植物谷胱甘肽还原酶的生物学特性及功能_林源秀

谷胱甘肽含量测定

【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计 2.实验试剂 还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液；蒸馏水。 3.实验材料 小麦叶片 【实验步骤】 1.标准曲线制作 取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。 试管号 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 10μg/ml GSH标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 pH7磷酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度μg/2ml 0 1 2 4 6 8 10 2.提取 取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。 3.测定 取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。 显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。 4.计算 GSH含量（μmol/g）=（C x×V t）/ （FW×V S） 式中，C x为2ml样品中GSH的含量（μg）；V t为样品提取液总体积（ml）；V s为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。 【实验结果】 1.标准曲线 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 GSH浓度（μg/2ml）0 1 2 4 6 8 10 吸光度值A 0 0.067 0.134 0.314 0.452 0.579 0.723 以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。

谷胱甘肽还原酶检测试剂盒简介

谷胱甘肽还原酶检测试剂简介 谷胱甘肽还原酶的作用： 一、谷胱甘肽还原酶（GR）在人类细胞中具有极其重要的生理功能，广泛存在于人体肝、肾、心红细胞、单核巨噬细胞等组织细胞中。它可及时地清除人体代谢过程中产生的氧自由基（OFR），是维持细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的主要黄素酶。对保护肝细胞膜完整具有非常重要的作用意义。 在《临床肝病实验诊断学》和《临床检验诊断解析》中明确标示，血清谷胱甘肽还原酶活性测定可用于协助诊断肝脏疾病，血清谷胱甘肽还原酶活性上升可以辅助诊断肝炎、肝硬化、梗阻性黄疸及相当数量引发的肝肿瘤。原发性肝细胞癌和广泛转移性肝肿瘤时，血清谷胱甘肽还原酶活性明显升高，急性病毒性肝炎或中毒性肝炎中度升高，而肝硬化是血清GR轻度升高。 二：检测谷胱甘肽还原酶的临床意义 1、急性肝炎早期阶段，血清谷胱甘肽还原酶敏感性最高，可用于肝损的早期检测； 2、急性肝炎患者GR比转氨酶更早增加达到峰值，早早期肝脏损伤判断的首选指标； 3、GR有助于判断亚临床DILI，提高临床DILI的诊断率 4、不同于ALT和AST在肝细胞膜破裂和线粒体破裂时才能检测出来，GR填补肝细胞受损早期自我修复阶段至破裂进程中诊断的空白，将更有利于早期肝炎的诊断和治疗

三、临床解读： 谷胱甘肽和谷丙、谷草在化验单上的具体解读，谷胱甘肽的血清血浆正常值是33-73U/L，共有四种情况。 1、谷胱甘肽指标升高，谷丙和谷草指标正常，提示有肝损伤的风险，建议加强对肝脏的检测频率，有利于发现早期肝损伤。 2、谷胱与谷丙，谷草同时升高，提示进入肝损伤爆发期，建议临床治疗措施干预。 3、谷胱甘肽升高，谷丙、谷草下降，提示正在进行肝损伤修复，可以结合三者评估临床治疗情况。 4、当三者都出现下降，情况有两种极端提示：（1）是修复完成，临床好转。（2）是重型肝炎出现严重情况，出现胆酶分离现象。 另外一种是红细胞的检测，正常值4.7-13.2U/gHb 红细胞主要针对“蚕豆病”和遗传性伯氨喹溶血病人，谷胱甘肽还原酶降低，红细胞的细胞膜容易被氧化和分解，导致溶血性贫血和溶血性黄疸。

谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)活性测定试剂盒说明书

货号：QS1111 规格：50管/48样 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0 mL蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入850μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，充分混匀，于340nm 处测定10 s和190 s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入750μL试剂一，100μL试剂二，100μL上清液，50μL 试剂三，充分混匀，于340nm测定10 s和190 s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管= A 测1﹣A测2。 注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： 第1页，共2页

谷胱甘肽含量测定

植物生理学模块实验指导 玲主编 科学 还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法） 【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计 2.实验试剂 50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na 2 -EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶 解稀释至100ml。再称取186mg Na 2-EDTA·2H 2 O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。 0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。 0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。

谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展

动物医学进展,2008,29(10):53-56 Pr ogress in Veterinary Medicine 文献综述 谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展* 马森 (武夷学院化学系福建省高校绿色化工技术重点实验室,福建武夷354300) 摘要:谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽转硫酶(GST)是一对抗氧化酶。GSH-Px为含硒半胱氨酸,至少有4种同工酶,催化还原H2O2和有机氢过氧化物。GST不含硒,有多种同工酶,不能分解H2O2,但具有清除过氧化物和解毒的双重功能。二者广泛存在于组织细胞、红细胞、血浆和乳中,与细胞损伤、缺氧、中毒、衰老、多种疾病的发生有关;GSH-Px活性也与机体硒水平密切相关。文章综述了GSH-Px 和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展。 关键词:谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽转硫酶;研究进展 中图分类号:Q554.6文献标识码:A文章编号:1007-5038(2008)10-0053-04 谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathione pero xidase, GSH-Px)于1957年由M ills从牛红细胞中发现,分子结构中含硒,故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px),是体内清除H2O2和许多有机氢过氧化物的重要酶。1976年,Law rence等发现组织中还存在一种不含硒的GSH-Px,命名为谷胱甘肽转硫酶或不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathio ne-S-tr ansferase,GST或on-Se-GSH-Px),在体内具有清除过氧化物及解毒的双重功能。文章对GSH-Px和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展进行了阐述。 1分类与结构 从人和动物组织或细胞中提纯的GSH-Px,分子质量为76ku~95ku,为水溶性四聚体蛋白,4个亚基相同或极为类似,每个亚基有1个硒原子。目前发现GSH-Px至少有4种同工酶,其在机体中的分布、亚基结构、一级序列和酶学特点上有显著不同。第1种为细胞谷胱甘肽过氧化物酶(cGPx),主要分布在组织细胞的细胞区、线粒体和红细胞中,催化还原H2O2和有机氢过氧化物,对各类氢过氧化物都有较好的催化作用。第2种为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(PH GPX),主要分布在各种组织细胞外的细胞液内,部分分布在细胞膜上,主要还原磷脂过氧化氢、脂肪酸过氧化氢和甾体过氧化氢, PH GPX是必需的生物膜组成成分,可阻止生物膜非专一性的磷脂过氧化。第3种为血浆谷胱甘肽过氧化物酶(pGPx),主要分布在血液中,既能还原磷脂氢过氧化物又能还原H2O2。第4种为消化系统谷胱甘肽过氧化物酶(GIGPX),高表达于胃肠道黏膜上皮细胞。牛红细胞GSH-Px有178个氨基酸,第35位是1个硒半胱氨酸。在其亚基结构中有4处A-螺旋和4处B-折叠。整个酶分子中,4个亚基处在一个平面,具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子表面凹穴的活性部位,易于接触有机氢过氧化物等底物。后者虽然不溶于水,但由于活性基团周围存在一些疏水性芳香环氨基酸残基,形成脂溶性底物可进入的疏水区域,可以与硒半胱氨酸反应,从而使GSH-Px显示很高的反应性。GST是分子质量40ku~50ku的二聚体蛋白质,随着亚基的不同组合而有多种同工酶,如哺乳动物的GST分为A, L,P,H,R等5类水溶性GST,另外还有一类是脂溶性的微粒体同工酶。随着对GST的深入研究,新GST种类不断被发现。已确定了上述5种主要的酶家族中至少一个成员的三维结构,这些结构都具有包括两个结构域的基本蛋白质折叠。大鼠肝胞浆GST是由Ya、Yb、Yc3种不同亚基组合成的YaYa、YcYc、YaYc、YbYb等同工酶,亚基的分子质量为22.5ku~25ku;大鼠肝微粒体GST的亚基分子质量却为14ku;不同来源的GST中氨基酸组成可能有差异,分子质量常不一致[1-5]。 *收稿日期:2008-05-04 基金项目:福建省教育厅/乳谷胱甘肽过氧化物酶研究0项目(JB03266) 作者简介:马森(1947-),男,青海西宁人,教授,主要从事动物生理生化研究。

谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione） 谷胱甘肽(glfftathione)是由Hopkins发现并命名，1929年Hopkins及Kendall等各自独立的发现其为含有甘氨酸的三肽。谷胱甘肽化学名为：N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，即N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione，GSSG)。通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，是由r一谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质，它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。 1 GSH的理化特性 谷胱甘肽分子量为307．33，熔点189～193℃(分解)，晶体是无色透明细长柱状(板状)，等电点(PI)为5.93，成品见光易分解，易氧化，谷胱甘肽分子中有一特殊的6-肽键，即由谷氨酸的6-COOH与半胱氨酸的a-NH：缩合而成，这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中Q-COOH和另一个氨基酸中α-NH2失水缩合而成的肽键显然不同。由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化，2分子还原型谷胱甘肽(简称GSH)，脱氢以二硫键-S-S-)相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG)，所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类，在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。 2 GSH在自然界中的分布 谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中(Wierzbicka等，1989)，主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的谷胱甘肽。在动物细胞中还原型谷胱甘肽水平达5mmol／L，而氧化型仅为0．1mmol／L，细胞内高水平的GSH对动物机体维持正常机能是十分重要的。据测定，谷胱甘肽在未加工的肉中含量是50～200mg／kg，在新鲜水果和蔬菜中的含量是50～150mg／kg，干燥酵母中含有约．15％的谷胱甘肽，在乳制品、谷物和熟食品中含量较低。 3 GSH的代谢过程 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。进入血液循环的GSH可被一些组织直接吸收入细胞，也可被组织细胞膜上的r-谷氨酰转肽酶(rGT)降解为r-谷氨酰氨基酸(氨基酸来自细胞外液中的游离氨基酸)和半胱氨酰甘氨酸，而后被二肽酶降解为半胱氨酸和甘氨酸或以二肽的形式转运到细胞内后再被降解为半胱氨酸和甘氨酸。大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的r-GT和二肽酶活性，它们是清除循环系统中GSH的主要器官。在细胞内，GSH的组成氨基酸在r-谷氨酰环化转移酶、r-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化下生成谷胱甘肽。GSH的合成通过其自身对r-谷氨酰半胱氨酸合成酶的反馈抑制来调控。肝脏是体内合成GSH的主要场所。细胞内的谷胱甘肽在谷胱甘肽硫转移酶(GST)的催化下，可与细胞内外产生的活性亲电子基、有机氢过氧化物(x)结合成GSH-S-复合物，经一系列反应生成N-乙酰-Cys-(x)后运出细胞而排出体外。GSH清除细胞内自由基、过氧化物、ROOH的同时，2分子的GSH转变为GSSG，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GR)作用下由NADPH供氢还原为GSH。上述反应形成r-谷氨酰循环。由于猪肾脏中的r-GT与肝脏中的r_GT活力比较低，因此对于猪，肝脏和胆管分支在GSH周转中起重要作用。 4 GSH的生物学功能 谷胱甘肽的生理功能十分广泛，其主要功能有：(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉毒素等毒物；(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；(3)利于铁的吸收、硒的吸收、钙的吸收，谷胱甘肽还可以使饲料中的过氧化脂肪酸在吸收时或吸收后恢复为正常的脂肪；(4)保护胃肠道黏膜上皮，防止因炎症、局部缺血、氧化物质等对肠黏膜的损伤；(5)贮存并提供其组成氨基酸(1尤其是半胱氧酸)；(6)参与蛋白质和DNA的合成;(7)作为还原物质，利于维生素E、维生素c的还原，维持巯基酶活性，并可作为甘油醛磷酸脱

谷胱甘肽过氧化物酶

谷胱甘肽过氧化物酶 开放分类：医学植物生理学 ?目录 ?图片 ?讨论 ?知识魔块 分享完善词条 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。NADPH的减少量则和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。GSH-Px主要包括4种：分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。 编辑摘要 谷胱甘肽过氧化物酶- 简介

谷胱甘肽过氧化物酶 GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2 O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。 谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。 谷胱甘肽过氧化物酶- GSH-Px酶系 主要包括4种不同的GSH-Px，分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、 胞浆GSH-Px

由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。 血浆GSH-Px 构成与胞浆GSH-Px相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关。 磷脂过氧化氢GSH-Px 是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化。 胃肠道专属性GSH-Px 是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。谷胱甘肽过氧化物酶- 正常值 (1)酶速率法(37℃)：2.96～83U/g?Hb

总谷胱甘肽检测试剂盒(DTNB速率比色法)

