血液样本核酸提取注意事项

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样本保存及预处理：

1. 血液样本通常保存在-20℃或-80℃低温保存，如果放置4℃建议不超过一个星期。哺乳动物的

红细胞里是没有细胞核的，所以首先要把红细胞裂解掉，然后再裂解白细胞提取基因组DNA ，一般采用100ul 以上的血液进行提取。

2. 血液的抗凝剂的选择：如果是用来做分子生物学实验的血液最好采用EDTA 、枸橼酸钠（也

叫柠檬酸钠），尽量不要采用肝素。

3. 冷冻的血液取出后37度速溶能有效避免DNA 在血液融化过程中的降解。

DNA 提取过程

1. 细胞裂解时要注意样本量和裂解溶液的量想匹配，确保样本充分裂解。如需两次CL 裂解，则

最好第一次加入的CL 的量多一些。例如600ul 血液一共加入1.5ml 的裂解液CL ，分两次建议第一次800ul 裂解液CL ，第二次700ul 裂解液CL 。

2. 加入裂解液CL 后要保证充分混匀。离心后沉淀应为淡粉色或白色沉淀。如果沉淀颜色较红，

则需再加入裂解液CL 进行裂解。

3. FG 和蛋白酶K 的混合液最好现用现配，样本加入该混合液后立即涡旋至无团块。

4. 水浴时期间适当混匀样本，以助于裂解。

5. DNA 使用异丙醇进行沉淀，常温的异丙醇即可，但冰冷的异丙醇更有助于DNA 的沉淀。

6. 溶液法的洗涤方式是使用70%的乙醇对沉淀洗涤，这里要注意加入乙醇后不是简单晃晃就行，

要让那个DNA 沉淀片漂浮在70%乙醇中，然后轻柔颠倒，这样才能充分对DNA 沉淀进行洗涤。洗涤后离心去除乙醇，然后晾干 DNA ，这里所说的晾干是指将乙醇挥发干净，而不是将水也弄干。如果核酸太干燥会很难溶解。

7. 紫外分光光度法是大家都熟悉的，如果我们使用的nanodrop 这种微量测定的就最简单了，加

入1、2ul DNA 原液就可以测值了。但现在很多实验室还是用传统的仪器，需要50-100ul 的溶液才可以测定，这样就需要将DNA 进行稀释然后测定。通常将离心柱法的稀释4-5倍，溶液法得到的DNA 稀释40-50倍。具体稀释多少倍要根据实验得到的DNA 而定，即稀释后的DNA 测OD260的值在0.1-1之间。纯度的公式为OD(260-320)/OD(280-320)，这里列出的是260-320比上280-320，其中OD320是溶液背景值，这样计算的比值更准确的衡量DNA 的纯度。浓度的计算是OD260的值乘以50ng/ul ，得率的话就再乘以稀释倍数。

8. 电泳检测核酸大家就更熟悉了，取2-5ul DNA 在0.7-1%的琼脂糖胶上电泳，观察电泳条带。高

质量的DNA 的电泳条带应该是清晰锐利的。如果出现拖尾现象，会考虑是基因组部分降解；如果加样孔里有很明亮的带，通常是蛋白污染。通过这两种方法我们就可以判断得到的DNA 的质量是否满足我们下游的实验。

