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大麦根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效果研究

华北农学报·2016，

31（增刊）：252-257收稿日期：2016－09－26

基金项目：山东省科技重大专项（新兴产业）（2015ZDXX0502B02）

作者简介：邢芳芳（1982－），

女，山东临沂人，工程师，硕士，主要从事新型肥料研发及其施肥研究。通讯作者：李新柱（1975－），男，山东济宁人，工程师，博士，主要从事新型肥料研发及其施肥研究。

大麦根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效果研究

邢芳芳，高明夫，禚优优，胡兆平，李新柱

（金正大生态工程集团股份有限公司，农业部植物营养与新型肥料创制重点实验室，国家缓控释肥工程技术研究中心，山东临沂276700）

摘要：为得到高效溶磷、促生菌株，对大麦根际土壤的溶磷细菌进行筛选，将筛选得到的高效解磷菌PSM 进行分子生物学鉴定，并进行溶磷性能及促生效果研究，为解磷微生物肥料的研发提供依据。结果表明，通过16S rDNA 序列分析鉴定表明菌株PSM 为枯草芽孢杆菌，

35?在以Ca 3（PO 4）2为唯一磷源的无机磷液体培养基中培养6d 水溶磷含量达到449．1mg /L 。盆栽试验表明PSM 解磷菌对小白菜的促生作用明显，显著提高小白菜的叶绿素、生物产量和

叶片数，以添加5．0?108

cfu /g PSM 解磷菌剂的处理增产效果最好，鲜质量、干质量与单施复合肥处理（CK1）相比差

异极显著，鲜质量增幅达到16．72%，干质量增幅达到18．68%，与单施草炭载体的处理（CK2）相比，施加菌剂的T4处理鲜质量增幅达到11．77%，干质量增幅达到11．70%，有明显的促生作用。

关键词：溶磷细菌；筛选鉴定；枯草芽孢杆菌；促生中图分类号：Q939．96

文献标识码：A

文章编号：1000－7091（2016）增刊－0252－06

doi ：10．7668/hbnxb．2016．S1．042

Screening and Identification of Phosphate Solubilizing Bacteria in Hordeum

vulgare Ｒhizosphere and Its Growth Promoting Effect

XING Fangfang ，GAO Mingfu ，ZHUO Youyou ，HU Zhaoping ，LI Xinzhu

（Kingenta Ecological Engineering Group Co．，Ltd．，Key Laboratory of Plant Nutrition and New Fertilizer Ｒ＆D ，Ministry of Agriculture P．Ｒ．China ，National Engineering Technology

Ｒesearch Center for CＲF ，Linyi 276700，China ）

Abstract ：In order to obtain efficient dissolving phosphorus and growth-promoting Bacteria of Hordeum vulgare rhizosphere ，we took study on screening ，P-dissolving characteristics ，growth promoting effect and identified by se-quence analysis of 16S rDNA of strain PSM ，which provided the basis for the development of solubilizing microbial fertilizer．The sequence analysis of 16S rDNA results showed that PSM was Bacillus subtilis ，which had strong ability of degradation of inorganic phosphorus effect．After 6days fermentation at a temperature of 35degrees in the medi-um with Ca 3（PO 4）2as the sole phosphorus source ，soluble phosphorus content reached to 449．1mg /L．PSM had obvious effect on promoting growth of Brassica campestris L．，the adding of 5．0?108cfu /g PSM had the best effect on increasing the biological yield and number of leaves significantly．Compared with the single application of com-pound fertilizer （CK1），fresh weight and dry weight was increased by 16．72%and 18．68%respectively．Com-pared with the single application of peat carrier （CK2），fresh weight and dry weight was increased by 11．77%and 11．70%respectively．PSM showed evident promoting effect on plant．

Key words ：Phosphorus dissolving Bacteria ；Screening and identification ；Bacillus subtilis ；Growth promoting effect

我国磷矿资源总储量丰富，总量有167．86亿t ，

但是其中能够被开采利用的储量非常少，仅占总储

量的八分之一左右。中国磷矿石的开采量中70%

用于生产含磷化肥，而且开发利用强度在逐年加大，

增刊邢芳芳等：大麦根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效果研究

253

加之资源的不合理利用使得国内磷矿资源加速衰竭［1－2］。长期以来，由于化学肥料的不合理利用带来一系列的土壤问题，造成土壤中可以被直接利用的磷素逐年减少。在中国北方地区，石灰性土壤全磷含量较高，南方地区酸性土壤全磷和有效磷含量均很低，大多磷素处于被固定状态，难以满足作物生长发育的需要。如何提高磷的有效性，将不能被作物直接利用的磷素转化为可以直接利用的形式是研究者一直关注的问题。据报道，施用化学肥料时与有机肥料混合使用可以提高磷的利用效率，主要是借助有机组分对土壤中氧化物的包被及有机物的分解作用，减少磷的化学固定，从而提高了磷的有效性及吸收利用效率［3－4］。微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，其微生物种类及数量对土壤磷的转化和有效性有很大的影响，施用溶磷菌可以提高难溶态磷的有效性。