总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB 速率比色法) 简介： 谷胱甘肽(glutathione ，GSH)存在于几乎身体的每一个细胞，参与细胞许多功能活动，是一种氧自由基消除剂。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，能可逆的转变为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其存在形式会随着细胞内代谢的情况而发生相互转变。 总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB 速率微板法)(T otal Glutathione Assay Kit)是一种简单易行的检测总谷胱甘肽(T-GSH)的试剂盒，其检测原理是谷胱甘肽还原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，由GSSG 还原成的GSH 和样品本身含有的GSH 都与发色底物DTNB 反应，生成黄色的TNB 和GSSG 。该试剂盒可用于检测血浆、血清、组织、细胞等样品中总谷胱甘肽(T-GSH)含量。该试剂盒仅用于科研，不用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制GSH 标准储存液：取10mg 还原型谷胱甘肽(GSH)标准加入3.25ml ddH 2O ，溶 解并混匀，即为还原型GSH 标准储存液(10mM)。一部分立即使用，其余适当分装后-20℃保存。 2、 配制50×GSH 还原酶：按GSH 还原酶原液：GSH assay buffer =1:49的比例混合， 即为50×GSH 还原酶。-20℃保存，3个月有效。 3、 配制T-GSH 检测工作液：按下表配制T-GSH 检测工作液。 1个样品 10个样品 50个样品 GSH assay buffer 1.6ml 16ml 80ml DTNB 储存液 5μl 50μl 250μl 编号 名称 TO1049 100T Storage 试剂(A): 还原型谷胱甘肽(GSH)标准 10mg 4℃ 避光 试剂(B): GSH assay buffer 250ml RT 试剂(D): 蛋白沉淀剂 4g RT 避光 试剂(E): NADPH 10mg -20℃ 避光 试剂(F): DMSO 1.5ml RT 避光 试剂(G): ddH 2O 50ml RT 避光 使用说明书 1份

总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB速率比色法)

总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB速率比色法) 简介： 谷胱甘肽(glutathione，GSH)存在于几乎身体的每一个细胞，参与细胞许多功能活动，是一种氧自由基消除剂。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，保护组织细胞免受氧化损伤，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，故常简写为G-SH或GSH，易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、铅、汞、砷等)等结合，具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。谷胱甘肽是研究活性氧和自由基的重要指标，亦是机体氧化物牵累的重要指标。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，能可逆的转变为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其存在形式会随着细胞内代谢的情况而发生相互转变。 总谷胱甘肽(T-GSH)检测试剂盒(DTNB速率比色法)(Total Glutathione Assay Kit)是一种简单易行的检测总谷胱甘肽(T-GSH)的试剂盒，其检测原理是谷胱甘肽还原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，由GSSG还原成的GSH和样品本身含有的GSH都与发色底物DTNB反应，生成黄色的TNB和GSSG。前后两个反应合并起来，总谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相当于一个呈色的限速反应，总谷胱甘肽(T-GSH)含量决定了黄色含量，通过分光光度法(分光光度计)检测吸光度，与相应处理的GSH标准比较，获得样品的总谷胱甘肽(T-GSH)即(GSSG+GSH)含量。可用于检测血浆、血清、组织、细胞等样品中总谷胱甘肽(T-GSH)含量。该试剂盒仅用于科研，不用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料：编号 名称TO1049 100T Storage 试剂(A): 还原型谷胱甘肽(GSH)标准10mg 4℃避光试剂(B): GSH assay buffer 250ml RT 试剂(C): DTNB 40mg RT 避光试剂(D): 蛋白沉淀剂4g RT 避光试剂(E): NADPH 10mg -20℃避光试剂(F): DMSO 1.5ml RT 避光试剂(G): ddH2O 50ml RT 避光试剂(H): GSH还原酶原液90μl -20℃避光使用说明书1份

