流式细胞仪分析技术及应用(课件)
流式细胞仪分析技术及应用
第一节概述第二节数据的显示与分析第三节流式细胞仪技术要求
一、工作原理一、参数一、免疫检测样品制备
二、散射光的测定二、数据显示方式二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
三、荧光测量三、设门分析技术三、免疫胶乳颗粒的应用
四、细胞分选原理四、流式细胞技术的质量控制
第四节流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应用第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用
?流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集
激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。
?流式细胞术发展史
1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究
1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞
1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白
1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞
1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器
1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计
1972年Herzenberg研制出细胞分选器
1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂
目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司
?流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针
的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
主要特点：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；
5.速度快：5000-10000个细胞/秒；
6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；
7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。
第一节概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。
分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成细胞功能一、工作原理
大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发粒度细胞活性效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量胞内细胞因子保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细蛋白质含量激素结合位点胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证钙离子, PH值, 膜电位酶活性了检测速度与统计分析精确性。
概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。
（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射
的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。
主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：
1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。
2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。
3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。
（3）数据处理系统
流式细胞仪与显微镜的区别
区别流式细胞仪显微镜
光源激光自然光、灯光
对象细胞、生物粒子细胞、组织等
承载工具鞘液及流动室载玻片
检测信号光学信号形态及染色
放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大
统计计算机，>5000 人工，200
结果多参数，综合分析简单，单参数
二、散射光的测定
散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞
的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为:
①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴
较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的
表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。
目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
三、荧光信号（FL）测量
当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：
①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；
②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。
通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1 、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。
常配置的激光器波长为488nm。633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy
荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。
四、细胞分选原理（图示见上）
通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。
1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。
2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。
3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液
滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。
检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度
（二）FCM 分选指标
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。
分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节数据的显示与分析
常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
一、参数FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。
二、数据显示方式
（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。
（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。
在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。
（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。
（五）流式细胞仪的多参数分析--------- 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。
第四节流式细胞仪技术的要求
一、免疫检测样品制备
细胞样品制备要求：
