脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
一、试剂准备
（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：
试剂名称浓度商品信息
1.极限必须培养基
(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L
(SH30021.01B, Hyclone)
2.胎牛血清
（Fetal Bovine Serum，FBS）10%
(ES-009-B, Millipore)
3.青霉素/链霉素
（Penicillin/Streptomycin）1%
（TMS-AB2C, CHEMICON）
4.地塞米松
(Dexamethasone,DM) 1μmo／L 分子量：392.46
(D4902-25MG, Sigma)
5.胰岛素
(Insulin, IS) 10 μmol／L 分子量：5808
(91077C—1g, Sigma)
6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24
( I5879-100MG, Sigma)
7.吲哚美辛
(Indomethacin,ID) 200 μmol／L 分子量：357.79
(I7378—5G, Sigma)
（二）成脂分化诱导液浓储液配制
试剂名称质量浓缩倍数配制方法
1.Stock A
胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃
2.Stock B
青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃
3.Stock C
地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300
保存：-20℃
4.Stock D
胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100
保存：4℃
5.Stock E
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X
溶于2.5ml DMSO(0. 5%)
分装0.05ml/EP管X50
保存：-20℃
6.Stock F
吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100
保存：-20℃
（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）
1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;
2.加1管Stock A（1ml）；
3.加1管Stock B（0.1ml）；
4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；
5.加1管Stock E（0.05ml）；
6.加1管Stock F（0.02ml）；
7.加1管Stock D（0.1ml）；
8.测渗透压，调pH7.2-7.4;
9.0.22μm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
（四）Stromal Medium配制（10ml）【２】：
1.取DMEM8.9ml加入15ml离心管（BD）;
2.加入1管Stock A（1ml）；
3.加入1管Stock B（0.1ml）；
4.调pH7.2-7.4;
5.0.22μm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
（五）0.5%油红―O‖配制【３】
油红―O‖0.5 g溶于100ml 无水乙醇（50%），分装备用，使用前0.22μm过滤
二、方法
（一）细胞诱导培养【4】
1.间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂
直超净台；
2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
3.1ml微量移液器吸弃培养液；
4.加入预温PBS，1ml/孔；
5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
6.吸弃PBS；
7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；
8.加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孔，5min，37℃；
9.加入等量Stromal Medium，终止消化；
10.1ml微量移液器彻底吹洗皿底，收集细胞悬液至15ml离心管内；
11.1400rpm,RT,5min;
12.小心取出离心管，吸弃上清；
13.加入Stromal Medium重悬消化下来的细胞；
14.按1× 104个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可
铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔），加入Stromal Medium培养基培养3天，设置对照组（一直使用Stromal Medium培养），空白组（添加DMEM 覆盖皿底即可）；
15.3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）；
16.每2-3天换液一次；
17.诱导2周后，初始脂肪形成时用油红―O‖染色进行评估。
（二）油红―O‖染色：
1.从培养箱内取出细胞至普通实验台；
2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
3.1ml微量移液器吸弃培养液；
4.加入预温PBS，1ml/孔，；
5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
6.吸弃PBS；
7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；
8.加入4%多聚甲醛液（覆盖所有细胞即可）固定1h，室温(或4℃过夜)，蒸馏水洗涤3
次；
9.用0.5%的油红―O‖染色1h（覆盖所有细胞即可），室温；
10.放入70%的乙醇中分化至间质清晰，然后再用蒸馏水洗涤3次；
11.苏木素染液复染（覆盖所有细胞即可），1-2min，蒸馏水洗涤3次【5】；
12.染色的细胞可以用肉眼在相差显微镜下进行观察确认（为避免皿内干燥影响观察，可留
少许液体，且观察时间不宜超过15min或用甘油封盖后可长时间保存）。
三、结果
脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。
小鼠脂肪组织来源的脂肪干细胞（经成脂诱导2周后）
脂肪细胞油红O染色（X200）【6】
【1】【5】Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz
HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for Cell-Based therapies, Tissue Eng. 2001,7(2):211–228.
【２】【4】Yu G, Wu X, Kilroy G, Halvorsen YD, Gimble JM, Floyd ZE.
Isolation of murine adipose-derived stem cells. Methods Mol Biol. 2011;702:29-36.
【３】田玉旺，李琳，李丽，胡海. 介绍一种改良的油红O脂肪染色法，中国组织化学与细胞化学杂志，2007,16(6).
