘膜；通过口吸移液或用手指或污染的物体触摸口或眼睛从而摄入或接触；动物咬伤和抓伤；吸入传染性气溶胶； 20%可明确感染的原因；80%是由工作人员操作失误引起；20%是由设备故障引起；80%是不明原因的感染，可能为气溶胶传播感染。 实施实验室生物安全管理的目的 保护人员和环境免受感染性生物因子的潜在暴露 实验室生物安全管理体系目标 保证实验室设施、设备、个体防护装备及相关物品符合国家有关的安全要求，定期检查、维护、更新，确保不降低其设计性能。保证实验工作人员均可得到持续培训及继续教育。提供必要的免疫计划、定期健康检查和医疗保障。 管理体系文件 管理手册，程序文件，标准操作规程、安全手册，记录、标识
常见实验室有毒物质
·乙酸(浓)必须非常小心地操作。可能由于吸入或皮肤吸收而受到伤害。要戴合适的手套和护目镜。在化学通风橱里使用。 ·乙腈是非常易挥发和特别易燃的，它是一种刺激物和化学窒息剂，可因吸入、咽下或皮肤吸收而发挥其效应。严重中毒的病人可按氰化物中毒方式处理。操作时要戴合适的手套和安全眼镜。只能在通风橱里使用，远离热、火花和明火。 ·丙烯酰胺(未聚合的)是一种强的神经毒剂并可通过皮肤吸收(其效应是累加的)。避免吸入粉末。当称量粉末状的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时，要戴合适的手套和防护面具，在通风橱里操作。人们认为多聚丙烯酰胺是无毒的，但亦应小心操作，因为可能含有少量未聚合的丙烯酰胺。 ·放线菌素D是一种致畸剂和致癌剂。其毒性很大，如果吸入、咽下或通过皮肤吸收可能是致命的。这也可能引起异常过敏。避免吸入其粉末。戴合适的手套和安全眼镜，操作应在通风橱里进行。放线菌素D的溶液对光敏感。 ·AgN03参见硝酸银。 ·alpha-鹅膏蕈毒环肽具有强的毒性，因吸入、咽下或皮肤吸收，可能是致命的。其症状可能是延迟6～24h后才出现。操作时要戴合适的手套和安全眼镜并在通风橱中使用。 ·氨基苯甲酸可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时要带合适的手套和安全眼镜。 ·乙酸铵(H3CCOONH4)可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到伤害。操作时要戴合适的手套和安全眼镜并在通风橱里进行。 ·氯化铵(NH4Cl)可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时要戴合适的手套和安全眼镜并在通风橱里进行。 ·甲酸铵参见甲酸。 ·氢氧化铵(NH4OH)是氨的水溶液，是腐蚀剂。操作时应极为谨慎。氨会从溶液中散发出来，它是腐蚀性的和有毒的，并易引起爆炸。操作时戴合适的手套并只能在通风橱里进行。 ·钼酸铵[(NH4)6MO7O24·4H2]可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴合适的手套和安全眼镜并在通风橱里进行。 ·过硫酸铵[(NH4)2S2O8]对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命。操作时戴合适的手套、安全眼镜和防护服。始终在通风橱里操作，操作完后彻底洗手。 ·硫酸胺[(NH4)2SO4]可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到伤害。戴合适的手套和安全眼镜。在化学通风橱里使用。 ·氨苄青霉素可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴合适的手套和安全眼镜，并在化学通风橱中进行。 ·抑酶肽(Aprotinin)可能因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。它可能引起变态反应。暴露可能引起肠胃反应、肌肉疼痛、血压改变或支气管痉挛。操作时戴合适的手套和安全眼镜。切勿吸入其粉末，在化学通风橱内操作。 ·弧光灯非常易爆。按制造厂商的说明使用。当开弧光灯时，确实要关掉邻近的计算机以避免电磁波的损害。弧光灯一旦在运行中，计算机可能会重新起动。
诺如病毒实验室检测
诺如病毒实验室检测 诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。 诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。 诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。 一、标本采集注意事项： 粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。一次流行，至少采集10例患者粪便，每份标本量约1～5ml，成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置4℃可存放2～3周，运送也要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NV意义重要。需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L)浓集病毒后检测。