氧化型型谷胱甘肽(Glutathione Oxidized,GSSG)含量测定试剂盒使用说明

氧化型型谷胱甘肽（Glutathione Oxidized,GSSG）含量测定试剂盒使用说明货号:BC1180常量法50T/48S 一、试剂盒组成： 试剂Ⅰ液体1瓶50ml（4℃保存） 试剂Ⅱ液体1支170l（4℃保存） 试剂Ⅲ液体1瓶60ml（4℃保存） 试剂Ⅳ液体1瓶8ml（4℃避光保存） 试剂Ⅴ粉剂4℃保存，用前8ml蒸馏水溶解 试剂Ⅵ液体1支40l用前0.8ml蒸馏水稀释 标准品粉剂1mg（4℃避光保存） 说明书一份 二、实验原理 氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH,因此机体中大多数是以还原型方式存在。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长412nm处具有最大光吸收的特点，通过2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将GSSG还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。 三、实验仪器 分析天平、微量匀浆器（规格2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计、1ml比色皿。 四、操作步骤 1、样品的处理

组织处理 新鲜组织首先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。加入用试剂Ⅰ润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1ml试剂Ⅰ（组织/试剂Ⅰ比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。 血液处理 血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂Ⅰ,4℃，8000g离心10分钟,将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。 血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的PBS 清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积试剂Ⅰ，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。 细胞处理 收集不少于108个细胞，首先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入3倍细胞沉淀体积的试剂Ⅰ重悬细胞，反复冻融2-3次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。 2、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 3、试剂Ⅱ放置37℃（哺乳动物）或25℃（一般物种）水浴中保温30min。 4、标准品的稀释：将标准品用1ml蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为1mg/ml。取适当溶液配制浓度为25g/ml、20g/ml、12.5g/ml、6.25g/ml、3.125g/ml、0g/ml的标准品（试剂Ⅰ十倍稀释后进行稀释）。 5、取1.5ml离心管，加入100L稀释好的标准品或样品，加入2L试剂Ⅱ，混匀后37℃孵育30分钟。

谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定试剂盒说明书

货号：MS1111 规格：100管/96样谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1 支，4℃保存。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入170μL试剂一，20μL试剂二，10μL试剂三， 于340nm 测定10s和190s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入150μL试剂一，20μL试剂二，20μL上清液， 10μL试剂三，于340nm测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管=A测1﹣A测2。注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1). 按蛋白浓度计算 第1页，共3页

谷胱甘肽的功能

谷胱甘肽的功能 谷胱甘肽以两种状态存在，还原型（GSH）和氧化型(GSSG)。还原态时，半胱氨酸的巯基能给其他不稳定分子一个还原当量，比如活性氧。给出一个电子后，谷胱甘肽自己变得活泼，所以轻易地就能和其他活性谷胱甘肽反应形成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。由于细胞内谷胱甘肽含量相当高（在肝脏里高达5mM），使得这种反应可能发生。GSSG能被谷胱甘肽还原酶还原，再次生成GSH。 在健康的细胞和组织中，90%以上的谷胱甘肽以还原态（GSH）存在，剩下不足10%的以氧化态（GSSG）存在。GSSG/GSH的比例升高是氧分压升高的标志。 谷胱甘肽有多个功能： ●它是由细胞产生的主要内源性抗氧化剂，直接参与自由基和活性 氧化合物的中和，同时保持外源性抗氧化剂比如维生素C和E以还原态（活性状态）存在。 ●控制NO的循环，NO循环对生命来说是至关重要的，如果没被控 制就会出问题。 ●它被用于代谢反应和生化反应中，比如DNA的合成和修复、蛋白 质合成、前列腺素的合成、氨基酸运输和酶的激活。所以，体内的任何系统都能被谷胱甘肽系统的状态影响，特别是免疫系统、神经系统、胃肠道系统和肺。 在动物体内的功能 在共轭反应和还原反应中，GSH被认为是其酶作用底物，在细胞