【6】Lu F, Gao JH, Ogawa R, Mizuro H, Hykusoku H.Adipose tissues differentiated by
adipose-derived stem cells harvested from transgenic mice. Chin J Traumatol. 2006 Dec;9(6):359-64.
脂肪细胞的基础知识
脂肪细胞的基础知识 脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。 张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。 张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.
间充质干细胞 概念： 不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。 李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。 庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种 具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间 充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于 其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多 种抗原标志。 李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外， 它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。 张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。 脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。 免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识 脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。 大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。 目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。 1 脂肪组织采集 1.1 脂肪组织采集机构要求 脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应在层流手术室内进行无菌操作，最大限度地减少污染和交叉感染的发生。 1.2 脂肪组织供者要求 对供者健康状况进行全面检查(如一般信息、既往病史和家族性遗传病等)及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒(包括但不仅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)阴性、梅毒螺旋体阴性(提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml外周血用于复检，ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询)。若供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV检查结果为阳性，实验室应具有处理感染性样本的独立物理空间、独立的空调系统，能做到使用后的器具和相关物品可经过灭活处理后再移出该区域。感染性样本与非感染性样本的处理及制备不使用同一设备，方可进行脂肪组织的采集，但必须使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。当实验室不具备上述相对应病原体阳性制备/培养区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。若供者HIV、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。高度怀疑HIV感染或者考虑HIV感染窗口期的供者不予采集。 1.3 采集方式、采集部位和采集量 1.3.1 采集方式 用肿胀液(生理盐水250ml＋2%利多卡因10~15ml＋肾上腺素0.25mg)局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml注射器配备口径1.5~3.5mm、侧孔3.0~5.0mm的吸脂针，进入供区，形成负压，呈扇形手动均匀吸取脂肪组织，吸出3~5mm3脂肪组织颗粒，若脂肪组织颗粒
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155 www. CRTER .org 肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。 通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 https://www.wendangku.net/doc/4f1893826.html, Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Accepted: 2015-07-01 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定 肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700) 文章亮点： 1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。 2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 3 DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金 主题词： 干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的 基金资助： 国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02) 摘要 背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161. doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013 Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification Xiao Jian-hong 1, Zhang Yang-chun 2, Zhang Chang-ran 1, Yang Xing 2 (1Department of Internal Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).