1、单细胞悬液；
2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；
3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；
4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；
5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。
外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞
培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤
新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：单细胞悬液的保存：
红670
红减少交叉，成本高不敏感易红670
488PEcy5能量传递复合染料633APC 别藻青蛋白具较多发光基团，消光系数和量子产额高不敏感易488PC 藻青蛋白橙575488PE 藻红蛋白稳定，偶联后量子产额低不敏感不易红 615568Texas red 得州红易溶于水，与抗体结
合不影响特异性敏感易绿 525488FITC 异硫氰酸荧光素特点对PH 敏感性溶解性发射光或荧光颜色激发波长染料名称机械法（金属网引起细胞破碎） 深低温保存法（一年）
酶处理法（选择最适宜消化酶） 乙醇或甲醇保存法（2周）
化学试剂处理法（导致细胞成活率降低） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
表面活性剂处理法
注意事项：
1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；
2、根据实验目的选择最隹的固定方法；
3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。
4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；
5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-e εCL) F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm 的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。
1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：
FITC 和PE 等的激发波长均为488nm ，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。
2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质；
如FITC ，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等
常用的几类荧光染料
（二）免疫荧光标记
荧光染料与细胞成分的四种结合方
式 结构亲和式
嵌入结合
共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法
直标：干扰少,但需购买多种单抗
间标：步骤多,干扰多,不需标记多种
抗体
组合标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术
是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。
四、流式细胞技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控（二）免疫荧光染色的质控
适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）温度
试剂选择pH
样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）染料浓度
实体组织来源标本用机械法固定剂
温度25~37℃，pH7.0~7.2
（三）仪器操作的质控
光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。
PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。
绝对计数校准: 保证计数的准确性。
（四）免疫检测的质控
同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。
第五节、流式细胞仪的科研应用
1、细胞表型分析
2、胞内蛋白的检测
3、细胞周期和DNA倍体分析
4、流式标准小球定量
5、分选
6、细胞内钙离子测量
第六节、流式细胞术的临床应用
1、细胞周期和DNA含量分析
2、细胞凋亡的检测和分析
3、血小板及血小板活化的FCM 分析
4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测
5、白血病和淋巴瘤免疫分型
6、网织红细胞分析
7、残余白血病检测
8、淋巴细胞亚群分析
9、肿瘤耐药基因分析10、AIDS病检测中的应用11、自身免疫病相关HLA抗原分析12、移植免疫中的应用
1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。
荧光染料和细胞DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系：
①DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；
②荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；
③荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：
即G0/1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。
在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。
在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。
DNA分析的临床意义
DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰
DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性
FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志
在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息
DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待
形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能
DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标
细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）
-------（2）晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰
流式细胞术临床应用
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
一、流式细胞仪技术参数
一、流式细胞仪技术参数 1 工作条件： 1.1 电源要求: 220V (±10%)、50-60HZ 1.2 环境温度:16-30℃ 1.3 湿度：20-80% 2 用途：免疫分析、淋巴细胞亚群分析；细胞周期分析、凋亡分析；感染分析、肿瘤细胞分析；多重细胞因子分析等。 3 技术规格和参数 3.1 激发系统： 3.1.1 激发光源：405nm紫色固态激光器、488nm蓝色固态激光器和640nm红色固态激光器，固定光路，空间立体激发。 3.1.2 激光塑形：自动的多棱镜塑形系统，光斑大小：9x65um椭圆形光斑 3.1.3 流动室规格：180x430μm 3.2 荧光收集和检测 3.2.1 光胶耦合物镜，数值孔径1.2，大面积收集发射荧光。 3.2.2 每一激发激光对应一个独立检测单元，光胶耦合物镜自动分开汇集每一激光激发的发射荧光进入相对应检测单元，避免光谱交叉。 *3.2.3 配备1个独立八角型全反射检测系统、2个独立三角型全反射检测系统 3.2.4 光学检测系统内部采用全反射检测光路系统，荧光信号到达检测器只经过一个长通滤光片，信号能量损失最小。 3.2.5 检测系统依次优先检测易衰减的长波长信号，保证弱信号灵敏度。 *3.2.6 共计12个信号检测器，包括10个光电倍增和和2个散射光探测器。 3.2.7 荧光通道组合：405nm紫色激光器对应3个检测通道，滤光片包