核酸提取新技术

核酸提取新技术 核酸提取被用于许多分子生物化学试验和诊断，是克隆、转化、酶切、体外转录、扩增、测序等试验的第一个步骤。然而由于细胞内存在大量蛋白质、碳水化合物、原始样品中的代谢物以及其它污染物，提取高质量的核酸并非易事。现阶段的层析柱核酸提取方法有： 1、一种新的层析柱技术-双层柱技术 时间：2012年 人物： 美国科学家丁少峰教授和刘强教授 事件： 发明了一种新的层析柱技术-双层柱技术，以及基于该新双层柱的核酸提取方法，用来克服常用的基于硅胶提取和基于阴离子交换提取核酸两者的缺点，使核酸提取方法更加简单、快速、高效、可靠，特别是在血浆和尿液的液体活检中具有非常重要的应用价值13-14。 结构： 双层柱由2种膜组成：第一层为阴离子交换膜二乙胺（DEAE），第二层为二氧化硅膜 (Fig.1)。 原理： （1）样品中的核酸结合到第一层阴离子交换膜上，起核酸浓缩器的作用， （2）已结合的核酸从第一层膜洗脱, 然后结合到第二层二氧化硅膜, 这是因为采用了双功能洗脱/结合液, 也称为耦联液， （3）最终使用低盐缓冲液将游离核酸从第二层膜洗脱，获得目的产物 (Fig.2)。 优点: （1）特别适用于分离和纯化含有极度稀释的大容量的核酸样品，例如10mL血浆或50mL尿液； （2）游离的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常规硅胶提取法高出4倍, 适用于血浆及尿液游离核酸的提取； （3）不需要蛋白酶处理； （4）提供更高纯度和更少抑制剂的核酸样品； （5）洗脱的核酸可直接用于下游应用, 包括焦磷酸化激活的聚合反应（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization，PAP）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、及二代测序等； （6）此外，本方法快速、简便，无需接触苯酚及氯仿等毒性强烈的有机溶剂，无需复杂繁琐的实验操作，操作全程可在短时间内完成。 以下为常用的两种方法。

DNA电泳常见问题分析

DNA电泳常见问题 凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。 11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。 12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量 DNA电泳常见问题分析之一 1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？ 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。 一个让PAGE胶很快聚合的方法： 不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm

实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳

实验五核酸琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。

三、材料、仪器和试剂 1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA 2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统 3、试剂 （1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。 （2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。 （3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。 （4）分子量标准DNA：DNA Marker 四、操作步骤 1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的 2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料（10ml:1ul），混匀后小

琼脂糖凝胶电泳步骤

琼脂糖凝胶电泳步骤 实验前准备及注意事项： 将所要用到的制胶锥形瓶、胶槽、梳齿等物品清理干净，如有残胶，需将残胶尽量去除。 注意：所有用来跑核酸胶的物品，只要接触过核酸染料，一定要专门放置，专物专用，不要再将污染过的物品随意放置，以免污染其他物品。接触过核酸染料的手套不要再碰非污染区的物品。制胶和拿取核酸胶时佩戴一次性PE手套，再操作其他地方时将一次性手套丢弃。 实验步骤： 1.按每100ml 1×TAE/TBE缓冲液中加入1g琼脂糖（1%的胶，根据核酸大小选择制胶的浓度，一般情况用1%-2%的胶）的比例，称取琼脂糖，加入专门制琼脂糖凝胶的250ml-500ml的锥形瓶中。 2.按比例量取适量的1×TAE/TBE缓冲液，加入到锥形瓶中的琼脂糖一起，适当摇晃锥形瓶初步混匀。 3.将混合液放入微波炉中，用中高火加热，加热总时间可根据制胶总量调整，一般40ml左右的胶量加热90s左右。如果制胶量大，记得每加热1min左右将瓶从微波炉中取出，轻轻晃匀后，再继续加热，以免局部过热导致胶溢出。 注意：取出加热后的瓶时，记得垫上纸，防止烫手！ 4.待胶加热好，完全溶解后，稍晾凉至45-55℃左右（以基本不太烫手为宜）按照1:10000的比例加入核酸染料（如100ml胶加10ul染料），迅速摇匀。 5.将胶槽和梳齿准备好，梳齿可以预先插好，将上一步摇匀的胶倒入胶槽中，一般厚度以60mm左右为宜，具体要根据梳齿的厚度以及样品量来定。 6.待胶变白，基本表示胶已凝好，此时可以将梳齿拔出，一定要竖着往上拔梳齿，不要摇晃，以免样品孔被破坏。 7.在电泳槽中倒入1×TAE/TBE缓冲液，将制好的胶放入缓冲液，以缓冲液没过样品孔为宜。 8.点样：根据样品孔的大小决定上样量，每一排样品孔至少有一个孔用来点DNA Marker。（上样前确定每个样品和Marker里都已经加了Loading buffer，Loading buffer 的终浓度为1×） 9.确定样品孔的方向，核酸带负电，样品孔要在负极，通电后在胶孔中向正极移动。 10.接通电泳槽电源，一般设置电压为100-130V之间，具体可根据样品核酸的分子量以及凝胶的浓度调整，电泳时间一般以Loading buffer中最小的带不跑出凝胶为宜，具体时间要依据具体实验用途及样品大小决定。 分子量大的样品跑的速度相对慢，时间相对长。凝胶浓度高的，跑的速度相对慢，时间相对长。 11.扫胶，拍照。 注意：要先开白光，将胶放正，调整好位置和焦距等参数后，再开紫外适度曝光，最后拍照保存。 操作扫胶仪时注意佩戴一次性PE手套，操作电脑时注意不要佩戴核酸染料污染过的手套。