土壤中存在大量的溶磷微生物，如青霉菌、黑曲霉、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，能够通过产生有机酸等代谢产物将土壤中被固定的磷素转化为可以直接利用的形态，有的溶磷菌株还能够通过产生吲哚乙酸等根际促生物质促进作物生长［5－6］。目前，部分溶磷菌剂已经进行商品化生产，如巨大芽孢杆菌菌剂、硅酸盐菌剂，多数存在货架期短、菌种退化快、定殖能力差、功能不稳定等问题，国际上影响力较大的丹麦诺维信公司生产的Jumpstart 溶磷菌剂也尚未在国内得到广泛应用［7－8］。因此，研究功能稳定、货架期长的溶磷菌剂在农业生产中有着重要意义。

本研究通过对大麦根际解磷细菌进行筛选，并对溶磷能力最强的菌株PSM进行实验室溶磷性能研究以及液体发酵试验，通过盆栽试验研究该PSM 菌株对小白菜生长的影响，为解磷微生物肥料产品的开发提供优良菌株和基础数据。

1材料和方法

1．1土壤样品

使用土壤采样器对同一区域内生长情况良好、高产的大麦根际土壤进行多点取样，土壤深度范围为5 25cm，样品分装于灭菌袋中，记录采样时间、地点等信息。土样临时存放于国家缓控释肥工程技术研究中心，4?冰箱待用。

1．2培养基

营养琼脂培养基：分别称取牛肉膏5．0g，蛋白胨10．0g，NaCl5．0g，琼脂18．0g，加入蒸馏水1000mL，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7．0 7．2。于1?105Pa高压灭菌20min。

PSM菌株发酵培养基：玉米淀粉2g，黄豆饼粉3．0g，酵母粉0．55g、K

HPO

0．03g，MgSO

·7H

0．02g，CaCO

0．04g，ZnSO

0．02g，蒸馏水100m L，pH 值7．2，装于500mL三角烧瓶，1?105Pa灭菌30min。

无机磷固体培养基：分别称取葡萄糖10．0g，

（NH

）

0．5g，NaCl0．3g，KCl0．3g，MgSO

·7H

0．3g，FeSO

·7H

O0．03g，MnSO

·4H

O0．03g，

（PO

）

5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，用0．2mol/L的稀盐酸调节pH值至7．2，于120?高压灭菌15min。

无机磷液体培养基：分别称取葡萄糖10．0g，

（NH

）

0．5g，NaCl0．3g，KCl0．3g，MgSO

·7H

0．3g，FeSO

·7H

O0．03g，MnSO

·4H

O0．03g，

（PO

）

5g，蒸馏水1000mL，用0．2mol/L的稀盐酸调节pH值至7．2，分装于500mL玻璃三角烧瓶中，装液量为100mL/瓶，于120?高压灭菌15min。1．3小白菜盆栽试验

1．3．1试验时间、地点试验于2015年1－3月在金正大生态工程集团股份有限公司的智能玻璃温室中进行。

1．3．2试验材料供试作物为小白菜（Brassica campestris L．），本地种子站购得；供试底肥为金正大生态工程集团股份有限公司生产的复合肥（15-15-15），解磷菌剂为解磷菌发酵液用草炭土吸附、干燥制备而成，活菌数分别为0．1?108，1．0?108，3．0?108，5．0?108，1．0?109cfu/g；供试土壤为棕壤，有机质含量为13．2g/kg，全磷959mg/kg，速效磷

（P

）34．5mg/kg，0．96g/kg，速效钾（K

O）90mg/kg，pH值7．25。

1．4试验方法

1．4．1解磷菌的分离将无菌样品袋中各取样点的土壤样品混合均匀，称取10g于装有100mL无菌水的带玻璃珠的玻璃三角瓶中，于200r/min摇床条件下振荡30min，得到浓度为0．1g/mL的土壤悬液样品，对土壤悬液进行逐级稀释，分别吸取10－3，10－4，10－5，10－6倍稀释度的土壤悬液各0．1mL，每个梯度各3个重复，分别涂布于无机磷培养基平板上，置于37?恒温培养箱倒置培养。待培养3d后取出，挑选平板上菌落周围产生透明圈的菌落划线到营养琼脂平板上进行初步分离纯化。待出现单菌落后，将纯化好的各菌株分别接种到营养琼脂培养基斜面上，37?培养24h后，置于4?冰箱保藏备用［9］。

