转基因中的BT毒蛋白
转基因中的BT毒蛋白，草甘膦，植物癌症病毒启动子（花椰菜花叶病毒启动子），一个可以毒死虫子蜜蜂和麻雀，一个可以使寸草不生，另一个有可能会激活启动人体内休眠的癌基因，这三样东西，一样比一样肮脏，做到粮食中去，就是食物中的毒雾霾，其危害不知道要比空气中的雾霾要大多少倍。
病毒外壳蛋白
病毒外壳蛋白（CP）基因的介绍 来源：中国烟草在线摘自《烟草与生物技术》作者：发表时间：2003-9-19 中国烟草在线摘自《烟草与生物技术》1929年麦克纳研究发现，当一种弱侵染性病毒侵染烟草后在一定程度上能抵挡其它强病毒侵染，也就是说植物经病原物诱导后可产生一定的抗性。植物由此获得的抗性被称之为诱导抗性。后来的研究证明：病毒的外壳蛋白在交叉保护现象中起着关键性作用。而且两种病毒之间的外壳蛋白成分及结构越相似，交叉保护作用就越强。 美国科学家Beachy根据交叉保护的机制，设计出将病毒的外壳蛋白基因引入植物基因组的抗病毒基因工程方案。1986年，他们将这一设想付诸实施，并成功地获得了抗TMV的转基因植株。具体做法是：将TMVU1植株的RNA分离出来，通过反转录酶将RNA反转录成cDNA，克隆其中一段编码病毒外壳蛋白的cDNA，在这一段cDNA的5′末端接上一个很强的植物启动子（CaMV35S），然后通过Ti质粒体转化系统将这一嵌合基因整合到烟草基因组内。用类似的方法将TMV外壳蛋白基因导入番茄，所的结果与上述相仿。大田试验表明，在接种TMV后，转基因番茄只有5%植株得病，因此番茄产量未减；而作为对照的非基因番茄约99%得病，产量损失达26%～35%。经美国农业部同意，这些转基因番茄已进入大田试验。这一结果为植物抗病毒基因工程展示了十分诱人的前景。从此，利用病毒外壳蛋白基因抗病毒的方法被迅速用于其他感病毒植物。 到目前为止，已克隆了包括TMV、TRV（烟草脆裂病毒）、CMV（黄瓜花叶病毒）、SMV（大豆花叶病毒）、ALMV（苜蓿花叶病毒）、RSV（水稻Stripe病毒）、PVX（马铃薯X病毒）及PVY（马铃薯Y病毒）在内的至少10种病毒的外壳蛋白基因，并成功地转入烟草、番茄、马铃薯、大豆及水稻等寄主植物中，所获得的转基因植株都具有阻止或延迟相关病毒病害发生的能力。我国在这一领域也取得了一些可喜的成就。北京大学蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验室分离出造成我国烟草生产重大损失的病毒，将其外壳蛋白基因转入香料烟品种，获得了抗病的优质香料烟品种。 转病毒外壳蛋白植物有以下特点：第一，外壳蛋白基因在植物中可稳定遗传；第二，对病毒的抗性具有特异性，即能抵抗与提供外壳蛋白基因的“供体”亲缘较近的病毒，而对亲缘关系较远的病毒不具抗性；第三，抗病毒能力与外壳蛋白基因在转基因植物体内的表达量成正比。 关键词：病毒外壳蛋白基因反转录基因重组基因工程 互补DNA：信使RNA(mRNA)分子的双链DNA拷贝 两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子.因此,双链cDNA分子的序列同转录产生的mRNA分子的基因是相同的.所以一个cDNA分子就代表一个基因.但是cDNA仍不同于基因,因为基因在转录产生mRNA时,一些不编码的序列即内含子被删除了,保留的只是编码序列,即外显子.所以cDNA序列都比基因序列要短得多,因为cDNA中不包括基因的非编码序列---内含子.