凝胶电泳及染色注意事项

GoldView GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5μl GoldView?即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。 由于未发现GoldView?有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。 概述 GoldView?是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA 时，GoldView?与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。 使用方法 1. 将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。 2. 加入5ul GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。 3. 冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。 4. 电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。 注意事项 1. 胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。 2. 加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。 3. 通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。 4. 虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参数

核酸提取的一些常规方法

1. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA原理是什么原理是什么原理是什么原理是什么？？？？乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。 最常用的阳离子：1）醋酸铵：贮存液10.0mol/L 终浓度 2.0~2.5mol/L 常用于减少多余的杂质（如DNTP及多糖）与核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸铵存在的情况下连续两次DNA沉淀可从DNA制品中除去>99％的dNTP。在通过琼脂糖酶消化琼脂糖之后沉淀核酸时，使用醋酸铵也是最佳选择，这种阳离子可以减少寡糖消化产物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸进行磷酸化时，就不要用醋酸铵沉淀核酸，因为铵离子能够抑制T4噬菌体多核苷酸激酶。2）氯化锂：贮存液8.0mol/L 终浓度0.8mol/L 常用于需高浓度乙醇进行的沉淀（如沉淀RNA）。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。小分子RNA（如tRNA及5S RNA）在高离子强度下（没有乙醇时）是可溶的，而大分子RNA则不溶。可以利用这个差异在高浓度LiCl（0.8mol/L)中纯化大分子RNA。3）氯化钠：贮存液 5.0mol/L 终浓度0.2 mol/L （0.2 mol/L）用于DNA样品中存在SDS时。这种去污剂在70％乙醇中仍为可溶。4）醋酸钠：贮存液 3.0mol/L（ph5.2）终浓度0.3 mol/L （0.3mol/L，ph5.2）在DNA和RNA的常规沉淀中最为常用。 2. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀DNA的区别是什么的区别是什么的区别是什么的区别是什么？？？？ 异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，如二楼所讲，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。 异丙醇沉淀核酸：优点：为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。 乙醇沉淀核酸：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍. 缺点是总体积较大。需在-20度放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤 “蛋白质的变性”是指蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。而引起蛋白质沉淀的原因一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，另一方面是因为这些有机溶剂是强亲水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程1

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA 带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。 8、如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。

核酸实验室使用注意事项

核酸实验室使用注意事项 1. 核酸实验室包括PCR前区（314试剂准备间、样本处理间、极低病毒载量处理间）和PCR后区（321病毒载量检测间、测序间；212 PCR扩增间、电泳间）。核酸实验室单向流程，即从PCR前区流向PCR后区，严禁任何物品返回。 2. 核酸实验室所有耗材和试剂由专人负责订购和领取，其中一次性耗材由胡园园负责领取，常规试剂及耗材由马鹏飞负责订购和领取，请在实验前做好计划。 3. 各室冰箱由房间负责人按照需求分配，实验过程中出现的仪器设备使用故障或疑问，请咨询相关房间负责人。 4. 所有核酸实验室的门把手严禁带手套接触。所有房间的自感应水龙头、洗眼器为洁净区，禁止戴手套操作。 5. 生物安全柜使用：先打开外排风机，然后接通安全柜电源，打开安全柜内风机电源，然后等待下降气流及排风量稳定后方可使用，使用安全柜前后请务必清理台面，结束后先关闭安全柜电源，然后在关闭外排风机。（安全柜内污物使用后及时清理）。 6. 污物处理：液体、固体分开处理，液体：废物放入提前加入指定量次氯酸钠的专用容器，固体：放入预先准备好的污物袋中。实验完毕后，将固体废物扎紧，液体废物盖好盖子，然后送至-1层高压间。 7. 实验室的工作服严禁穿出该实验室。 8. 试剂准备间（负责人李喆）：用于PCR体系配置及PCR试剂存放，严禁任何样本和核酸（如PCR模板或产物）带入该室。 9. 样本处理间（负责人苏俊琪），用于核酸提取及样本处理，处理血样样本时需要带双层乳胶手套，并做好相应防护措施。 10. 极低病毒载量处理间（负责人马鹏飞），严禁与实验无关人员进入该实验室。 11. 病毒载量检测间（负责人马鹏飞）：用于病毒载量检测。