人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立
人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立 徐潇，张旭毅，闫俊灵，陈冲，赵欣，李明辉，汤苏阳 【摘要】［摘要］目的探讨建立生物学性状稳定的人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)库的可行性，旨在为组织工程种子细胞提供更多来源。方法对分离得到的hADSCs采用液氮低温冻存,并在一定时间复苏培养,以流式细胞仪检测其表面抗原Z在诱导培养基中对其进行成脂和成骨诱导培养,光镜下观察细胞形态Z 免疫组织化学方法检测成骨诱导的特异标志物碱性磷酸酶(ALP)的表达, 观察hADSCs在复苏前后的分化能力。结果从脂肪组织中分离培养扩增获得数目稳定的hADSCs ,经冻存并复苏后的hADSCs形态和表面抗原保持不变Z可继续扩增10代以上，倍增时间为48h o复苏后第2、第6、第10代hADSCs 均保持了较强的成脂及成骨分化能力。结论初步建立hADSCs库,可为再生医学修复重建组织工程提供较好的种子细胞。 【期刊名称】解放军医学杂志 【年(卷),期］2016(041)012 【总页数】6 【关键词】［关键词］脂肪来源间质干细胞；干细胞库；低温保存；可行性研究近年来，再生医学的迅速发展为组织工程修复组织缺损提供了种子细胞和可利用的细胞基质，其中脂肪干细胞与其他干细胞相比具有来源丰富、取材简单、便于培养、无组织配型及免疫排斥问题、可跨胚层多向分化、增殖速度快等显著优点Z是优秀的组织工程种子细胞［1-3］O人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived Stem CeIlS , hADSCs)是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞［4］,是极具前景的组织工程和基因治
脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究_韩铮
收稿日期：2009-05-22 作者简介：韩铮(1982-)，硕士，E-mail:allenhz520@https://www.wendangku.net/doc/4f1893826.html, 脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究 韩铮，姜平，高建华，鲁峰，付冰川，陈晓炜（南方医科大学南方医院整形外科，广东广州510515） 摘要：目的探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)在体外的免疫原性，以及ADSCs 在家兔同种异体皮片移植中的免疫调节作用。方法将家兔淋巴细胞分别与自体和异体ADSCs 混合培养48h 后加入CCK-8试剂，并用酶标仪检测OD 值；在家兔同种异体移植皮片下注射自体ADSCs ，观察移植皮片的坏死时间，并于术后第7日切取移植皮片的周边组织进行组织学观察。结果家兔淋巴细胞与自体、异体ADSCs 混合培养后用酶标仪检测OD 值分别为（1.527±0.402）和（1.615±0.351），两组OD 值差异无统计学意义；家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs 的移植皮片的坏死时间为（7.170±1.472）d ，未注射ADSCs 的对照组移植皮片的坏死时间为（5.830±1.169）d ，两组皮片坏死时间差异具有统计学意义；术后第7日组织学观察见实验组皮下浸润的炎症细胞较少，皮下组织结构完整、清晰；对照组皮下浸润的炎症细胞较多。结论脂肪来源干细胞在体外的免疫原性低，对家兔同种异体皮片移植有免疫调节作用。关键词：脂肪来源干细胞；免疫原性；免疫调节；组织工程中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)10-2144-03 脂肪来源干细胞(ADSCs)是成体干细胞的一种，自Zuk 等［1］报道以来，以其来源广泛、取材简便的特点和可多向分化的潜能，成为干细胞及组织工程研究领域的热点［2］。近年来有关ADSCs 的研究主要集中于其多向分化潜能［3-6］，而对其免疫学特性仍未展开较深入的研究。本实验以家兔作为动物模型，对家兔 ADSCs 的体外免疫原性及体内的免疫调节作用开展 初步探讨，试为扩充组织工程种子细胞的来源及拓展ADSCs 的应用领域提供实验基础。1材料和方法 1.1实验动物与试剂 健康新西兰大白兔10只，雌雄兼有，体质量 2.0~2.5kg ，由南方医科大学SPF 级动物实验中心提供并饲养。DMEM 高糖培养基，RPMI 1640培养基， 胰酶，FBS （Hyclone ），Ⅰ型胶原酶，CCK-8试剂盒， Percoll 淋巴细胞分离液，PHA （植物凝集素）。1.2方法 1.2.1家兔ADSCs 的分离及体外培养取家兔腹股 沟皮下脂肪5ml ，PBS 缓冲液反复冲洗后剪成约1 mm 3大小的脂肪颗粒，0.1%胶原酶在37℃条件下消化30min 左右。使用等量完全培养基（含10%FBS 的DMEM 高糖培养基）中和，离心（1200r/min ）5min 后 去除上清，沉淀混悬后尼龙网过滤并接种于细胞培养瓶中，于37℃、5%CO 2孵箱培养。于24h 后更换培养液，此后每3d 换液1次。观察细胞生长情况，待 6~7d 细胞生长融合达80%~90%后，0.1%胰酶消化后按1∶3进行传代培养。1.2.2体外实验 1.2.2.1家兔淋巴细胞的刺激增殖实验取家兔耳缘静脉血5ml ，用Percoll 淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞，计数后与PHA 混 合培养于96孔培养板，具体实验分组如下，实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和PHA （100μg/ml ，20μl/孔）混合培养；对照组：单独家兔淋巴细胞培养组（1× 104/孔）。