沉淀蛋白质的常用方法
沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙 酮沉淀蛋白操作步骤） TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet:
dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration
病毒基因的转录、蛋白质、感染与宿主和干扰素合成
第三节病毒基因的转录及蛋白质合成 一、病毒基因的转录启始信号 (一)DNA噬菌体基因的启动子 l T噬菌体基因的启动子与转录双链DNA噬菌体基因组表达都是分阶段进行的，即噬茵体基因组在复制循环过程中分阶段地进行转录。T系列噬菌体当其基因组DNA进入宿主大肠杆菌细胞后，宿主细胞中RNA聚合酶将一小段病毒DNA转录成mRNA，开始合成早期蛋白，所以宿主细胞的RNA聚合酶能够识别早期蛋白质基因的启动子。但是事实上所有T噬茵体早期基因的启动子的结构都与其宿主大肠杆菌基因的启动子有很大差别。虽然早、晚期基因在转录起点上游都具有相当于细胞基因—10框的序列，但相似程度很低，而且各个基因的启动子之间都存在明显的差别。T噬菌体的中、晚基因都由噬菌体基因编码的RNA聚合酶转录，这种酶只有一条多肽链．比宿主细胞的RNA聚合酶简单。但噬茵体基因转录除了需要这种RNA聚合酶以外，还需要其他一些转录辅助因子．由于辅助因子很复杂，其特性还不知道。 2．单链DNA噬菌体基因的启动子有关单链DNA噬茵体基因的启动子目前知道得不多。 （二）真核生物DNA病毒的启动子 1．腺病毒基因的启动子腺病毒所有早期基因都由宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ转录，其中EIA基因可能是最早表达的早期基因，因为它是与其他早期基因转录有关的一个关键基因。EIA基因在转录起点上游—28位具有TA—TA框，这种序列同宿主基因启动子相似，虽然在这一区域的上游不存在结构保守序列，但这一区域缺失后会严重降低EIA基因的转录水平，因此它可能对转录起着某种程度的调节作用。EIA基因编码长289个氨基酸的磷蛋白，是其它任何早期基因转录所必需的。腺病毒的中、晚期基因由宿主细胞的RNA 聚合酶Ⅲ转录，但也有一些编码mRNA的晚期基因同早期基因一样由RNA聚合酶Ⅱ转录。对这些中、晚期基因的转录机制目前还不很清楚，但现在对其中一个主要的晚期基因(ML)和一个与其相连的中期基因(Iva2)的启动子了解比较清楚。这两个顺反子的转录方向相反，ML基因在转录起点上游有—个TA—TA—框，而中期基因则不具有这种结构。 2．SV40基因的启动子及其转录SV40的早期基因在病毒的侵染循环过程中始终如一地表达，而晚期基因只是在病毒开始复制后才表达。当病毒侵人宿 主细胞核或完全脱去蛋白质外壳后，宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ从早期基因的惟一的一个启动子开始转录，产生2种编码大、小T抗原的mRNA。当这些mRNA被翻译后，大T抗原
浓缩蛋白方法
1，透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外 即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入 温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 主要用于更换蛋白质的缓冲液，有透析袋即可，不需要特殊的仪器。 2，冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 在冷冻状态下让扬品种的液体升华 3，吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。4，超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法更不易引起变性，不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的。 5，凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液 需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 6，浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能 吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。 浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比凝胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓 缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 7，丙酮沉淀法： 试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。 8，免疫沉淀法： 通过免疫沉淀法，用蛋白质特异性能够定量能够分离目的蛋白。有三个步骤组成：首先将特异性抗体加入细胞提取物，第二步加入经化学固定的金黄色葡萄球菌，以确保形成大量沉淀。这些细菌通过蛋白质A和抗体形 成复合物，蛋白质A与免疫球蛋白的Fc部分有高度的亲和性。或者说，纯化的蛋白A结合Sephrarose树脂，为从细胞提取物中分离出抗原抗体复合物，提供一个固体基质。最后通过洗脱，除去尚未沉淀的杂质。 