禽流感
人感染高致病性禽流感 （一）单项选择题 1、人感染高致病性禽流感是我国《传染病防治法》规定管理的哪类传染病之一？发生流行时，应按照哪类传染病的预防控制措施要求严格管理：（B ） A、属于甲类，按甲类管理 B、属于乙类，按甲类管理 C、属于乙类，按乙类管理 D、属于丙类，按乙类管理 2、下列哪型禽流感病毒感染的临床表现较重：（A ） A、H5N1 B、H9N2 C、H7N7 D、H1N1 3、下列哪项是人类禽流感病最常见的并发症：（ A ） A、肺炎 B、急性呼吸窘迫综合征 C、肺出血 D、Reye综合征 4、流感病毒属正粘病毒科，分为几个型别：（C ） A、只有1型 B、分为甲、乙两型 C、分为甲、乙、丙三型 D、若干型 5、人感染高致病性禽流感血象淋巴细胞改变的特点是：（B ） A、淋巴细胞升高 B、淋巴细胞降低 C、淋巴细胞正常 D、异型淋巴细胞明显增多 6、与人流感病毒相比，下面哪项不是一禽流感病毒的特点：（D ） A、对环境抵抗力较强 B、在自然界抗原性较稳定 C、毒株呈多样性 D、变异速度快 7、下列哪种亚型的甲型流感病毒不是以往人间流行的流感病毒。（D ） A、H1N1 B、H2N2 C、H3N2
D、H5N 1 8、下列哪项不属于人感染高致病性禽流感的传播途径：（A ） A、经血液传播 B、直接密切接触传播 C、空气飞沫传播 D、粪一饮水一口传播 9、人感染高致病性禽流感的流行病学史中下列哪项最重要：（ B ） A、病前1周曾接触过禽类 B、病前1周曾有到过高致病性禽流感疫区的历史，有与禽类等动物的接触史 C、病前I周曾接触过感冒病人 D、病前1周曾吃过鸡 10、人感染高致病性禽流感的季节多为：（B ） A、四季散发，无季节性 B、四季散发，冬春季多见 C、四季散发，夏季多见 D、有严格的季节性，只见于冬春季 11、下列哪种药物属于口服的神经氨酸酶抑制剂类抗流感病毒药物：（ D ） A、金刚烷胺 B、金刚乙胺 C、利巴韦林 D、奥司他韦 12、对人感染高致病性禽流感的抗病毒治疗下列哪项说法是错误的：（D ） A、发病48小时内应用 B、抗病毒药可减轻病情 C、抗病毒药可缩短病程 D、对有合并症者疗效较好，尤其是全身性感染者 13、人感染高致病性禽流感的检疫期为：（A ） A、7天 B、14天 C、21天 D、28天 14、对人感染高致病性禽流感患者的密切接触者的处理为：（D ） A、严密隔离至21天 B、一般隔离至21天 C、注射疫苗 D、可服用抗病毒药物预防 15、一例来自越南禽流感疫区的患者出现发热、头痛等流感样症状，且患者呼吸道分泌物标本检测呈流感病毒核酸阳性，临床诊断应考虑为人感染高致病性禽流感的下列哪一类：（ B ）
禽流感基础知识
禽流感基础知识 1、什么是禽流感？ 答：禽流感主要是指禽类动物中流行的由流感病毒引起的感染性疾病。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感。高致病性禽流感发病率和死亡率均高，被世界动物卫生组织列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疾病。 2、什么是H7N9禽流感病毒？ 答：流感病毒可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1―16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1―9种亚型，理论上HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成多达144种不同的流感病毒。目前已经确认感染人的禽流感病毒有135种。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9亚型流感病毒既往仅在禽间发现，在荷兰、日本及美国等地曾发生过禽间暴发疫情，但未发现过人的感染情况。此次上海市、安徽省、江苏省和浙江省等地区发现的相关病例感染的H7N9流感病毒从病毒生物学上属于禽流感病毒。 3、人感染禽流感后常见的临床表现是什么？H7N9禽流感感染病例的临床表现有何不同？ 答：人感染禽流感后潜伏期一般为7天以内。早期症状与普通流感非常相似，主要表现为发热、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，部分患者可有恶心、腹痛、腹泻等消化道症状，少数患者可见眼结膜炎。大多数患者病程短、恢复快、愈后良好且不留后遗症，但少数患者特别是年龄较大、治疗不及时的患者病情会迅速发展成进行性肺炎、急性呼吸窘迫综合征，如不及时治疗，会导致死亡。 