括450/50nm、 525/50nm、 605/40 nm；488nm蓝色激光器对应4个检测通道滤光片包括530/30nm、 575/25nm、695/40nm、780/60 nm； 640nm 红色激光器对应3个检测通道，检测滤光片包括：670/30nm、712/21nm、780/60 nm。通道之间最低光谱交叉，滤光片带有智能芯片，直接插拔，自动识别。 *3.2.8 荧光检测灵敏: FITC<100MESF，PE<50MESF(提供英文原版参数)；CFDA检测结果FITC<5MESF，PE<5MESF（提供检测报告）。 *3.3 样本分析速率：>32,000个细胞/秒(提供英文原版参数)。 3.4 变异系数：全峰宽CV<3% *3.5 采用正压上样系统，非注射泵或蠕动泵。样本残留量<0.2%。 3.6 最小样本量：≤30ul 3.7 检测颗粒大小：0.5-50μm 3.8 数字信号处理：18bit动态范围，符合IEEE 32bit浮点分辨率。3.9 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,可区分多倍体细胞、粘连细胞。 3.10 可溶性蛋白分析：具备多重可溶性蛋白分析功能，包括：细胞因子、炎症因子、趋化因子等；可达单管数十重分析，包括：多重定量及动力学分析。 *3.11 液流车：独立液流车，避免振动影响仪器主机光路和液流；自动控制所有压力、鞘液、清洗液等，大体积液体储备保证长时间、稳定工作；鞘液桶20L，废液桶10L，清洗液桶5L，关机液桶5L。开关机自动清洗液路，正常状态鞘液消耗<1.10 L/h，待机状态鞘液消耗<1 mL/h。 3.12 配置淋巴细胞亚群自动分析软件，无需手动设置，实现淋巴细胞亚群分型的全自动化。 3.13 主软件：Windows系统，原版专业化流式数据收集及处理软件, 可按用户需求设置条件进行数据分析和报告。 3.14 临床自动软件：标配临床自动软件，拥有具CFDA认证的4色及6
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，
流式细胞仪分析技术及应用题库1-2-10
流式细胞仪分析技术及应用题库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于液流系统的鞘液，下述哪项是不正确的（）. A.鞘液是辅助样本作正常检测的基质液 B.鞘液是用来与样本作对比的 C.鞘液是包裹在样本流周围 D.使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性 E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞 鞘液是辅助样本作正常检测的基质液，其主要作用是包裹在样本流周围，使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确，同时又防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关（）. A.细胞含量 B.细胞性质 C.细胞大小 D.有否胞膜 E.单核或多核 分选速度与细胞悬液中分选细胞的细胞含量直接相关。一般分析速度为5000～10000；分选速度掌握在1000以下。
问题： [单选,A4型题,A3A4型题]流式细胞术是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分，进行定量分析和分选的检测技术，它可以高速分析上万个细胞，并能从一个细胞中测得多个参数，是目前最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的主要组成不包括（）. A.A.液流系统 B.光路系统 C.抗原抗体系统 D.信号测量 E.细胞分选 (天津11选5 https://www.wendangku.net/doc/431792529.html,)
问题： [单选,A4型题,A3A4型题]流式细胞术是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分，进行定量分析和分选的检测技术，它可以高速分析上万个细胞，并能从一个细胞中测得多个参数，是目前最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的技术特点不包括（）. A.A.采用鞘流原理 B.以激光作激发光源 C.使用散射光检测 D.检测荧光信号 E.采用电阻抗及化学染色原理
自己总结：流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞术及其应用教程
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限
流式细胞仪主要技术参数
流式细胞仪主要技术参数 1.光学系统： 1.1*激光配置:配置488nm和638nm两根全固态激光器，激光功率均大于等于 50mW以上； 1.2检测参数：可同时激发和检测6色荧光. 1.3光路设计：固定校准的光路设计，智能监控确保激光稳定工作。光学滤光 片可由用户根据实际应用自行更换，无需专业人员调校； 1.4采用专利的FAPD（Fiber Array Photo Detector）能够达到5倍于传统高 性能PMT的光电转换效率； 1.5检测器电压可以调节，以适应不同特性样品的检测，提高实验灵活性； 1.6光信号收集系统, 能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中， 最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集； 1.7*系统具备进一步升级的能力，最高可升级至3激光13色。 2.分析性能： 2.1*颗粒检测能力：可准确区分0.1um、0.2um和0.3um的细胞或微粒； 2.2*荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度少于30 MESF，PE的荧光灵敏度少于10 MESF； 2.3荧光分辨率：CV<3%（G0/G1期最高峰）； 2.4无需微球的绝对计数功能，在检测的同时即可自动计算样本浓度，结果准 确。 3.电子系统： 3.1信号处理精度：24比特原始信息量； 3.2高达107的线性动态范围，可以将强信号和弱信号都完全显示在一张图上；3.3*支持多色荧光信号共同采集，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/ 秒； 3.4荧光补偿：全矩阵荧光补偿，可脱机补偿，离线分析； 4.液路系统： 4.1半自动化上样系统，具有自动混匀和自动清洗功能，降低样本间交叉污染； 4.2液流系统日常维护简单、清洗简便，自带开关机程序；
流式细胞仪分析技术及应用
第二十二章流式细胞仪分析技术及应用 本章要点 1.流式细胞仪的分析及分选原理 2.数据的显示与分析 3.流式细胞仪免疫分析的技术要求 4.流式细胞术在免疫学检查中的应用 概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 第一节流式细胞仪的分析及分选原理 流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。 一、工作原理 （一）基本组成结构 1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度<10m／s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G 水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ，为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
流式细胞仪检测技术与质量控制精编WORD版
流式细胞仪检测技术与质量控制精编W O R D 版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】
流式细胞仪检测技术与质量控制【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。 1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。 4 讨论 流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。 标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存
流式细胞分析技术.