1．4．2解磷菌的解磷效果测定将冰箱保存的初筛解磷菌株进行活化，分别划线于营养琼脂培养基平

254华北农学报31卷

板，37?培养1d后点接于无机磷固体培养基平板

上，每菌重复3皿，35?倒置培养3d后取出，观察

解磷圈大小并测定解磷圈直径（D）和菌落直径

（d），计算D/d，根据（D/d）值大小来确定各初筛解

磷菌株的解磷能力［10］。

1．4．3无机磷液体培养基中解磷能力的测定根

据D/d值对初筛得到的溶磷菌株进行筛选，挑取

D/d值最大的菌株记为PSM，挑取PSM单菌落接种

于100mL无机磷液体培养基中，置于35?、200

r/min恒温振荡培养箱振荡培养，每隔1d定时取样

1次，每次1瓶，8000r/min离心机低温离心20min

后取上清液于4?冰箱保存待测，连续取样9d。将

各离心上清液用钼蓝比色法测定其中的可溶性磷的

含量，确定试验菌株PSM对难溶无机磷的分解情况

及发酵液中水溶磷的变化趋势［9－10］。

1．4．416S rDNA序列分析鉴定细菌16S rDNA

PCＲ扩增参考谢永丽等［11］的方法。通过上海生工

生物工程有限公司对PCＲ产物进行测序，将测得的

16S rDNA序列与NCBI数据库中的序列进行比对，

然后使用MEGA软件构建系统发育树。

1．4．5盆栽试验设计试验设5个处理、2个对照

（表1），每个处理4个重复，每盆装土5kg，空白组

为不施用解磷菌剂对照（CK1），另设单独施加草炭

土对照（CK2），处理组为添加不同菌量的菌剂，每盆

用量为0．5g。复合肥及菌剂等作为底肥一次性施

入土壤。其中处理1为含活菌数0．1?108cfu/g的

菌剂（T1），处理2为含活菌数1．0?108cfu/g的菌

剂（T2），处理3为含活菌数3．0?108cfu/g的菌剂

（T3），处理4为含活菌数5．0?108cfu/g的菌剂

（T4），处理5为含活菌数1．0?109cfu/g的菌剂

（T5）。每盆播种10株左右的小白菜种子，小白菜

二叶一心时间苗，每盆保留生长一致、均匀分布的2

株作为试验株。期间保持管理措施一致，适时定量

浇水，试验周期60d。收获时测定叶片SPAD值、叶

片数和鲜质量、干质量［12－13］。

表1试验处理编号及用量

Tab．1The treatments manure

处理号Treatments

施肥名称及用量/（g/盆）The name and amount of fertilizer

CK1复合肥2．0g

CK2CK1+草炭土载体0．5g

T1CK1+0．1?108cfu/g菌剂0．5g T2CK1+1．0?108cfu/g菌剂0．5g T3CK1+3．0?108cfu/g菌剂0．5g T4CK1+5．0?108cfu/g菌剂0．5g T5CK1+1．0?109cfu/g菌剂0．5g 1．4．6指标测定土壤的有机质含量、NPK含量、pH值等基本理化性质按常规方法分析，其中土壤有机质含量用重铬酸钾容量法-外加热法；pH值采用5．0?1．0水土比，电极测定法；全N含量用半微量开氏法；碱解氮采用扩散法吸收测定；速效P含量用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法；速效钾含量采用火焰光度计法［12］。

溶磷能力测定：将发酵液离心取上清液，使用钼锑抗比色法测定清液中有效磷含量［14］。

叶片数、生理指标测定：叶片数只选择绿色可食用部分；SAPD值测定采用SPAD-502Plus型叶绿素仪进行；干质量测定按常规方法进行［14］。

1．4．7数据分析试验数据采用Excel进行处理，利用SPSS16．0软件进行数据统计及差异显著性分析。菌株的系统发育树采用MEG4．0的Neighbor-Joining软件进行构建。

2结果与分析

2．1解磷细菌的筛选和解磷能力测定

通过初筛从大麦根际土壤中分离纯化得到13株解磷细菌，分别将各解磷细菌活化、点接至无机磷固体培养基平板中，通过透明圈测定的方法比较解磷能力（D/d）［15－17］。结果表明：13株解磷细菌在无机磷培养基平板中培养3d，D/d值均为1．23 3．96，各解磷细菌的溶磷效果差异较大。在13株解磷菌中，菌株PSM的D/d值最高，而且随着培养时间的延长，解磷圈呈增大趋势，表明菌株PSM具有较强的解磷能力（表2）。