目前确诊的H7N9禽流感感染病例主要表现为典型的病毒性肺炎，起病急，病程早期均有高热（38℃以上）、咳嗽等呼吸道感染症状。起病5―7天出现呼吸困难，重症肺炎并进行性加重，部分病例可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征并死亡。 目前对该疾病临床特征的认识还很有限，该病毒感染能否引起轻型病例或其他临床表现尚不清楚。随着更多的病例信息的积累，对该疾病的认识将会发生变化。 4、人禽流感病毒传染源是什么？本次人感染H7N9禽流感的病例的感染来源是否有不同？ 答：人感染禽流感病毒的主要途径是接触病禽，即病禽的分泌物或排泄物通过空气飞沫经呼吸道传播于人。 此次人感染的H7N9流感病毒从病毒生物学上属于禽源流感病毒，既往国际上所发现的人感染H7亚型的流感病毒也多来自于禽类，但截至目前，确诊病例的具体感染来源尚不清楚。 5、人禽流感病毒的抵抗力如何？
病毒分离前样品的实验室处理方法
病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。 (一) 组织器官样品的处理 1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机 制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液； 2.加入复合抗生素； 3.以800×g离心15min； 4.取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。 (二) 粪便样品的处理 1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液； 2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球； 3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心； 4.用450nm的微孔滤膜过滤； 5.加二倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。 (三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品可不做处理，直接用于病毒分离。 注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。 (四) 样品的特殊除菌处理样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。 1.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA
病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。取用下层水相分离病毒。 2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响， 常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。 3. 过滤除菌可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素 酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。 4. 离心除菌用低温高速离心机以1800r/min（1 5.24cm）离心20min，可沉淀除 去细菌，而病毒（小于100nm）保持在清液中。必要时转移离心管重复离心一次。 (五) 待检样品中病毒的浓缩对病毒含量很少的病毒样品一般普通方法不易检测或分离出 病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下： 1.聚乙二醇（PEG）浓缩法将分子量6 000的PEG逐步加入经一般处理的样品 溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000×g离心15min，用少量含复合抗生素的Hank’s 平衡盐溶液重悬，心要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。 2.硫酸铵浓缩法将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液 中边加边搅拌，置4C过夜。离心同上。 3.超滤器浓缩法是一种高效率的浓缩法，特别适合大体积的样品浓缩。 4.超速离心浓缩法以40 000r/min（1 5.24cm）离心60-120min ,绝大多数病毒将沉 于管底。用少量Hank’s平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高，但仅适用于小体积的样品。 (六) 病毒分离样品脂类物质的去除有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很 高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是将预冷的等量有机溶剂对半加入样品中，强烈振荡后，1000×g离心5 min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。
