RNA提取标准流程图

RNA提取标准流程

原理：

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。

预防RNase污染注意事项：

1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3．RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。

4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）

RNA的提取

准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer （宝生物工程（），货号：D603，35元，1mL×5支）

准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppe ndorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。

操作步骤:

1. 研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50～100 mg组织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录；均一组

织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50～100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。

2．将匀浆样品在室温（15～30oC）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。

可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于2～8℃ 10000 × g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。

3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3 min。（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC 法）

4. 4oC 10000 × g离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（即1mL最多600μl，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层）

5. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。

a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。

b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。

6. 4oC 10000 × g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。

8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol 至少加1 mL 75%乙醇。4℃不超过7500×g离心5 min，弃上清。

9.室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾5～

10 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5 μg/μL，但不影响溶解，浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情

况），使之充分溶解（可选择4℃放置1 h以上或55～65oC水浴10 min），之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。RNA应尽快转移至-70oC保存。也可用100%的去离子甲酰胺溶解（用于northern的RNA 可这样保存于-20oC）。

补充说明：

1. 从少量样品（1～10 mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许线性丙烯酰胺等助沉剂以促进RNA沉淀。操作示例：加800 μL TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加浓度为5 mg/mL的线性丙烯酰胺2～3μL RNase-free线性丙烯酰胺溶液。它在使用时最终工作浓度应该为10～20 μg/mL。线性丙烯酰胺会与R NA一同沉淀出来，线性丙烯酰胺浓度不高于5 μg/μL不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。线性丙烯酰胺制备方法见附录1。

2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70oC保存至少一个月。

3.若提取的组织源性RNAase含量较高（如胰腺），可将全部过程置于冰上操作，同时适当延长放置时间。

预期产量：

1 mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6～10 μg，肾3～4 μg，骨骼肌和脑组织1～1.5 μg，胎盘1～4 μg，

上皮细胞8～15 μg，成纤维细胞5～7 μg。

RNA的质量控制：

1.使用nanodrop测量RNA吸光值时的几点说明：

图一、RNA 紫外吸收光谱1.RNA的吸收峰应在260nm，左偏峰少见，右

偏峰提示可能有酚污染。

2.对于RNA纯品：A260/A280=1.81 (溶于水)；

A260/A280=2.04 (溶于TE：10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH=8.0)；A260/A230>2。

3.nanodrop使用0.2mm光径，但默认显示的

是换算后的1cm光径吸光值，并非其精度能

够检测3以上的吸光值（2%以下的透光率）。

4.对于ND-1000（本实验室机器型号），其RNA

检出限为2-3000ng/μL，大于3000ng/μL需

要稀释后再测。

2.PCR验证基因组DNA污染：

使用RNA作为模板，使用不跨含子的引物采用进行普通PCR反应，若可以扩增出条带，则说明存在DNA污染。

注：验证时，必须有阴性和阳性对照，阴性对照的模板为DEPC水，阳性对照的模板为cDNA。

3.RNA甲醛变性胶验证质量：

变性胶做法（每100 mL）：72 mL水，1.4 g Agarose (1.4%，胶浓度可调)，加热煮沸，待冷却到约60oC时，加入10 mL 10×MOPS （配制方法见附录1），18 mL 甲醛溶液（37%，pH > 4.0），混匀（避免产生气泡）倒入胶槽，冷却2 h后使用。（放置过长时间会导致甲醛挥发，影响电泳结果）

样品处理方法：将RNA稀释到1 μg/μL，取4.4 μL（可减少点样RNA量，但需要保证体积），加2 μL的10×MOPS，3.6 μL的甲醛，10 μL的去离子甲酰胺，共20 μL，混匀之后将样品置于65oC水浴变性15 min，迅速置于冰上冷却。之后加入2 μL10×loadin g buffer，0.1 μL EB（10 mg/mL），混匀后即可点样。

