用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定
文章编号: 1007-6611(2007)07-0577-04
用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT72COPS3的构建及鉴定
苏海川1, 赵玉红2, 陈 军1, 张 伟3, 李陕区13 (1第四军医大学唐都医院中心实验室, 西安 710038;
2第四军医大学基础部免疫学教研室; 3第四军医大学基础部微生物学教研室; 3通讯作者,Tel:(029)84777161,E2 mail:cuc4@https://www.wendangku.net/doc/4b3368243.html,)
摘要: 目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交G AL4系统的诱饵载体p G B KT72COPS3,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。 方法 运用RT2PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP29607中扩增出COPS3基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,插入酵母双杂交诱饵载体p G B KT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。 结果 成功获得COPS3基因片段,其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用。 结论 可以利用酵母双杂交G AL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。
关键词: 基因,COPS3; 酵母双杂交系统; 报告基因
中图分类号: Q781 文献标识码: A
Construction and identif ication of b ait vector pGBKT72COPS3for screening COPS3interaction protein
SU Hai2chuan,ZHAO Yu2hong,CHEN J un,et al(Cent ral L aboratory,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical U niversity, Xi’an710038,China)
Abstract: Objective To construct bait vector p G B KT72COPS3in yeast two2hybrid system G AL4,and explore whether expression product of COPS3has toxicity to host yeast cells and activates the reporter genes in the yeast two2hybrid system. Methods The COPS3gene fragments were amplified by RT2PCR from SOSP29607,and cloned into pUC19for DNA sequencing.After verified by sequencing,it was subcloned into the bait vector p G B KT7of yeast two2hybrid system G AL4,and the recombinant plasmid was trans2 ferred into yeast cell AH109.The activation of expression product to the reporter genes was tested in the yeast two2hybrid system.
Results The COPS3gene fragments were successfully amplified,and the expression product had no toxicity to AH109cells,and could not activate the reporter genes of the G AL4system. Conclusion Y east two2hybrid G AL4system can be utilized to study COPS3interaction protein.
K ey w ords: genes,COPS3; yeast two2hybrid system; reporter genes
