凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）
一、凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理
不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理
凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各
种分子流体力学提及的不同进行分离的。比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。（见图2）
图2 GPC淋出曲线
溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）
凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数
值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线
?排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。
?渗透极限
能够完全进入凝胶颗粒空穴的最大分子的分子量。在选择固定相时，应使欲分离样品离子的相对分子量落在股东相的渗透极限和排阻极限之间。
四、GPC仪器配置
GPC仪的组成：
泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集系统（见图4）。
图4 GPC仪器配置
?泵系统
包括一个溶液存储器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。
?色谱柱
按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列；按照样品分子量范围来选择柱子型号。此外，载体是GPC产生分离作用的关键，因此对载体有如下要求：
1、良好的化学稳定性和热稳定性；
2、有一定的机械强度；
3、不易变形；
4、流动阻力小；
5、对试样没有吸附作用；
6、分离范围越大越好（取决于孔径分布）等；
7、载体的粒度愈小，愈均匀，堆积得愈紧密，色谱柱分离效率愈高。
GPC载体的种类：交联聚苯乙烯凝胶；多孔性玻璃；半硬质及软质填料（包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶）；木质素凝胶等。
?检测系统
通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检测。有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器和粘度检测器。
五、实验方法及注意事项
实验方法：
1、直接法
?把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量。
?把GPC仪与光散射仪连用，由光散射仪连续测定聚合物样品中各个级分的相对分子质量，由GPC 仪中的浓度示差检测器检测各个级分的浓度，就可以得到聚合物的各种平均相对分子质量。
2、间接法
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。在相同的测试条间下，做一系列的GPC标准图谱，对应不同相对分子质量样品的保留时间，以LogM对t作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。
注意事项：
?由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配制得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生“超载”现象。
?一般情况下，进样浓度按照分子质量大小的不同在
0.05~0.5%（质量分数）范围内配制。分子质量越大，溶
液浓度越低。
?标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超声或者剧烈振荡来加速溶解。
?溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。