电泳：5 V/cm电压，电泳约40 min后（或指示剂到胶的2/3处）照相。

注: 若成像结果不佳，可选择EB后染，即不将EB混入样品中，在电泳完成后，使用1 μg/mL（储存液稀释10000倍即可）的EB染胶15 min，清水脱色15 mi n或更长时间，图像对比度会更高，且不会出现反向的EB亮斑。

电泳结果分析：好的RNA电泳图可见28S和18S的清晰图像，且亮度呈2倍的关系。

图四、RNA电泳示例图，2%的

变性胶，对比度经过调整美化

常见问题分析：

得率低：

A．样品裂解或匀浆处理不彻底

B．RNA沉淀未完全溶解

A260/A280<1.65 ：

A．检测吸光度时，RNA样品没有溶于TE，而溶于了水中，低离子浓度和低p H值条件下A280值偏高，水中1.5～1.8的比值都可能是质量较好的RNA B．样品匀浆时加的试剂量太少（造成蛋白未分离完全）

C．匀浆样品时未在室温放置5 min

D．吸取水相时混入了有机相

E．RNA沉淀未完全溶解

RNA降解：

A．组织取出后没有马上处理或冷冻

B．待提取RNA的样品没有保存于-60至-70oC，而保存在了-5至-20℃

C．细胞在用胰酶处理时过度

D．溶液或离心管未经RNase去除处理

E．电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

DNA污染:

A．样品匀浆时加的试剂量太少

B．样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲体系或碱性溶液

附录Ⅰ

一、线性丙烯酰胺制备方法

1.配5%的丙烯酰胺（acrylamide）溶液：

A．配制buffer 100 mL（40 mM Tris-HCl （pH= 8），20 mM 醋酸钠, 1 mM EDTA）：称取2.72 g无水醋酸钠，溶于50 mL DEPC水中，向其中加入

1 M Tris-Cl （pH=8.0）4 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.

2 mL，加入盐酸

调节pH至8.0，再加DEPC水至100 mL。

B．称取5 g 丙烯酰胺，加入100 mL buffer中，高压灭菌后分装至高压过的

1.5 mL管中，每管0.2 mL。

2.加过硫酸铵（AP）到终浓度为0.1 %（w/v）：

A．配制10 % AP储存液（w/v）：称取0.1 g AP，溶解于1 mL DEPC水中。

B．向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2 μL 10 % AP。

3.加TEMED到终浓度为1/1000（v/v），即向每管中加入0.2 μL TEMED，室

温聚合30min。

4.待溶液变粘稠，向管中加入2.5倍体积（500 μL）的乙醇沉淀聚合物，-20℃沉

淀30 min以上。

5.12000×g离心5 min，沉淀即为线性的丙烯酰胺，每管加入1mL 1×TE buffer

溶解（溶解时间较长，可4 ℃过夜），即得到终浓度为10 mg/mL的线性的丙烯酰胺1 mL。封口膜密封保存于-20 ℃，可保存2年。

1×TE buffer（10 mM Tris-Cl，pH=8.0；1 mM EDTA）配制方法：加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）1 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL ，加入DEPC水至100 mL，高压灭菌备用。

6.使用时先加10～20 μg（就是1～2 μL）到核酸（RNA、DNA均可）溶液中，

之后再加相应的盐溶液和异丙醇进行沉淀。对于20 nt以上的片段，号称可以无损回收pg级的核酸。

二、10×MOPS （0.2 M MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸），50 mM NaAc，10 mM EDTA）配制：

先用800 mL DEPC水溶解41.2 g MOPS和6.8 g NaAc?3H2O后，用10M NaOH（约7.2 mL）调溶液pH值至7.0，加入20 mL 0.5mol/L EDTA，定容至1000 mL。用0.22 mm滤器过滤除菌，装入棕色瓶中，室温避光保存。

三、EB（10mg/mL）配制：

称取0.2 g EB溶解于20 mL双蒸水中，充分混匀，装入棕色瓶中，于4oC冰箱避光保存。