核酸提取仪如何选择及常见误区

核酸提取仪如何选择及常见误区 伴随着大健康基因检测时代的来临以及分子生物学技术的大发展，核酸是分子实验最基本的模板，如何选择一款合适的核酸提取仪就成为了分子实验室最关心的事情，很多人容易陷入选择误区，下面举例说明最常见的二种选择误区： 误区一、核酸提取仪和工作站的区别及选择误区 很多工作站的厂家在推销工作站的时候经常和客户说，工作站提核酸是全自动的，而核酸提取仪是半自动的，客户也主观认为工作站可以移液，提取，什么都能干，好像只要把样本放进去，什么都不用管就可以得到想要的核酸了，等到工作站到位的时候发现，实际情况并不是那样，不仅没想象中的那么好，甚至连基本的提取核酸都困难，那么原因是什么呢？ 第一个问题，开盖问题，采血管、唾液保存管、二维码冻存管等的盖子结构都不一样，大小也不一样，厂家也不一样，工作站如何自动化开盖？这个问题就解决不了。 第二个问题，条码录入问题，条形码和二维码，还有一些手动贴的标签和手写的标签，所以扫码还是手动为主，很难自动化。 第三个问题，加液自动化，工作站可以实现自动加试剂，好像是个优势，但是加一个96深孔板需要花15~30分钟左右的时间，而提取一般需要六种试剂，也就是六个板子，大约1.5小时时间，提取试剂很多含有高浓度的乙醇，这么长时间，乙醇浓度会发生改变，影响提取效率和灵敏度，再说了，很多提取仪的厂家（比如百泰克，百源基因等）都有配套预装试剂盒，不需要加液，自动加试剂这个功能就是个鸡肋。提取仪加自动移液工作站的配置就是个套路，通常见某飞公司为了弥补没有预装试剂盒的缺陷，而给客户做的方案。 第N个问题，工作站提取核酸还要解决比如加热，震荡，混匀，磁吸等等问题，每个都是一个模块，你先确定你买的工作站有没有这个模块，还要考虑震荡是否能达到充分混匀的效果，磁珠回收率的问题，有没有配套试剂盒的问题，仪器编程是否简单以及是否有应用工程师能帮你优化提取条件等等问题，毕竟提取高质量的核酸不仅仅需要硬件还需要试剂配套和程序优化。

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操 作流程 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子

的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。

法医实验室几种常用DNA提取方法及比较

法医实验室几种常用DNA提取方法及比较 (一)Chelex100法 原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。 方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml 离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。 评述： Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。目前，我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。 Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR 反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。 清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。检材参考加入量 0.5×0.5cm血斑150ul-200ul 二步法精斑100ul 毛根10ul 烟头30-50ul 对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一段时间，补加适量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。 5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。 6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。 7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH应在10—11之间，否则应丢弃，不应人为调整Chelex100悬液pH值。 (二)有机法 原理：有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质分子表面带有亲水性基因，很容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液中，形

五种核酸提取仪的比较.doc

五种核酸自动提取仪的比较 厂家产品名称原理通量及工作效率配套耗材样品混匀模式得率及分析样本裂解单个样品样本是否需要预 方式提取成本处理 (人民币 ) BioTeke IAUTOMAG核酸磁珠法32 通道通用的毫升震荡混匀，底部高于离心柱方组织块直10-15 元不需要提取仪深孔板，可独立控温，紫外法接加入，不 以处理更高灭菌需要预先 容量样品研磨过夜 消化 ABI MAGMAX24 磁珠法24 通道毫升微孔无加热模块，低需要样品20-30 元预消化 5 小时或 板，不能处预先研磨者过夜 理体积大样过夜消化 品，专用耗 材价格昂贵 Eppendorf 5075 VAC 核酸分负压法不96 通道，只配套无加热模块，不负压法易导致需要样品20-30 元预消化 5 小时或