溶质、微粒体和线粒体中被谷胱甘肽S转移酶所催化。然而，它同样能和一些化学物质参与无酶共轭。 对于N-乙酰对苯醌亚胺（NAPQI）的情形，当GSH由于过量服用退热净（对乙酰氨基酚）而耗尽时，活性细胞色素P450----由扑热息痛（在美国称为退热净）形成的活性代谢物----就会变得有毒，这时候，谷胱甘肽对于用药过量就是一种重要的解毒剂。谷胱甘肽和NAPQI共轭以将其解毒。在这种情况下，它保护细胞蛋白的巯基，否则巯基就会被共价性的改变；当所有的GSH被耗尽时，NAPQI开始和细胞蛋白反应，在这个过程中，杀死细胞。对付过量服用这种止痛药的常用疗法是使用N-乙酰-L-半胱氨酸（通常是喷成雾状），它被细胞加工处理成L-半胱氨酸，并且用于GSH的重新合成。 谷胱甘肽（GSH）参与白细胞三烯的合成，并且作为谷胱甘肽过氧化酶的辅助因子。作为一种重要的亲水性分子，在那些亲脂性的代谢物和毒物成为胆汁的一部分之前，GSH就经肝脏的生物转化作用被加入到那些有毒物质和代谢物中。谷胱甘肽同样对于甲乙二酰的去毒很有必要，甲乙二酰是一种代谢副产物。 这个解毒反应是由乙二醛酶系统执行的。乙二醛Ⅰ型酶（EC4.4.1.5）催化甲乙二醛和还原性的谷胱甘肽转化成S-D-丙醇酰谷胱甘肽。谷胱甘肽Ⅱ型酶（EC3.1.2.6）催化S-D-丙醇酰谷胱甘肽水解成谷胱甘肽和D-乳酸。 谷胱甘肽最近在美容品产业中被用作一种黑色素的抑制剂。在一些像日本、菲律宾的国家，这种产品被卖做美白皂。在酪氨酸酶和左

谷胱甘肽的简便测定法

谷胱甘肽的简便测定法 药物分析杂志 2000年第1期第20卷研究简报 作者：赵旭东魏东芝万群俞俊棠单位：赵旭东魏东芝万群俞俊棠（华东理工大学生物反应器工 程国家重点实验室上海200237） 关键词：谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB 摘要：目的：建立一种快速简便测定谷胱甘肽的新方法。方法：样品1式2份，pH 8.0条件下分别和甲醛反应2 min和60 min，各取1 mL加入5 mL DTNB溶液，25 ℃反应5 min后分别测定在波长412 nm的吸光度，算出2者的差值ΔA，代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。结果：谷胱甘肽浓度在0.19～0.95 g·L-1之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，最大误差不超过6%。结论：方法成本低廉，简单易行，特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析。 A Simple Method for Rapid Determination of Reduced Glutathione Zhao Xudong Wei Dongzhi Wan Qun Yu Juntang （State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Biochemistry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237）

Abstract：Objective：A new simple method for rapid determination of reduced glutathione in the presence of other thiols is developed based on the reactions of formaldehyde with glutathione and interefering substances.Method:After each aliquot of two same samples reacts with formaldehyde for 2 and 60 min respectively, 1 mL of each solution is added to 5 mL DTNB and reacts for 5 min at 25 ℃. The absorbance is measured immediately at wavelength 412 nm. The difference between two absorbance(ΔA=A2 min-A60 min)is calculated, concentration of glutathione can be obtained from standard curve.Result:There is a good linearity between 0.19 to 0.95 g·L-1 glutathione. Regression equation:Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，maximum deviation is less than 6%.Conclusion:The method is cheap, simple, practicable and is applicable to assay of reduced glutathione in the presence of other interefering substances. Key words：glutathione, formaldehyde, cysteine, DTNB▲ 谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸组成的天然三肽，用途广泛。利用基因工程微生物生物合成方法是生产谷胱甘肽的主要方式。作为前体之一，半胱氨酸的浓度较高，对谷胱甘肽的测定有干扰。已有几种方法用于半胱氨酸存在时谷胱甘肽的测定：酶分析方法［1，2］可测高达1 000倍半胱氨酸存在时谷胱甘肽的含量，结果较准确，但需价格昂贵的辅酶Ⅱ和谷胱甘肽还原酶，并且后者活力变

谷胱甘肽化学与酶法合成

谷胱甘肽化学法和酶法合成 1 化学性质 谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）分子式为C10H17N3O6S，分子量为307.32348，熔点为189~193℃，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为5.93。GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型GSH占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。 图1 GSH的结构式 2 药理作用 GSH可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。 3 谷胱甘肽的生产方法 1888年，GSH首先从酵母中分离出来。日本1983年进行了含量较多的GSH 酵母的生产，其后又研究了GSH提取、分离技术及分析检测方法。目前国外实现了GSH规模生产。世界主要的氨基酸制造商Kyowa，Aji-nomoto和Degussa 等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa 1998年氨基酸的研究与开发就耗费达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供应商。目前GSH的主要生产方法有：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。 3.1萃取法 萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从GSH含量比较高的动植物组织中将GSH分离提取的一种方法，GSH的早期生产都是采用萃取法，是生产GSH的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。其工艺路线如下图：