为了除去已破碎的或固定差的细胞，在用于免疫沉淀（作用）之前可以与纤细地金黄色葡萄球菌细胞，如果要用蛋白质ASephrarose树脂,参考厂家说明书。 9，硫酸铵沉淀法： 利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析），选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济. 10， (低温)有机溶剂沉淀法： 强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮等。注意：Mg2+离子，pH值。 11，聚乙二醇（PEG）沉淀法： PEG是一个水溶性非离子多聚体，使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀。
蛋白纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
抗病毒蛋白
抗病毒蛋白（12种） (Antiviral protein) 摘要：病毒进入机体后，能刺激人体的巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞产生干扰素。干扰素具有广谱抗病毒作用，是抗病毒免疫中重要的蛋白质，它能诱生抗病毒白蛋白来阻止新病毒的产生。但在机体内还存在着其它很多种具有抗病毒作用的的蛋白质，在抗病毒免疫中发挥重要的作用。本文就主要介绍了其它种类的抗病毒蛋白。 关键字：抗病毒蛋白;作用机制 Abstract: After the virus enters the body, wich can stimulate macrophages, lymphocytes and cells to produce interferon.which is the important proteins that can induce an antiviral albumin to prevent the generation of new viruses with broad-spectrum antiviral activity. However, in vivo there is a w variety of other proteins that having antiviral activity and play an important role in anti-viral immunity.This article introduces the other types of anti-viral proteins. Key Word: antiviral protein; mechanism of action 一、干扰素（Interferon,IFN） 1、干扰素的分类 病毒进入机体后，能刺激人体的巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞产生干扰素。干扰素具有广谱抗病毒作用。根据干扰素产生的来源和结构不同，分为I型干扰素（IFN-α和IFN-β）和II型干扰素（IFN-γ）。IFN-α、IFN-β和IFN-γ，分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生。 I型干扰素：是许多不同的细胞对病毒应答时产生的细胞因子，保护临近细胞不受病毒感染，其合成受病毒或细菌感染所诱导，在抗病毒感染的先天防御中发挥重要作用。 II型干扰素：是由Th1细胞和NK细胞产生的多功能细胞因子，抗病毒，增强巨噬细胞和PMN细胞的吞噬功能，激活巨噬细胞。 表1 干扰素的分类 I型（IFNα/β）II型（IFNγ） 起源所有有核细胞，尤其是成纤维细 胞、巨噬细胞和树突状细胞NK细胞和Th1，γδ和CD8细胞 诱导物病毒、其他细胞因子、某些细胞内 细菌和原生动物 抗原刺激的T细胞 功能抗病毒、增加MHCI类表达、抑制 细胞增殖抗病毒，增加MHCI类和II 类表达，激活巨噬细胞 2、抗病毒作用机制 干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（A VP）发挥效应。在正常情况下，基因处于静止状态，干扰素的产生受到抑制。如有病毒感染或非病毒性诱生剂（如人工合成的双链聚肌胞，Poly I:C）作用于细胞膜上，激活干扰素编码基因，即开始转录干扰素的mRNA，再转译为干扰素蛋白。因此诱生的干扰素很快释放到细胞外，作用于邻近的未受感染的细胞膜受体系统，该系统由神经节苷脂组成的结合位点和一个可能由糖蛋白组成的激活位点所组成。当IFN与受体结合后，产生一种特殊的因子，使抗病毒蛋白（AVP）基因解除抑制，转录并翻译出A VP，主要是蛋白激酶、2’-5’A合成酶、磷酸二酯酶，这些酶与
BT毒蛋白