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续混合培养4h 后用酶 标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.2.2家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验通过前 述方法分离出家兔淋巴细胞，将其分别与自体 ADSCs 和同种异体ADSCs 混合培养于96孔培养 板，具体实验分组如下，对照组：家兔淋巴细胞（1× 104/孔）和自体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养；实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和同种异体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续 混合培养4h 后用酶标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.3体内实验家兔10只，随机分成5组（记为A 、B 、C 、D 、E 组），每组2只互为同种异体皮片移植对象。在每只家兔的两侧臀部设计直径为3cm 的圆形 皮片，切取后组内、同侧之间交互移植。实验组（左侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射含自体ADSCs （1×106/kg ）的完全培养基2ml ；对照组（右侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射不含自体ADSCs 的完全培养基2ml 。术后每天观察各组家兔臀部移植皮片的存活情况并记录移植皮片的坏死时间（移植皮片红润，质地柔软，视为皮片存活良好；若皮片变为暗褐色且质地坚硬的面积>2/3，视为皮片坏死），于术后第7日将C 组和E 组两组家兔的实验组及对照组移 南方医科大学学报(J South Med Univ)2009;29(10) 2144··
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序 一、试剂准备 （一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】： 试剂名称浓度商品信息 1.极限必须培养基 (Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L (SH30021.01B, Hyclone) 2.胎牛血清 （Fetal Bovine Serum，FBS）10% (ES-009-B, Millipore) 3.青霉素/链霉素 （Penicillin/Streptomycin）1% （TMS-AB2C, CHEMICON） 4.地塞米松 (Dexamethasone,DM) 1μmo／L 分子量：392.46 (D4902-25MG, Sigma) 5.胰岛素 (Insulin, IS) 10 μmol／L 分子量：5808 (91077C—1g, Sigma) 6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24 ( I5879-100MG, Sigma) 7.吲哚美辛 (Indomethacin,ID) 200 μmol／L 分子量：357.79 (I7378—5G, Sigma) （二）成脂分化诱导液浓储液配制 试剂名称质量浓缩倍数配制方法 1.Stock A 胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃ 2.Stock B 青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃ 3.Stock C 地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300 保存：-20℃ 4.Stock D 胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100 保存：4℃ 5.Stock E 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃ 6.Stock F 吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100 保存：-20℃ （三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml） 1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）; 2.加1管Stock A（1ml）； 3.加1管Stock B（0.1ml）； 4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml； 5.加1管Stock E（0.05ml）；
人脂肪组织来源的干细胞在骨组织工程中的应用
?综 述? 人脂肪组织来源的干细胞在骨组织工程中的应用 冯 林综述 张锡庆审校 中图分类号 R687 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2005)08-0620-02 作者单位:苏州大学附属儿童医院骨科, 215003 作者简介:冯林,女,河南郑州人,在读博士。研究方向:小儿矫形。 1987年,美国国家科学基金会(NSF )在加利福尼亚举行的专家讨论会上,首次提出了“组织工程”的概念,其定义为[1]:组织工程就是运用工程学和生命科学的原则和方法,研究哺乳类动物正常和病理组织的结构与功能的相互关系,并发展可恢复、保留或改善组织功能的生物替代品。骨组织工程是组织工程的一个重要分支,并且被认为是目前最具有前途和可行性的一个领域。骨组织工程学的研究中种子细胞、支架材料和细胞与材料的相互作用是研究重点。其中种子细胞是组织工程研究中最基本也是首要的环节。 脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一群多能干细胞,具有向多种组织分化的潜能。2001年,Zuk 等[2]从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次分离取得了多向分化干细胞,命名为Pr ocessed L i poas p irate (P LA )。研究发现这些P LA 细胞可以在体外稳定的增殖且衰亡率低。免疫荧光和流式细胞仪检测表明P LA 细胞中的大部分来源于中胚层或间质。因为脂肪组织取材容易,因此虽然发现较晚,但研究非常迅速深入,目前已证实脂肪组织来源的干细胞能向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向转化,可作为组织工程的种子细胞,有很重要的研究价值。 1 人脂肪组织来源干细胞的多向分化能力1.1 向成骨细胞的定向分化 Zuk 等 [2] 通过实验发现:在向成骨方向诱导4d 后,P LA 细胞的结构开始发生变化,由一个狭长的类成纤维细胞形态转变为一种圆形、立体的形状。7d 后,这些细胞开始分泌出岛状的细胞外基质。