离纯化工作站适合提取Eppendorf 能自动提取组96 孔某些孔预先研磨者过夜 组织，会96 孔板及移织，粘稠样品，液体残留，洗过夜消化 堵液用枪头，所以叫分离纯脱不完全，洗 耗材成本高化工作站，而不脱效率低于离 是提取仪心法和磁珠法 Thermo Kingfisher 只有 8个24 通道（微孔板，容只配套专用加热模块单配，试剂需要手工需要样品20-30 元预消化 5 小时或固定的程量 200ul ）或者 15 通耗材，使用无法全自动提加，裂解需要预先研磨者过夜 序组，只道(微孔管，容量微孔板（酶取全血、组织等借助外部裂过夜消化 能通过电1000ul) ，只能处理少标板）微孔需要蛋白酶 K裂解，提取效果 脑编辑输体积样品，管，耗材成解的样品，所以低于离心柱法 入本太高叫磁珠分选纯 化仪，而不是核 酸自动提取仪， 选配加热模块 价格极高

DNA电泳常见问题分析

D N A电泳常见问题分析 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

DNA电泳常见问题 凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、?凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、?电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、?样品加入量：一般情况下，宽的梳子可加μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5、?DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 6、?DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

核酸电泳的注意事项

核酸电泳的注意事项 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3. 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 回收率低或为零 1. 漂洗缓冲液中没加入乙醇.在使用前应确保乙醇已加入漂洗液PW中。 2. 吸附材料上有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，因含乙醇会降低洗脱效率。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。 3. 洗脱缓冲液pH值偏低.DNA只在低盐buffer中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。 4. 洗脱液加入位置不正确.洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大洗脱效率。 DNA质量不好 洗脱产物含有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程凝胶电泳操作注意事项： 1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA 的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。

核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法(DOC)

核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法 50×TAE Buffer (pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。 10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。 10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer 组份浓度200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。

2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.再向溶液中加入下列试剂。 5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。 注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。 溴乙锭(10 mg/ml) 组份浓度10 mg/ml溴乙锭 配制量100 ml 配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。 注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。 Agarose凝胶 配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×TBE或1×TAE)。 2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。 3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。 注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。 4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂 糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。小心摇动锥形瓶。使琼脂 糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波

核酸PAGE电泳方法

玻璃板处理 6％的聚丙烯酰胺凝胶属于DNA测序胶，胶厚度仅为0.4mm，从玻璃板上玻璃后难以进行后续的显色操作，因此，必须对玻璃板进行硅烷化处理。在对玻璃板硅烷化处理之前，必须采用温水和洗涤剂将玻璃板彻底洗干净，先以自来水冲去洗涤剂，再用去离子水反复冲洗几遍，晾干或烘干。 长玻璃板的处理： A.带PE手套，将洗好的长玻璃板采用95％擦洗2～3次，晾干。用镜 头纸蘸取亲和硅烷溶液少许（A4纸大小的玻璃板用150-200 μl），涂 布在长玻璃板的一侧，整块板涂布均匀，不能有死角。 B.4～5 min后，用95％的乙醇洗长玻璃板3次，以去除多余的亲和硅 烷，待用。 短玻璃板（上部带有凹槽）处理： A.更换PE手套，将洗好的短玻璃板采用95％擦洗2～3次，晾干。用 镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（A4纸大小的玻璃板用1-1.5 ml），涂 布在短玻璃板的一侧，整块板涂布均匀，不能有死角。 B.5～10 min后，用干净镜头纸擦去多余的剥离硅烷，待用。 注意事项：在玻璃板的处理过程中，处理好的玻璃板一侧应该做好标记，保持干净。长短玻璃板分开处理，及时更换PE手套避免交叉污染。最后，玻璃板的硅烷化处理应该在通风橱中进行。 凝胶制备 在制胶台上固定好玻璃板，保持水平。制备6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，一块胶的配方如下： 5 × TBE 1 6 ml 尿素（分析纯）33.6 g 40％的丙烯酰胺12 ml ddH2O 补足至80 ml 0.25 μm 滤膜过滤，灌胶前加入10％过硫酸铵（APS）800μl，四甲基乙二胺（TEMED）100μl，充分混匀，水平灌胶。灌胶完成后倒插梳子（鲨鱼齿朝外）封口，水平放置过夜。