"Bt毒蛋白"中的"Bt"是细菌"Bacillus thuringiensis"的缩写。"毒蛋白"是其产生的一种伴胞晶体，有时也称为"delta-endotoxin"，即学术刊物中中文所对应“delta 内毒素”。“毒”是指其对特定的物种有毒性，并非对所有的生物体都有毒性。而且不同的Bt菌系产生的毒蛋白的特异性也不同。 bt毒蛋白的研究(5张) Bt基因对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟、稻青虫等8种水稻鳞翅目害虫具有较高的抗性,是应用最为广泛和最有潜力的毒蛋白基因，其能杀虫的原因在于该基因能使转基因株系合成一种对昆虫有毒的内毒蛋白，Bt菌系含有大量不同的杀虫晶体蛋白编码基因。自1981年第一个杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序以来，至今已有近180个不同的Bt杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序，并被广泛应用于水稻抗虫改良方面的研究。 编辑本段作用机制 我们常说的Bt毒蛋白一般指的是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)产生的杀虫活性成分，Bt菌的杀虫活性成分主要有两类，分别为杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein，VIP）。其中，杀虫晶体蛋白，ICP，由于其对于靶标害虫特异性强，对人畜安全等优点，现已成为世界上研究最深入，应用最广泛的抗虫基因。ICP本身并不具备毒性，生物实验也验证了其对动物无害。当ICP被目标昆虫取食后，在昆虫中肠的碱性环境中ICP会被降解为具毒性的活性肽，并与昆虫中肠道上皮纹缘膜细胞上的特异受体相结合，引起细胞膜穿孔，破坏细胞渗透平衡，最终导致昆虫停止取食而死亡
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析之令狐文艳创作
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 令狐文艳 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。
第五讲 蛋白质遗传
第五讲蛋白质遗传 第五讲蛋白质遗传 一、朊病毒－－感染性蛋白质 二、朊病毒的繁殖 三、朊病毒是细胞中的非孟德尔遗传因子 四、朊病毒的遗传标准 五、朊病毒蛋白质（PrPSc）－－蛋白质基因 六、朊病毒中有一个独立的prion决定域 七、消耗性蛋白与遗传性蛋白 八、作为细胞结构的“蛋白质复合体”的遗传 一、朊病毒－－感染性蛋白质 二、朊病毒的繁殖 三、朊病毒是细胞中的非孟德尔遗传因子 四、朊病毒的遗传标准 五、朊病毒蛋白质（PrPSc）－－蛋白质基因 六、朊病毒中有一个独立的prion决定域 七、消耗性蛋白与遗传性蛋白 八、作为细胞结构的“蛋白质复合体”的遗传 羊瘙痒症：早在18世纪，这种疾病就在欧洲的一些国家流行。患病的羊由于奇痒无比，在树上或其他物体上用力摩擦，致使毛皮脱落，故称为瘙痒症。以羊瘙痒症的发病机制的研究为契机，人们开始注意到蛋白质遗传。 真正对阮病毒一词的提出是在1982年。意指可转移性海绵样脑软化病的蛋白质病原体，它能引起羊瘙痒病、疯牛病、鹿、猫、水貂等的海绵样脑软化病，更严重的是能引起人的震颤病、克雅氏病和吉斯综合症等 症状：脑组织的海绵样化、空泡化，星形胶质细胞和微小胶质细胞的形成以及阮病毒蛋白的积累，致使个体无免疫反应，产生认知和运动功能的严重衰退直至死亡。 已经证实人的震颤病、克雅氏病和吉斯综合症和羊瘙痒症是同一类蛋白质病原体感染的疾病，这些疾病通称为传染性海绵样脑软化病。患者脑子病区因神经组织的大量丢失及囊泡化而呈海绵样，并存在大量的淀粉样蛋白沉积。这种沉淀是一种片层的蛋白质纤维结构，其基本的分子结构就是后来发现的阮病毒分子。 阮病毒是一种非DNA/RNA的传染病原，其分子结构完全不像已知的细菌、真菌、寄生物、类病毒和病毒等那样以所含的核酸为遗传物质，它是一种蛋白质病原体，称为阮病毒蛋白 1、朊病毒的分子结构与特性 2、朊病毒基因及其表达 3、朊病毒的感染途径 一、朊病毒－－感染性蛋白质 被阮病毒感染的病体中发现有一种特殊的蛋白质，是一种传染性的抗蛋白酶的、分子质量为27-30kDa的蛋白质，称为PrP27-30。 PrP27-30是一种侵染性且不含核酸的蛋白质，是构成阮病毒的基本单位。但是， PrP27-30本身不具有侵染性，而由3个PrP27-30分子构成的“阮病毒颗粒”具有高度侵染性。 PrP27-30还能聚集成杆状颗粒，约由1000个PrP27-30构成的这种杆状体总是排列成丛，杆和丛都有传染性。 阮病毒有17种，246个氨基酸组成。 它包括两种形式：正常的细胞型（PrPc）和异常的病原型（PrPsc）。
沉淀蛋白质地常用方法
沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） 2010-08-18 15:19 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Acetone Precipitation To eliminate acetone soluble interferences and protein concentration
转Bt毒蛋白基因
转Bt毒蛋白基因 摘要：介绍Bt毒蛋白基因、Bt毒蛋白及其在生产实践中的应用和几种基因技术，以增强对现代分子生物学的理解。 在农业生产中，虫害是造成作物减产的主要原因之一。人们为了提高产量，减少害虫对农作物的破坏，经常使用农药。农药可以用来杀灭昆虫、真菌和其他危害作物生长的生物。最早使用的农药有滴滴涕、六六六等，它们能大量消灭害虫。但它们的稳定性好，能在环境中长期存在，并在动植物及人体中不断积累，对人和动物造成危害，为此被淘汰。后来改用有机磷农药，如敌敌畏等，替代最初的农药。然而它们的毒性太大，对人畜也有很大危害。而且，磷一旦进入水体，易造成富营养化，对生态环境有很大的影响。随着现代分子生物技术的发展，人们找到了一种新的方法来减少虫害，即转基因技术。 转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。人们运用这种技术，将苏云金芽孢杆菌（Bcillus thuringiensis，Bt）中可以产生杀虫晶体蛋白的基因片段导入农作物，使这些作物具有杀虫能力。 