人感染H7N9禽流感治疗方案
人感染H7N9禽流感诊疗方案人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。 一、病原学 禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。 禽流感病毒普遍对热敏感，对低温抵抗力较强，65℃加热30分钟或煮沸（100℃）2分钟以上可灭活。病毒在较低温度粪便中可存活1周，在4℃水中可存活1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0的条件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上。 二、流行病学 （一）传染源。目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。 （二）传播途径。经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。 （三）易感人群。目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。 （四）高危人群。现阶段主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前1周内接触过禽类者。 三、临床表现 根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。 （一） 一般表现。
一 禽流感的易感动物有哪些
一禽流感的易感动物有哪些？ 对某种传染病具有感染性的动物称为易感动物。 1 日常生活中常见的禽类如鸡、火鸡、鸭、鹅、及其他水禽等最为敏感且多为隐性感染； 2 其他禽类如雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、孔雀、鹌鹑、鸽也较容易感染。 3 水禽与旱禽同场混养可造成交叉感染，病毒很容易在大规模饲养的鸡群或鸭群中 传播。 4 野生与养殖水禽可通过使用共同水体传播。 5 除了感染禽类，禽流感还可以感染猪。 二禽流感病毒通过什么途径传播给人类？ 人类感染禽流感病毒的途径主要是接触感染。 1 禽流感病毒可通过消化道和呼吸道进入人体传染给人。
2 直接接触带有相当数量病毒的物品，如家禽的粪便、羽毛、呼吸道分泌物、血液等，也可经过眼结膜和破损皮肤引起感染。 3 禽肉煮熟煮透后，病毒可被杀死，如果未经煮熟煮透食用，病毒就可能进入人体。所以如果食用未经检疫或来自疫情暴发区的家禽，则不排除染病风险。 4 买活鸡回家时，如果是健康活鸡基本是安全的，但如果是病鸡就有危险。 少量染病的家禽能幸存下来，但它们至少在10天之内还会排泄含病毒的粪便。另外，鸡的翅膀有可能藏有禽流感病毒，所以，鸡翅膀扑打时可能会造成病毒释放。 三人与人之间会传播禽流感吗？ 1 目前只发现经家禽传染给人的病例，还没有发现人与人之间传染的案例。也就是说，人和人之间还没有证据证明是可以互相传染的。 2 不过，从理论上说，如果病毒变种，就可能出现人与人之间的传播。 四个人如何预防禽流感？
由于没有相应疫苗，而春季又是急性呼吸道疾病的高发期， 因此，健康的生活方式对预防疾病非常重要。平时应加强体育锻炼， 避免过度劳累，不吸烟。 1 避免去暴发禽流感的地区。 2 发现禽流感疫情时，应尽量避免与禽类接触，接触禽畜后切记要用洗手液及清水彻底 洗净双手。 3 对鸡肉等食物应彻底煮熟。 4 保持室内空气流通，尽量少去空气不流通场所。 5 注意个人卫生，打喷嚏或咳嗽时应掩住口鼻。 6 保持室内清洁，使用可清洗的地垫，避免使用难以清理的地毯。
寨卡病毒实验室检测技术方案
寨卡病毒实验室检测技术 方案 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