酵母双杂交系统是-种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方法,具有灵敏度高和特异性好的优点。自1989年由Fields等提出并初步建立以来,得到了不断的完善和改进,在细胞生物学、肿瘤学等诸多领域有着广泛的应用[1]。COPS3是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalo2 some,CSN或含JAB1“J un2activation domain binding2protein1”的信号复合体)的第三个亚基,而COP9信号复合体是植物光形态发生的一个负调节子[2]。在大约50%的高度恶性骨肿瘤样本中可以检测到COPS3的扩增和过表达[3]。我们拟利用酵母双杂交G AL4系统,构建COPS3诱饵载体并在酵母菌中从人骨肉瘤SOSP29607cDNA文库中钓取可与之结合的蛋白基因,为研究细胞凋亡COPS3在骨肉瘤发生发展中的作用提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料 人骨肉瘤SOSP29607细胞系为唐都医院全军骨肿瘤研究所杨彤涛博士建立,本室保存;诱饵表达载体p G B KT7及酵母菌种AH109购自Clontech公司;质粒pUC19由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室张伟博士惠赠;逆转录酶, PCR试剂盒,DNA重组所用的限制性内切酶购自Takara公司;T4DNA连接酶购自G ibco公司;质粒提取试剂盒,DNA电泳胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司;酵母培养基购自Clontech公司。1.2 方法
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30672384),陕西省科技计划项目(2005K09-G12)
1.2.1 RT2PCR扩增COPS3基因 根据G enebank中COPS3cDNA序列,设计一对引物,上游引物:5′-GG AATTCATGG CGTCTG CCCTGG AG CAGTT-3′,下游引物:5′-GG ATCCG AG AAT AA CTGG ATGGTTTG2 TTTCCT-3′。在上、下游引物5′端分别加入Eco RI和Bam HI位点,以便于克隆。引物由上海博亚生物有限公司合成。常规培养SOSP29607细胞,提取细胞总RNA,20μl逆转录反应体系含5μg总RNA,4μl R T 缓冲液,50pmol/L Oligo(d T),1pmol/L dN TPs, 011pmol/L D TT,15U RNA酶抑制剂(Ta KaRa), 200U MLV(Invitrogen),于65℃水浴5min,冰浴5min,37℃水浴60min,70℃15min终止反应,所得cDNA-20℃保存备用。以所制备COPS3cD2 NA为模板进行PCR反应扩增,反应体系为:dN TP 1μl,Taq酶1μl,引物1.5μl,10×Buffer2μl,加H2O补足至体积20μl。反应条件为:94℃45s,57℃45s,72℃90s,进行35个循环,72℃继续延伸5min。取10μl PCR产物琼脂糖凝胶电泳,紫外观测仪观察结果并按试剂盒说明回收目的片段。
1.2.2 R T2PCR产物克隆及鉴定 纯化的R T2 PCR产物经Eco RI和B am HI双酶切,定向克隆入pUC19质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行蓝白筛选。酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆,命名为pUC192COPS3,然后进行序列分析。
1.2.3 构建及鉴定诱饵载体 用Eco RI和
B am HI酶切pUC192COPS3和表达载体p G B KT7,回收COPS3基因及p G B KT7载体片段,载体片段与COPS3基因连接后转化大肠杆菌DH5α。经限制性内切酶分析,含正确插入片段的克隆命名为p G B KT72COPS3。
1.2.4 制备酵母感受态细胞 随机挑取几个酵母菌AH109克隆,接种于50ml YPDA液体培养基中,振荡培养至A600为0.4-0.5。在室温下将培养液离心,弃上清,重悬沉淀,洗涤酵母细胞,再离心取沉淀,用1.5ml1×TE/LiAc溶液重悬,即为酵母感受态细胞。
1.2.5 转化酵母感受态细胞 将构建好的诱饵载体,鲱鱼精DNA和酵母感受态细胞,混匀后加入016ml PEG/LiAc溶液。在30℃振荡培养,加入DMSO后混匀,在42℃水浴15min,冰浴2min,离心,弃上清,以0.5ml1×TE重悬细胞后,铺于SD/ -Trp平板。于30℃培养36h,直至带有诱饵载体的酵母克隆长出。
1.2.6 HIS3和LacZ报告基因表达的检测 用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆,分别划线于有Trp,Ura,His,Leu营养缺陷的SD平板上,于30℃培养36h,观察酵母菌的生长情况。采用β-半乳糖苷酶印膜法检测LacZ报告基因的表达。用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆,点样于硝酸纤维素滤膜上,将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5s 后,置于室温裂菌。将点有菌体的滤膜面朝上,