苏云金芽孢杆菌是一种分布广泛的革兰氏阳性土壤细菌，在形成芽孢的同时会在菌体的一端或两端形成伴孢晶体，即杀虫晶体蛋白。伴孢晶体被敏感昆虫幼虫吞食后，在肠道碱性环境和蛋白酶作用下释放出的毒性肽与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合形成离子通道，破坏细胞渗透平衡，使细胞肿胀破裂，最终导致昆虫死亡。其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目和膜翅目等多种重要的农林业害虫都具毒杀作用。前人研究已发现，基因Cry1, Cry2和Cry9可产生能特异性杀死鳞翅目昆虫的晶体蛋白；基因Cry3, Cry7和Cry8能产生特异性杀死鞘翅目昆虫的晶体蛋白；Cry4和Cry11可以产生特异性杀死双翅目昆虫的晶体蛋白。 泰国农业大学的Anon Thammasittirong和Tipvadee Attathom通过PCR技术，检测了泰国当地的苏云金芽孢杆菌中杀虫晶体蛋白基因。这篇文献中，两位科学家运用PCR技术对泰国不同地区，不同生态环境的134种苏云金芽孢杆菌菌群进行了杀虫晶体蛋白基因序列的检测。并将得到的结果与前人所做的进行了对比。 两位科学家先将菌株在37摄氏度条件下，在天然培养基琼脂平板上培养16小时。然后将一环菌体转移到3ml的LB培养基中，震荡培养一夜。之后将其两次离心，上清液加入到苯酚中再进行离心。再经过氯仿、乙醇、TE缓冲液等的处理，最后得到进行PCR测定需要的DNA。 PCR，即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。它由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。用其将分离的DNA反复进行高温变性、低温退火及适温延伸等，最终得到杀虫晶体蛋白的基因序列。 由前人研究已知基因Cry1, Cry2和Cry9对产生特异性杀死鳞翅目昆虫的晶体蛋白是必须的。通过PCR检测，分析得到的三种基因的分布频率与其他的研究相比较多。两位科学家分析认为这是由于他们使用的探针不同所致。研究结果还得到了基因Cry1的不同亚型的分布频率。以及基因Cry2的分布频率，并发现，其在
有机溶剂蛋白质沉淀
蛋白质纯化方法 蛋白质浓缩有多种方法，有盐析，超滤，离子交换，有机溶剂沉淀等方法。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。医学教育`网搜集整理有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。
蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 （一）透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 （二）冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 （三）吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。 （四）超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 （五）凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 （六）浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
bt蛋白一剂被误解的毒药
Bt蛋白，一剂被误解的毒药 Bt蛋白，能毒杀害虫，那它是否…可能……肯定……绝对……能毒杀人类。 一个疑问，变成一个假设，再变成一个结论，最终变成一个真理。 Bt蛋白，就在这样的流言蜚语中，变成了一剂可怕的毒药。Bt是什么？ Bt，不是变态，更不是变天。Bt是Bacillus thuringiensis两个单词首字母的缩写。Bacillus thuringiensis是拉丁文，一种细菌的名字，中文名是苏云金芽孢杆菌。 细菌是微生物。微生物像江湖中的异士，各怀绝技。微生物充斥着这个星球的每一个角落，像黑暗中的幽灵。Bt就是这样一个杀人……哦，不……杀虫于无形的死亡幽灵。 时间回到115年以前。 1901年，日本科学家石渡（Ishiwata）发现一种家蚕在病死前，突然停止食桑，全身颤抖，很快侧倒死亡，因而命名为猝倒病。 为了一探究竟，他把家蚕开腔破肚，发现肠道糜烂，死得痛苦。石渡倍感震惊，什么毒药竟然比三笑逍遥散还阴狠，能
让家蚕穿心断肠，瞬间毙命？他从肠道中发现了罪魁祸首，是一种细菌，一个恐怖的死亡幽灵，像三尸脑神丹一样，撕咬着家蚕的肠胃。 十年之后，1911年，德国科学家Ernst Berliner在地中海粉斑螟患病幼虫中也分离出了这种细菌。但是，给这个死亡幽灵取一个什么特别的名字却让他伤透了脑筋。最终，他可能从南京小笼包、 兰州拉面中获得了灵感，这个细菌是在德国一个叫苏云金的地方发现的，因此就命名为苏云金芽孢杆菌。 从此，苏云金芽孢杆菌走向了历史的舞台，掀起了一场农业革命。 Bt蛋白是什么？ 1938年，苏云金芽孢杆菌在法国正式成为商品，用于防虫治虫。现在，市场上仍然有苏云金芽孢杆菌杀虫制剂销售。这种杀虫剂是纯天然的，所以它伺候过的蔬菜、水果一般都被标上有机、绿色、放心等字样，卖着不菲的价格。 可惜的是，苏云金芽孢杆菌杀虫制剂生产成本较高，价格较贵，无法大规模使用。 苏云金芽孢杆菌很有意思，胞内有个巨大的晶体，像钻石一样，有的是菱形，有的是圆形，因此很形象地被命名为伴胞晶体。不过，伴胞晶体只是一种蛋白质，不像河蚌体内的珍珠那样是一种宝石。