流式细胞仪分析技术及应用 第一节概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节流式细胞仪技术要求 一、检测样品制备 二、常用的荧光染料与标记染色 三、胶乳颗粒的应用 四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求 第五节、流式细胞仪的科研应用 第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用 一、细胞周期和DNA倍体分析 二、染色体分析 三、细胞表面标志的检测 1、淋巴细胞及其亚群的分析 2、淋巴细胞功能分析 3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。 流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术 流式细胞术发展史: ?1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 ?1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 ?1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 ?1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 ?1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 ?1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 ?1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 ?1972年Herzenberg研制出细胞分选器 ?1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂 ?大量厂家不断生产流式细胞仪 ?目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER公司 流式细胞术的特点： 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 主要特点：单个细胞水平分析；多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细
流式细胞仪分析技术及应用题库1-0-6
流式细胞仪分析技术及应用题库1-0-6
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]多参数定量测定和分选的技术称（）. A.荧光免疫分析 B.酶联免疫分析 C.流式细胞免疫分析 D.化学发光免疫分析 E.放射免疫分析 本题考查对流式细胞术的认识。流式细胞术是综合光学、流体力学、电子计算机技术，利用荧光素产生荧光的特点，对单个细胞进行多参数定量测定和分选的技术。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]流式细胞仪的主要组成部分不包括（）. A.流动室和液流系统 B.温育和比色系统 C.激光源和光学系统 D.光电管和检测系统 E.计算机和分析系统 流式细胞仪主要由4部分组成：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
天津11选5 https://www.wendangku.net/doc/431792529.html, 问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于液流系统的鞘液，下述哪项是不正确的（）. A.鞘液是辅助样本作正常检测的基质液 B.鞘液是用来与样本作对比的 C.鞘液是包裹在样本流周围 D.使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性 E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞 鞘液是辅助样本作正常检测的基质液，其主要作用是包裹在样本流周围，使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确，同时又防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关（）. A.细胞含量 B.细胞性质 C.细胞大小 D.有否胞膜 E.单核或多核 分选速度与细胞悬液中分选细胞的细胞含量直接相关。一般分析速度为5000～10000；分选速度掌握在1000以下。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法 细胞周期/DNA分析（PI法） 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤 1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清； 2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散； 3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；
6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min； 8.用300目滤网过滤，上机检测。 细胞周期/DNA分析 (BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit) 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下1-6） 三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管 肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1 四、实验步骤
流式细胞仪常用技术方法
细胞周期/DNA分析（PI法） 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤 1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清； 2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散； 3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打； 6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min； 8.用300目滤网过滤，上机检测。