2周后内源性碱性磷酸酶染色阳性并形成矿化结节。从第2～4周,培养孔中钙化的细胞外基质的量明显增加,具有统计学意义。而且,P LA 细胞向成骨细胞分化的能力可以维持相当长的时间,其表达碱性磷酸酶活性最迟可达培养的175d 。研究证明了P LA 细胞向成骨细胞分化的能力。 1.2 向软骨方向诱导 Huang 、Zuk [3] 等应用组织学和分子生物学的方法证实在 高密度的培养条件下,培养基中加入TGF 2 β、胰岛素、干扰素和抗坏血酸,48h 内可以诱导P LA 细胞形成明显的软骨结节并表达软骨特异性标记Ⅱ型胶原,硫酸软骨素-4和硫酸角质素。逆转录多聚酶链反应分析也确认了Ⅱ型胶原和软骨 特异性蛋白聚糖—聚集蛋白聚糖的表达。因此认为这种多能干细胞确实具有向软骨方向转化的能力。尽管P LA 细胞不是真正的软骨细胞,但是它们所显示出来的原始软骨组织的特征使得其有望成为软骨组织工程的种子细胞。国内的余方圆等[4]从新西兰大白兔体内切取的脂肪组织进行一系列处理后,将获得的脂肪组织干细胞向软骨方向进行了诱导分化,结果发现细胞逐渐变圆,并聚集形成软骨样结节,Ⅱ型胶原呈强阳性、聚集蛋白聚糖表达阳性、番红0、阿利新蓝染色阳性,也说明了干细胞向软骨的定向分化。 1.3 向肌肉方向诱导 M izuno 等 [5] 将P LA 细胞置于肌源性诱导条件下6周后通 过结构学、组织学和逆转录多聚酶链反映观察到肌源性标记 MyoD1和肌球蛋白重链的表达。研究者发现,诱导3周后,P LA 细胞形成多核巨细胞并提示有肌管形成。另外;MyoD1 和肌球蛋白重链表达的时间不同,在P LA 细胞分化的过程中 MyoD1的表达先于肌球蛋白重链。研究结果揭示:大约有15%的P LA 细胞在诱导6周后向肌肉方向分化。目前,骨骼 肌组织工程主要用来治疗原发性的骨骼肌病变和因创伤和缺血继发的骨骼肌的丧失。对于这些疾病现今尚无有效的治疗,尽管P LA 细胞向肌肉方向分化与其向脂肪组织和成骨方向分化的水平相比较低,但通过应用一些外源性的因素进行干扰以及改善培养条件有希望提高P LA 的分化水平,提高其临床应用价值。 1.4 向非中胚层组织的分化 P LA 细胞为多能干细胞,它可以分化成为多种中胚层来 源的组织,如骨、软骨、脂肪和肌肉。A shjian 等[6]则通过研究发现P LA 细胞可以诱导分化为外胚层来源的早期神经祖细胞。未分化的P LA 细胞本身就表达一些特征性的神经细胞标记,如神经原特异性烯醇化酶(NSE )、波形蛋白和神经原特异性核蛋白(Neu N )。在用异丁基甲基黄嘌呤(I B MX )吲哚美辛和胰岛素诱导2周后,大约20%～25%的P LA 分化形成具有典型神经细胞形态特征的细胞;同时伴随着NSE 、波形蛋白和神经生长因子受体tr12A 表达增加。但是,诱导后的 P LA 细胞并没有表达成熟神经原标记MAP 或成熟星型细胞标 记GF AP 。而且向神经原方向诱导的P LA 细胞出现了一个延迟的整流器即K +电流(一种早期发育的离子通道),同时伴有形态学的改变和神经原特异性标记表达的增加。研究结果揭示,尽管向神经原方向诱导的P LA 细胞并未表现出成熟神经原细胞和神经胶质的特异性标记,但其表现出的早期神经
脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型
中国组织工程研究与临床康复第14卷第36期 2010–09–03出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2010 Vol.14, No.36 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6685 1Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; 2Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China Cai Zhen☆, Doctor, Attending physician, Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China caizhen1976@126. com Correspondence to: Jiang Hai-yue, Professor, Doctoral supervisor, Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China jianghaiyue@sohu. com Received:2010-05-28 Accepted:2010-06-24 脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型☆ 蔡震1，潘博2，林琳2，蒋海越2，庄洪兴2 Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells Cai Zhen1, Pan Bo2, Lin Lin2, Jiang Hai-yue2, Zhuang Hong-xing2 Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) are capable of multi-directional differentiation and exist in human processed lipoaspirate. However, no in-depth studies have addressed biological characteristics of adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) in vitro, and there are some disputes on the results from phenotype studies. OBJECTIVE: To investigate biological characteristics and phenotypes of human ADSCs. METHODS: Human adipose tissue was collected from persons undergoing fat extraction. The ADSCs were digested with collagenase, cultured and subcultured in vitro. Cell morphology was observed and growth curves were drawn. The phenotypes of ADSCs were identified by immunohistochemistry and flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION: ADSCs grew well, presented