表2各解磷菌株培养3d的D/d值

Tab．2D/d value of different phosphate-solubilizing

bacteria in3d

解磷菌株编号

Solubilizing strains No．

第1天D/d值

Day1D/d value

第3天D/d值

Day3D/d value PSA01．23

PSB0．191．92

PSC1．163．36

PSD0．562．08

PSE0．542．01

PSF0．171．87

PSG0．982．11

PSH0．451．92

PSI1．302．58

PSJ0．742．34

PSK1．293．57

PSL1．103．29

PSM1．433．96

增刊邢芳芳等：大麦根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效果研究

255

2．2菌株PSM液体解磷能力的测定结果

从图1可以看出，试验组接种菌株PSM的发酵液在整个培养周期内水溶磷含量逐渐升高，发酵初期升高较少，待发酵至第2天后，发酵液中水溶性磷含量开始快速升高，整个培养中期PSM对Ca3（PO4）2的分解能力最高，集中在第2 6天，培养基内水溶磷含量由58．1mg/L升至449．1mg/L。发酵过程持续到第7天以后，培养基中水溶磷含量较第6天趋于平稳，可能是菌株开始利用发酵液中的水溶性磷或者由于培养基中其他养分不足导致PSM菌株无法正常代谢繁殖，PSM解磷功能受到阻遏。同时，未接菌的对照组在整个试验过程中水溶磷含量保持稳定，基本维持在9．26mg/L，而试验组最高时达到449．1mg/L，是对照组的48．5倍，可见菌株PSM对难溶性无机磷Ca3（PO4）2具有很强的分解能力。2．316S rDNA测定结果

解磷菌株PSM的16S rDNA基因序列扩增后片段长度为1509bp，将扩增序列与NCBI数据库上的序列进行比对，比对结果见图2。由比对结果可以看出菌株PSM与枯草芽孢杆菌BY3、K21、NB-01（Bacil-lus subtilis）同源性最高，匹配程度可达到99．8%，结合菌株形态观察，将菌株PSM鉴定为枯草芽孢杆菌

。

图1菌株PSM对无机磷的降解效果

Fig．1The degradation of inorganic phosphorus of

PSM

图2菌株PSM的系统进化树

Fig．2The evolutionary tree of PSM

2．4PSM对小白菜叶片数、叶绿素的影响

从图3可以看出，施加草炭载体（CK2）、PSM菌

剂组的叶绿素均大于空白组（CK1），以T5处理叶绿

素增加最为明显，较空白处理CK1增加5．13%，较

单施草炭处理CK2增加2．4%。总体来看，施加菌

剂的各处理叶绿素均大于CK2，各处理之间叶绿素

无显著性差异。从叶片数可以看出，施加草炭载体

（CK2）、PSM菌剂组各处理组叶片数都显著增大，均

大于空白组（CK1），添加PSM菌剂的处理组均大

于草炭对照组（CK2），以T4（5．0?108cfu/g）的叶片数

最大，较空白组（CK1）增加25．86%，差异极显著（P＜

0．01）；与单施草炭组（CK2）相比增加12．3%，差异

达到极显著水平（P＜0．01）。其次是T3（3．0?108

cfu/g）和T5（1．0?109cfu/g）2个处理，再次是T2

图3PSM对小白菜叶绿素和叶片数的影响

Fig．3Effect of different treatment on chlorophyll

content and leaf number

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华北农学报31卷

（1．0?108cfu /g ）和T1（0．1?108cfu /g ）处理，说明

每盆施用0．5g 的含5?108

cfu /g 的PSM 菌剂促生效果最好。2．5

PSM 对小白菜鲜质量、干质量的影响表3结果显示，所有施草炭及菌剂处理的鲜质量、干质量较空白（CK1）都增加，与空白处理（CK1）相比，添加PSM 菌剂的每个处理鲜质量增加8．52 21．65g ，增幅达到6．6% 16．72%；添加PSM 菌剂的每个处理干质量增加0．62 1．60g ，增幅达到7．25% 18．68%。与单施草炭的处理（CK2）相比，

施加菌剂的各处理鲜质量、干质量均高于CK2，其中鲜质量增幅2．06% 11．77%，干质量增幅0．94% 11．70%，其中T4处理较CK2鲜质量增加15．91g ，干质量增加1．06g ，增产率分别达到11．77%，11．70%，其次为T5、T3处理。说明添加解磷菌的草炭土比单独施用草炭土具有明显的增产作用，且菌剂活菌含量对促生效果影响较大，结果表明