细胞周期/DNA分析 (BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit) 一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备） 0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。 二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围： 没有染色的细胞（制备过程如下1-6） 三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管 肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1 四、实验步骤 1.将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到 500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心； 2.弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混 匀细胞。 3.室温离心，300g×5min； 4.重复2、3一次； 5.弃上清留大约50ul下面的液体，加入1ml Buffer Solution重悬细胞； 6.计数细胞，用Buffer Solution将细胞密度调为1×106个/ml； 7.染色： A．取0.5ml含细胞5×105个； B．每管加入250ul Solution A，用手轻拍混匀（勿用漩涡混匀）； C．室温反应10min，保留Solution A； D．加入200ul Solution B，轻轻混匀； E．室温反应10min，保留Solution A+B； F．加入200ul冷Solution C，轻轻混匀，黑暗处2-8℃孵育10min； 用50um尼龙网过滤细胞，加入上样管上流式分析（3h内分析完）。
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用 ?流式细胞术主要包括： ?1、液流技术 ?2、细胞的分选和计数技术 ?3、数据的采集和分析技术 流式细胞术发展史 ?主要特点： ?单个细胞水平分析； ?多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析； ?高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度； ?可分析大量细胞； ?速度快： 5000-10000个细胞/秒； ?统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况； ?分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 流式细胞仪分为三大类： ?一类为台式机（临床型）： ?BD FACSCalibur流式细胞仪特点： ?仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。?两激光配臵：488nm 633nm ?检测参数：四荧光参数两个散射光参数 ?分析型流式细胞仪 ?应用：细胞分析检测 FCM图片——台式机 ?第二类为大型机（科研型） ?特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。 FCM图片——大型机
?第三类为新型流式细胞仪： ?随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4 根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。 BDFACSAria流式细胞仪： ?高速分析分选流式细胞仪 ?高速分析 ?高速分选 ? 3根激光： 488nm ? 633nm ? 375nm结合特制高性能石英杯流动室 ?应用：细胞分析分选 ? sp细胞检测 ?一般分为5 部分： ?①流动室及液流驱动系统； ?②激光光源及光束成形系统； ?③光学系统； ?④信号检测、存贮、显示、分析系统； ?⑤细胞分选系统。 流式细胞仪构造模式图 ?光学测量台→电子控制台→数据采集、储存和计算机处理。 ?光学测量台：完成光学信号测量和转换 ?电子控制台：将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号→数字信号→最后送入电子计算机里储存处理→输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。 ?由样本和鞘液组成 ?待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力从样品管进入流动室形成样本流 ?鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 流动室与液流驱动系统 ?细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服
流式细胞仪技术要求
流式细胞仪技术要求 1．基本要求 1.1工作条件：电源220V (±10%)、50HZ（±10%），温度15-30℃和相应湿度10-80%的环镜下工作，无特殊水电气要求。 1.2硬件组成： 1.2.1流式细胞仪主机系统： 双激光八色荧光分析系统：含488nm蓝色激光器，633nm红色激光器，配8个荧光探测器和2个散射光探测器，可以同时进行8色荧光分析。 1.2.2数据处理系统： 全数字化数据处理系统及全数字化检测软件 1.3软件组成：全数字化检测软件 1.4耗材 1.4.1有完善的各种配套试剂及专用的试管 1.4.2有完善的质控系统 1.5 具备国家食品药品监督管理局SFDA认证 2．主要技术参数和要求 2.1固定光路系统，开机预热即可使用，不需每天调校光路，采用 全光纤化光路传递和收集系统； 2.2 激光平台：含488nm蓝色激光器，633nm红色激光器
2.3荧光检测灵敏：FITC<100MESF，PE<50MESF 2.4样本获取速率：10,000个细胞/秒 2.5 CV值：全峰宽CV<2% 2.6数据分辨率：262144 Channel 2.7信号脉冲处理：任意参数的脉冲信号高度(Height), 面积(Area), 宽度(Width)检测以及比率检测 2.8荧光收集系统：488nm激光采用八角形全反射收集系统，配5 个荧光探测器；633nm激光采用三角型全反射收集系统，配3个荧光探测器。 2.9荧光补偿：任意两个荧光参数间可做补偿；既可以硬件补偿, 也可以软件脱机补偿 2.10配独立的液流车系统，带液流自动清洗模式，可自动对流动室 及进样仓进行清洗，防止样本间的干扰和污染，每天工作结束后可以自动完成对仪器的全套清洗工作。 2.11 具有单平台绝对计数功能及自动化软件 3．计算机与数据处理系统 3.1 CPU PentiumIV 双核3.2G以上 3.2 内存大于2GB 3.3 数据存储：硬盘大于1TB；CD-RW/DVD 3.4 网络Ethernet; FireWire 3.5 两个21英寸以上液晶显示器