fibroblast-like growth. No significant change in cell morphology was detected within passage 15. The results from immunohistochemistry showed that cells were positive for CD29, CD44, CD105, but negative for CD34, CD45. Flow cytometry results have shown that cells were positive for CD29, CD44, CD105, MHC-Ⅰ, but negative for CD3, CD14, CD19, CD31, CD33, CD34, CD45, CD106, CD117, CD184. Results have suggested that ADSCs can be abundantly harvested and have stable proliferation in poorly differentiated status in vitro. Stem cell-related antigens were highly expressed in ADSCs. Cai Z, Pan B, Lin L, Jiang HY, Zhuang HX. Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(36): 6685-6688. [https://www.wendangku.net/doc/4f1893826.html, https://www.wendangku.net/doc/4f1893826.html,] 摘要 背景：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞，并表现出多向分化的潜能，但是关于其体外的生物学特性研究不够深入，其细胞表型的研究结果存在一定争议。 目的：观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型。 方法：取吸脂手术中废弃的人脂肪组织，胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞，体外传代培养，并进行细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型。 结果与结论：脂肪来源的干细胞生长旺盛，呈成纤维细胞样生长，15代以内细胞形态未见明显变化；免疫组织化学染色显示，细胞表面标记CD29，CD44，CD105表达阳性，CD34，CD45表达阴性；流式细胞仪检测显示，CD29，CD44，CD105，MHC-Ⅰ为阳性，CD3，CD14，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD106，CD117，CD184为阴性。结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛，高表达干细胞相关抗原，可长期传代且保持低分化状态。 关键词：表型；脂肪来源的干细胞；流式细胞仪；生物学特性；干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.36.008 蔡震，潘博，林琳，蒋海越，庄洪兴.脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(36):6685-6688. [https://www.wendangku.net/doc/4f1893826.html, https://www.wendangku.net/doc/4f1893826.html,] 0 引言 间充质干细胞是一群存在于身体各个组织内较原始的细胞，具有自我更新及多向分化潜能[1]，基于这些能力，间充质干细胞在其临床应用上有很大的潜力。自2001年Zuk证实了经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后[2]，脂肪来源的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)的概念得以明确，ADSCs因为其取材容易也被广泛研究。有研究表明ADSCs在体外培养中能迅速增长，累积细胞倍增数在第13代时仍无明显的下降趋势；更为重要的是细胞传至第10代时，仅有5%的细胞进入了细胞衰老期。因此ADSCs可以作为组织工程的种子细胞，成为具有广阔治疗应用前景。关于ADSCs的细胞表型研究，目前的研究结果没有得到统一的认定。本课题通过对ADSCs进行体外培养及对其体外生长的生物学性状及其细胞免疫表型做初步研究，为以后深入进行细胞组织工程的应用研究奠定了实验室基础。 1 材料和方法 设计：细胞体外培养与鉴定。 时间及地点：于2008-01/2008-06在中国医学科学院整形外科医院中心实验室完成。 材料： 实验标本：来自中国医学科学院整形外科医
脂肪干细胞文献调研
脂肪干细胞诱导成骨细胞研究进展 了解骨折愈合的机制？ 骨折愈合过程中的生长因子作用现代研究发现，与骨折愈合密切相关的生长因子可分为两类，一类为远距离细胞产生的丝裂素类，其功能与细胞增殖有关；另一类为局部产生，主要以旁分泌或自分泌方式发挥作用，促使软骨、骨原细胞分化成熟。 骨形态发生蛋白：是一类具有修复和调节作用的生长因子，其强大诱骨活性和能有效促进骨愈合的性能已为人熟知，这决定了它在修复骨质缺损和促进骨折愈合等的重要作用。不论成熟细胞内的骨形态发生蛋白起何作用，骨形态发生蛋白的生成肯定始于骨愈合过程初期．并极有可能诱导原始细胞分化为能形成软骨样和骨样组织的细胞。 转化生长因子?：骨内的转化生长因子?由骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞产生。成骨细胞所产生的转化生长因子?旋即被结合至骨基质中。骨内转化生长因子?的浓度高于其他组织约100倍，而成骨细胞具有高浓度的转化生长因子?受体。转化生长因子?对于调节骨形成有积极作用，但此作用甚为复杂。血管内皮生长因子：血管内皮生长因子先后表达于骨折断端骨外膜内层的间充质细胞、软骨细胞中及修复期骨小梁周围的成骨细胞，并可与碱性成纤维细胞生长因子共同刺激、调节血管形成，加速软骨的钙化及骨组织的改建过程。 骨折愈合中细胞外基质蛋白的表达及功能：能细胞外基质是骨和软骨的重要组成部分，主要由胶原和多种基质蛋白多糖组成。骨钙素由成骨细胞合成、分泌的一种基质蛋白，是准确反映成骨细胞活动的指标。 脂肪干细胞诱导 脂肪干细胞(ADSC) 具有多向分化潜能，在特定的诱导培养条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及神经细胞等组织细胞定向分化，甚至可将其定向诱导为心肌细胞、淋巴管内皮样细胞、内耳毛细胞、角膜细胞和肌腱细