最佳施用菌量为5．0?108

cfu /g ，说明在施加有机载体的基础上施用PSM 解磷菌，可以显著提高小白菜

的地上部生物量。

表3

不同处理对小白菜鲜质量、干质量的影响

Tab．3

Effect of different treatment on fresh weight and dry weight

处理号Treatments 鲜质量/g Fresh weight 比单施草炭土增加/%Increase than CK2

干质量/g

Dry weight 比单施草炭土增加/%Increase than CK2

CK1129．48?0．94gG －4．248．55?0．06eD －5．89CK2135．22?0．44fF 0．009．09?0．09dC 0．00T1138．00?1．09eE 2．069．17?0．09cdC 0．94T2141．59?0．65dD 4．719．35?0．07cC 2．86T3145．29?1．25cC 7．459．63?0．27bB 6．03T4151．13?1．42aA 11．7710．15?0．10aA 11．70T5

147．67?0．87bB

9．21

9．79?0．14bB

7．73

注：同列相同小写字母表示在P ＜0．05水平差异显著；大写字母表示在P ＜0．01水平差异极显著。

Notes ：The same column marked with different Lowercase letters at P ＜0．05level of significant difference ；in capital letters at P ＜0．01level of signifi-cant difference．

3讨论与结论

通过对大麦根际土壤中解磷菌进行筛分，得到

13株具有较强解磷能力的解磷细菌，通过溶磷圈D /d 测定试验，筛选到一株溶磷效果较好的革兰氏阳性细菌PSM 作为供试菌株。通过使用无机磷液体培养基进行液体发酵，研究其对水不溶性无机磷Ca 3（PO 4）2的分解能力，对PSM 发酵上清液的动态测定试验发现，菌株PSM 具有较强的分解Ca 3（PO 4）2的能力。在含磷酸三钙的无机磷液体培养基中随着发酵时间的延长，发酵液中水溶磷含量呈升高趋势，其中发酵第2 6天水溶性无机磷变化最快，培养基内水溶磷含量由57．8mg /L 升至429．2mg /L ，此研究结果与许多报道一致。王亚艺等

［15］

从多种作物根际土壤筛选得到一株高效解磷

菌y8-4，经发酵后菌液中磷含量可达95μg /mL ，其次是菌株y9-4，可以作为适合青海农作区的高效解磷菌。刘文干等

［16］

从花生根际土壤样品中筛选到

一株高效溶磷黑曲霉B1-A ，溶磷试验表明，菌株对磷酸三钙、磷矿粉等均具有较强的溶磷能力，有望为开发高效红壤微生物磷肥提供种质资源。通过对菌株PSM 的16S rDNA 序列的测定和分析，鉴定菌株PSM 为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）。

将PSM 进行液体发酵得到高密度芽孢液，与草炭载体复配制备成解磷菌剂，通过小白菜盆栽与草炭载体、单施复合肥处理进行对照试验，结果表明施加PSM 菌剂对小白菜的生长具有明显的促进作用，其中施加草炭土、PSM 菌剂各处理组的叶绿素、叶片数、鲜质量、干质量均大于单施复合肥处理（CK1），鲜质量增加8．52 21．65g ，增幅达到6．60% 16．72%；添加PSM 菌剂的每个处理干质量增加0．62 1．60g ，增幅达到7．25% 18．68%。与单施草炭和复合肥的处理（CK2）相比，施加菌剂的各处理鲜质量、干质量均高于CK2，鲜质量增幅2．06% 11．77%，干质量增幅0．94% 11．70%，其中T4处理较CK2鲜质量增加15．91g ，干质量增加1．06g ，增产率分别达到11．77%，11．70%。说明施用PSM 解磷菌对盆栽小白菜生物产量的提高具有显著作用。蒋欣梅等

［18］

以紫京城茄为试验作物，

研究不同水平的微生物解磷菌肥对大棚茄子生长的影响，

结果表明，增施微生物解磷菌肥可以提高茄子对有效磷的利用，能够提高茄子的株高、茎粗、产量、叶绿素含量等指标，与本研究结果有一致性。

解磷菌不仅可以活化作物根际土壤中被固定的磷素，菌种在植物根际繁殖代谢过程中还能分泌大量促生因子，提高根系活力

［18－19］

，从而提高了作物

增刊邢芳芳等：大麦根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效果研究

257

对养分的吸收利用效率。关于解磷细菌PSM的具体解磷、促生机制、菌株的发酵工艺以及制剂配方等方面还有待于进一步研究，为其在肥料应用中的推广进行深入系统地探索。

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