图2 GSH发酵法工艺路线图 该方法的不足：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。 3.2酶法 在酶催化合成GSH中，几种关键的化合物和条件包括：GS HⅠ和GS HⅡ、氨基酸原料(L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸)、ATP、保持GS HⅠ和GSHⅡ活性所必需的辅因子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。合成中，需求大量ATP，给GSH的工业化生产带来麻烦，大大提高了GSH生物合成的成本，所以只能寻求一个ATP生成系统来藕联ATP消耗系统。两种系统同在一种生物体内的称为自藕联系统，在多种生物体内的称为共藕联系统。自藕联系统研究的比较少，因为很难找到一种生物体同时含有ATP生成系统和ATP消耗系统。 Murata等人发现酒酵解菌(s.cerevisae)中的葡萄糖是最简单的ATP生产系统之一，可以提供足量的ATP用来GSH的生物合成。酶催化法合成GSH的浓度可以达到99/l，但是所用的氨基酸原料比较贵，提高了GSH生物合成的成本。 3.3发酵法 生物发酵法是利用廉价的糖作为原料，利用微生物体内物质的代谢途径来合成GSH的方法。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此微生物发酵法已成为目前GSH工业化生产的最普遍方法。在工业上，生物发酵法一般都选用s.eerevisae和Candidautilis为原料进行发酵。 一般情况下，微生物细胞中GSH含量不高，仅为细胞干重的0.1~1.0%。过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境，GSH是胞内产物，实际生产过程中需要进行提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量。二者的有机结合将有利于GSH产量的大幅度提高。

谷胱甘肽的化学与医疗作用

谷胱甘肽的化学与医疗作用 卢　薇 (江苏职工医科大学　南京　210029) 摘要　谷胱甘肽(glutathione,GSH)在体内以氧化型(GSSG)和还原型(GSH)2种形式 存在。GSH分子中的巯基容易失氢氧化,因而可以消除体内的活性氧,具有保护酶和蛋白 质免受氧化,保护脏器免受损伤的功效。人工合成的GSH已广泛用于临床。 关键词　谷胱甘肽　活性氧　酶　解毒作用 谷胱甘肽(glutathione,GSH)是体内最早发现的天然的游离三肽,普遍存在于动物组织中,如肝、肾、心肌、脾、肠、脑和红细胞等,细胞内浓度为0.5mmol/L～10mmol/L;血浆内浓度仅1μmol/L～5μmol/L,约为细胞内浓度的千分之一。 GSH是由谷氨酸(G lu)、半胱酸(Cys)和甘氨酸(G ly)组成的非蛋白巯基化合物,含有γ-羧基形成的酰胺键,其化学结构及合成反应如图1。 2分子GSH脱氢氧化成为GSSG,后者又可通过磷酸戊糖代谢通路中所产生的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和GSH还原酶的作用,还原成GSH。 还原型谷胱甘肽分子中最重要的结构是巯基(-SH),-SH容易失氢发生氧化,因此,GSH可以保护一些含-SH的蛋白质及酶免受氧化剂的损害;同时,-SH中的氢容易被自由基提取,如下式所示: -SH+?R-S?+HR　因而具有清除自由基的能力。 还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽在细胞内维持一定的比值(GSH/GSSG=100/1),GSH的含量随年龄、营养状况及内分泌的不同而变化,如甲状腺机能低下或肝脏疾病、药物中毒等情况下会引起GSH水平降低。GSH/GSSG保持稳态关系对维护组织细胞、多种蛋白质、酶的结构及其功能有重要意义。 1　谷胱甘肽的生理功能 1.1　清除体内的过氧化物及自由基 GSH可在含硒过氧化物酶(GSHpx)的催化下将体内有害的过氧化物、自由基(O2-?、HO?)加以化解和清除,如下式所示: 2GSH+ROOH GSHpx GSSG+2ROH ROOH和自由基不仅氧化某些具有重要生理作用的含巯基的酶和蛋白质,使之丧失活力,而且还将细胞膜磷脂分子中多不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物;而生成的过氧化脂质又通过自身的催化连续生成大量过氧化物,因此GSH通过自身氧化能中止脂质过氧化的连锁反应。