放在另一张同样大小浸有Z buffer/X2gal的Whatman #1滤纸上,去气泡,于30℃孵育30min-8h,观察颜色变化。
2 结果
2.1 COPS3基因的扩增 采用逆转录方法对人骨肉瘤细胞SOSP29607总RNA进行逆转录,然后在20μl反应体系中继续扩增反应。取R T2PCR扩增产物10μl,在10g/L琼脂糖凝胶中电泳,可见与预期大小一致的1269bp左右的片段(图1)。
2.2 重组质粒pUC192COPS3的酶切鉴定及测序 用Eco RI和B am HI双酶切pUC19质粒及PCR 产物,回收pUC19载体片段及COPS3基因片段,连接后获得的重组质粒命名为pUC192COPS3。再用Eco RI和B am HI对pUC192COPS3质粒进行酶切鉴定(图2)。鉴定正确的pUC192COPS3重组质粒
分别作正反向测序,测序结果经与G enbank 中的COPS3序列(AF098109)比较分析表明,扩增得到的COPS3基因片段与原序列完全相符。
2.3 重组质粒p G B KT72COPS3的酶切分析 分别用Eco RI 和B am HI 将COPS3基因片段从质粒pUC192COPS3亚克隆入p G B KT7载体,重组质粒p G B KT72COPS3的酶切鉴定结果如图(图3)
。
2.4 HIS3报告基因表达的检测 将AH109和含
有p G B KT72COPS3质粒的酵母菌AH109单个菌落挑出,分别划线接种于有Ura ,Trp ,Leu 和His 营养缺陷的SD 平板上,30℃培养36h 后,可见单纯
AH109酵母菌只在SD/2Ura 平板上生长,而含有p G B KT72COPS3质粒的AH109酵母菌可以在SD/2Ura 和SD/2Trp 平板上生长,在SD/2His 和SD/2Leu 平板上不生长,结果如图(图4)。
2.5 LacZ 报告基因表达的检测 将pCL1质粒转
化入AH109作为阳性对照,将p G B KT72Lams 和p G AD T72T 质粒共转化入AH109作为阴性对照,用β-半乳糖苷酶印膜法来检测含p G B KT72COPS3质粒的AH109酵母细胞内LacZ 报告基因的表达情况。结果显示LacZ 报告基因不被COPS3激活(图5,见封3)
。
3 讨论
酵母双杂交技术是近十几年发展起来的研究蛋白质-蛋白质相互作用的一种方法,其基本原理是:一些转录激活因子(如酵母的G al4蛋白和细菌的LexA 蛋白),往往由两个在结构上可以分开而在功能上又相互独立的结构域构成,这两个结构域只要在同一细胞内能够彼此靠近,就可以激活下游报告基因的表达[4]。如果将诱饵蛋白融合到一个结构域上,而将表达文库构建到另一个结构域上,就可以筛选到与诱饵蛋白相互作用蛋白的基因。酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法。对于未知功能的蛋白质,如能钓到与之相互作用的已知蛋白,将对其功能的研究具有明确的指导方向。将诱饵蛋白融合到G al4蛋白的一个结构域上以后,利用此融合蛋白
去筛选构建在另一个结构域上的表达文库之前,就必须要验证融合到一个结构域上的诱饵蛋白本身对下游的报告基因有无激活作用,否则便会在cD2 NA文库筛选时出现假阳性结果。张伟等[5]就报告用HBV Pres与Pres1构建的酵母系统有自激活作用,这样便不能直接用于cDNA文库的筛选。我们用含有COPS3基因的重组质粒转化酵母菌,通过不同方法对报告基因的表达进行检测,结果表明COPS3基因不具有自激活作用,这样我们就可以直接利用COPS3作为诱饵,从人骨肉瘤细胞系SOSP2 9607cDNA文库中钓取与其相互作用的蛋白。
作为COP9信号复合体的第三个亚基,COPS3功能和效应机制尚不明确。近年来的研究发现染色体17p的扩增与p53位点的杂合子丢失、p53等位基因缺失以及各种肉瘤的发生发展有密切关系[6,7]。Van Dartel等[8]对于骨肉瘤中17p的扩增和过表达状况进行了深入研究,发现染色体17p11. 22p12区域隐含有多个LCRs(low2copy repeats),位于此区域内的COPS3,PMP22以及3个ESTs的扩增和过表达高频率出现在高度恶性的骨肉瘤中。并且在高水平扩增和过表达COPS3的样本中,通常伴随p53基因表达产物降解和p53基因突变或缺失,从而导致基因组的不稳定(genomic instability)。Henriksen等[3]在其检测的23例骨肉瘤标本或骨肉瘤细胞系中有15例样本中未发现p53基因突变,其中10例存在COPS3扩增或过表达,3例发现mdm2的扩增或过表达,更有意义的是未发现mdm2和COPS3的扩增或过表达存在于同一标本。由此提出一个假说:COPS3、mdm2以及p53突变中的任何一种情况出现都可能导致骨肉瘤的发生发展。利用酵母双杂交技术可以精确有效的发现并研究与COPS3蛋白发生相互作用的分子,对骨肉瘤发生、发展机制的进一步探索有着重要的意义。
参考文献:
[1] Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein?pro2
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velopment[J].Cell,1994,78(1):117-124.