附件1 寨卡病毒实验室检测技术方案 寨卡病毒(ZikaVirus)属黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），呈球形，直径约为40-70nm，有包膜。基因组为单股正链RNA，长度约为10.8Kb，可分为亚洲型和非洲型两个基因型。 寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。 一、检测对象 （一）疑似和临床诊断病例。 （二）伊蚊成蚊和幼虫。 二、样本采集、保存和运输 （一）病例标本采集。 对怀疑感染寨卡病毒的患者，推荐采集血清标本开展检测。 用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血5mL，及时分离血清，分装2管，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1管用于现场实验室检测，1管用于上级疾病预防控制机构复核。 对病例应尽可能采集双份血液标本，两份标本之间相隔14天为宜，住院病例可于入院当天和出院前1天各采集一份。 （二）蚊媒标本采集。 疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送。 如标本能够在24小时内开展实验室检测，应将标本置于2-8℃保存；如能在7天内开展检测，应将样本置于-20℃保存；如需保存7天以上，应将样本置于-70℃以下。 标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家关于三类病原体的相关生物安全规定。 三、检测方法 寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。 开展蚊媒寨卡病毒检测时，对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测。 开展寨卡病毒实验室检测时，应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。 （一）临床标本检测。 1．病原学检测 病原学检测主要适用于急性期血液标本，一般认为发病7天内检测阳性率高。 （1）核酸检测：采用荧光定量RT-PCR方法，是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。 （2）病毒分离：将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。 2．血清学检测
禽流感
禽流感 基本简介 禽流感（Bird Flu或Avian Influenza）是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33%。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车辆往来是传播本病的重要途径。 发展历程 1900年代早期，禽流感在意大利被首次确认。1960年1000多只普通燕鸥在南非死亡，这是第一次发现禽流感引发的高死亡率案例，属于H5N3型。 根据联合国环境规划署迁徙物种公约工作组公布的技术文件指出，H5N1亚型禽流感的源头来自集中饲养的家禽，极端的饲养环境造成病毒的变异，鸟类贸易、滥用疫苗、运输等人类活动也对禽流感病毒的变异有着推动的作用。野外研究显示，绝大多数罹患禽流感的野生鸟类，都是在迁徙、越冬和繁殖过程中与人类饲养的家禽有近距离接触的物种，而那些自始至终远离人类社会的野生鸟类，即便是水鸟，并且保持很高的种群密度，至今仍未有禽流感爆发的报告。 源自饲养场的病毒感染野生鸟类，尤其是水鸟，这使得病毒随着鸟类迁徙而发生扩散。2003年末到2004年初在东亚爆发的禽流感被认为验证了候鸟传播病毒的假设：疫症先在韩国南部，候鸟的中途站出现，然后途经香港，最后到达越南。由于香港相对卫生环境较好，以及先前已具有对付疫症的经验，病症并未有在当地造成大规模爆发。但卫生环境相对较差的越南，不单使禽鸟死亡，还对人类造成影响。至2004年1月底已有接近20人死亡。然而鸟类学者则指出，根据西伯利亚－东亚－澳大利亚鸟类迁徙通道的规律，早在每年的11月末到12月初候鸟就已经基本完成从北向南的迁徙，此前在香港进行的无线电定位跟踪研究也显示，在仲冬季节几乎没有鸟类迁飞的活动。另据观测，绝大部分水鸟的越冬地位于北纬20度以北地区，只有白眉鸭和针尾鸭会迁至越南，然而其过境时间却在12月初。鸟类学者普遍认为从时间和空间上，2003年底爆发的禽流感与候鸟迁徙并无重叠，故此大部分鸟类学者并不认同候鸟传播病毒的说法。
寨卡病毒实验室检测技术方案
寨卡病毒实验室检测技 术方案 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
附件1 寨卡病毒实验室检测技术方案 寨卡病毒(ZikaVirus)属黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），呈球形，直径约为40-70nm，有包膜。基因组为单股正链RNA，长度约为10.8Kb，可分为亚洲型和非洲型两个基因型。 寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。 一、检测对象 （一）疑似和临床诊断病例。 （二）伊蚊成蚊和幼虫。 二、样本采集、保存和运输 （一）病例标本采集。 对怀疑感染寨卡病毒的患者，推荐采集血清标本开展检测。 用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血5mL，及时分离血清，分装2管，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1管用于现场实验室检测，1管用于上级疾病预防控制机构复核。 对病例应尽可能采集双份血液标本，两份标本之间相隔14天为宜，住院病例可于入院当天和出院前1天各采集一份。 （二）蚊媒标本采集。 疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送。 如标本能够在24小时内开展实验室检测，应将标本置于2-8℃保存；如能在7天内开展检测，应将样本置于-20℃保存；如需保存7天以上，应将样本置于-70℃以下。 标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家关于三类病原体的相关生物安全规定。 三、检测方法 寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。 开展蚊媒寨卡病毒检测时，对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测。 开展寨卡病毒实验室检测时，应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。 （一）临床标本检测。 1．病原学检测 病原学检测主要适用于急性期血液标本，一般认为发病7天内检测阳性率高。 （1）核酸检测：采用荧光定量RT-PCR方法，是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。 （2）病毒分离：将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。 2．血清学检测
“禽流感病毒”阅读答案
“禽流感病毒”阅读答案 阅读下面的文字，完成14—17题（13分） ①今天，我国又增加了4例确诊的H7N9禽流感病毒的病例，这使我国的人感染H7N9禽流感病毒病例已经增加到11例，涉及了上海、安徽、江苏、浙江4个省市。人们不禁要问：禽流感怎么了？为什么这几年总要不断地闯入人间，导致人类疾病？ ②禽流感病毒不断闯入人间与生态环境、病毒变异等多种因素有关。 ③在生态环境方面，首先是禽流感暴发的次数越来越多。近几十年来，全球的生态环境有了很大的变化。禽流感病毒原本在禽类动物（特别是野生水鸭和野生禽类）中流行。而近十几年来，禽流感病毒在饲养家禽中暴发流行的情况越来越多。自从1959年有高致病性禽流感病毒禽类暴发记录以来，前20年仅有4次高致病性禽流感流行的记录，后来的20年有13次，最近的7年发生了7次。禽流感在家禽中暴发的次数越多，病毒越容易跨越物种闯入人间。禽流感暴发增多的原因有人认为与家禽产业的飞速增长有关。 ④病毒感染人类或动物，首先要和被感染细胞表现上的一种蛋白质结合，才能钻入细胞内导致细胞感染。这种能和病毒结合的蛋白质被称为“受体”。流感病毒的红细胞血凝素是专门负责与感染细胞上的受体结合的。因此，人们称其为病毒感染的“开路先锋”或打开细胞之门的“钥匙”。人类与禽类细胞上的受体差别是很大。所以，流感病毒家族的成员各自有各自的“领地”。一般来说，禽流感病毒不会轻而易举地直接感染人类，或在人类中引起疾病的传播和流行。 ⑤但是，流感病毒是一种能在多物种中流行的病毒，尤其禽流感病毒，尽管它们常常不能直接感染人类，但有些哺乳动物呼吸道上皮细胞存在与禽流感病毒结合的受体，因此它们有时可以感染哺乳动物，借助一些哺乳动物为“跳板”，逐渐进化成可以感染人类的病毒。例如：它可以先感染猪、猴子等哺乳动物，使自己逐渐适应哺乳动物体内的环境，再经过“二次跨越”感染人类，有逐渐“学”会感染人的本领。 ⑥流感病毒又是一种非常容易变异的病毒。不仅在病毒复制的过程中常常发生复制错误，而且容易插入或被插入其他流感病毒的基因。有时，禽流感病毒和人流感病毒也会同时感染猪或其他哺乳动物。猪或其他哺乳动物就可能成为两种流感病毒的“混合器”，在猪体内发生基因重配，禽流感病毒“嫁接”给人流感病毒，成为一种能够感染人类的新流感病毒。 ⑦禽流感病毒的物种间差距逐渐缩小。最近，许多科学家发现，禽流感病毒越来越容易感染人类了。首先，有科学家发现，人肺和呼吸道上皮细胞也携带有禽流感样病毒的受体，所以，禽流感病毒有可能直接感染人类。后来，又有人发现，人流感病毒能与鸡的上皮细胞结合，而且还在鸡的肺组织中发现了人流感样病毒。如果如此，禽流感病毒似乎有可能不借助其它动物，直接在鸡的体内和人流感病毒“嫁接”了。最近科学家发现，某些以前主要感染鸡肠道的禽流感病毒逐渐从鸡的肠道上皮向呼吸道上皮转移，而鸡的呼吸道中的温度与人呼吸道的温度比较接近，这可能使禽流感病毒发生人类环境的“预先适应”，为逐渐进化成流感病毒做好了充分的准备。 ⑧人类为了生存在不断地改造世界，病毒为了生存也在不断地发生变异。尽