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双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测[J].第四
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[7] Andreassen A,Oyjord T,Hovig E,et al.P53abnormalities in
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[8] Van Dartel M,Redeker S,Bras J,et al.Overexpression through
amplification of genes in chromosome region17p11.2approxi2
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作者简介: 苏海川,男,1970-11生,博士,主治医师,讲师.
[收稿日期: 2007-04-09]
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母单杂交
酵母单杂交 —研究蛋白质与特定DNA序列之间的相互作用 酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来的，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 ●顺式作用元件 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 ●反式作用因子 是指能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。 其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activationdomain AD)组成。BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域各据功能，互不影响。 (单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。) 这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
蛋白质相互作用的研究方法
举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀
核仁素的蛋白质_RNA杂交体系诱饵载体的构建及表达
?论著?核仁素的蛋白质2RNA杂交体系诱饵载体的构建及表达3 蒋碧梅1 何淑雅2 苏娇2 王桂良1 王海云1 肖献忠133 (1.中南大学湘雅医学院病理生理教研室,湖南 长沙 410008; 2.南华大学生物化学与分子生物学教研室,湖南 衡阳 421001) [摘要]【目的】将核仁素开放阅读框构建到Hybrid Hunter蛋白质2RNA杂交系统p YESTrp3“饵”载体, 明确其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用,验证其能否用于蛋白质2RNA杂交体系筛选cDNA文库。 【方法】设计引物,从真核表达载体p EGFP2N12C23上,扩增出C23开放阅读框,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切 后,克隆到蛋白质2RNA杂交的“饵”载体p YESTrp3质粒上,构建成载体p YESTrp32C23。阳性克隆经Eco R Ⅰ和NotⅠ双酶切鉴定后,转入酵母中,用酵母蛋白抽提物作Western杂交,证实其表达;滤膜印记杂交验证 其有无自身激活作用。【结果】所构建的载体p YESTrp32C23双酶切后,片段大小正确;转入酵母菌L402ura3 /p HybLex/Zeo2MS2后,提取酵母质粒,PCR扩增出预期大小的片段,Western杂交出现阳性条带;滤膜杂 交,转有p YESTrp32C23和阴性对照p YESTrp3的酵母菌落没有激活报告基因,而GAL4全长的阳性对照菌 落变为蓝色。【结论】含有C23的“饵”载体构建正确,在酵母细胞中能表达出C23蛋白,并且没有自身激活报 告基因的功能,能够应用于蛋白质2RNA杂交体系。 [关键词] 遗传载体; 蛋白质类; RNA Construction and Expression of“B ait Plasmid”of Nucleolin in RNA2Protein H ybrid H unterTM System J IA N G B i2mei1, HE S hu2y a2, SU J iao2,et al(1.De partment of Pathophysiolog y, Xiangy a School of Medicine,Cent ral S outh Universit y,Changsha,Hunan,410008,China;2.Department of B iochemist ry and Molecular B iology,N anhua Universit y,Heng y ang,Hunan,421001,China) [Abstract]【Objective】Using C23gene to construct the bait vector,which can express C23protein in yeast cell and interact with it,can be used in RNA2Protein Hybrid as“bait plasmid”to screen the mRNAs f rom the cDNA library.【Methods】PCR was performed to amplify the C23gene f rom the vector p EGFP2N12C23. The ORF of the C23was inserted into the“bait”plasmid p YESTrp3after digestion by the restricted endonucle2 ase of EcoRⅠand NotⅠ.After verified by sequencing,the plasmid was transformed into the yeast L402ura3 /p HybLex/Zeo2MS2.The C23protein expression in the yeast cell was confirmed by Western blot.Colony2lift filter assay was used to verify whether the constructed plasmid alone could activate the reporter gene in the yeast cell.【Results】Digested by two endonucleases,the recombined vector p YESTrp32C23produced anticipa2 ted fragment.Assayed by Western blot,it showed that the yeast cell transformed p YESTrp32C23vector had positive signal which could not be seen in the control.Tested by the colony2lift filter assay,both the p YESTrp32C23vector and control vector(p YESTrp3)could not activate LacZ reporter gene in the yeast,while the cell transformed with positive control plasmid p YESTrp3/IRP carrying whole GAL4gene turned blue,that indicated the reporter gene was activated.【Conclusion】Bait plasmid is constructed correctly and can express C23proteins in the yeast cell but can not activate transcription of LacZ reporter gene alone.The plasmid can be used in Protein2RNA Hybrid. [K ey w ords] genetic vectors; proteins; RNA [中图分类号] R373 [文献标识码] A [文章编号] 167127171(2007)0320353204 3[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(30330280)及面上项目(30300177;30470851); 33通讯作者:E2mail:xianzhongxiao@ https://www.wendangku.net/doc/4b3368243.html,
酵母双杂交技术
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白之间相互作用的方法 酵母双杂交技术 实验目的 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain AD).GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 试验流程
酵母双系统正是利用GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为： 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。 1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。 2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。 3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 GST-Pull Down技术 实验原理 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST 与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离.
酵母单杂交
酵母单杂交 酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。(百度百科) 酵母单杂交法 酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。 酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。 酵母单杂交原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。 酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。
蛋白检测-GST-pulldown
主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：
酵母单杂交-实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
通道蛋白和载体蛋白的主要区别
通道蛋白和载体蛋白的主要区别 疑难问题：许多老师和学生觉得通道蛋白和载体蛋白容易混淆，他们到底是包含关系还是并列关系？也很难理解物质转运通过通道蛋白的是易化扩散，需要进行比较。 一、载体蛋白 载体蛋白是几乎所有类型的生物膜上普遍存在的多次跨膜蛋白分子。每种载体蛋白能与特定的溶质分子结合，通过一系列构象的改变介导溶质分子跨膜转运。 载体蛋白相当于结合在细胞膜上的酶，有特异性结合位点，可与底物（溶质）发生暂时的、可逆性的结合和分离，且一种特异性载体只转运一种类型的分子或离子；转运过程类似于酶与底物作用的饱和动力学曲线，因此有人将载体蛋白称为通透酶。 二、通道蛋白 通道蛋白是一类跨越细胞膜双分子层的蛋白质，它所介导的被动运输不需要溶质分子与其结合，而是横跨膜形成亲水通道，允许大小适宜的分子和带电离子通过。
这些通道可分为两大类：离子通道和水通道。 1．离子通道 目前发现的通道蛋白已有100余种。 离子通道有两个显著的特征：一是具有离子选择性。离子通道对被转运的离子的大小和电荷都有高度的选择性，而且转运速度高，可达106个离子/s，其速率是已知的任何一种载体蛋白的最快速率的1000倍以上。驱动带电荷的离子跨膜转运的净驱动力来自两种力的合力，一种是溶质的浓度梯度，另一种是跨膜电位差，这种净驱动力构成离子跨膜的电化学梯度，这种梯度决定离子跨膜的被动运输的方向。第二个特征是离子通道是门控的，即离子通道的活性由通道的开或关两种构象所调节。并通过通道开关应答各种信号。多数情况下，离子通道呈关闭状态，只有在膜电位变化、化学信号或压力刺激后，才开启形成跨膜的离子通道。因此离子通道又区分为电压力通道，配体门通道和压力激活通道。 2．水通道 水是一种特别的物质，水分子虽然不溶于脂，并且具有极性，但也很容易通过膜。长期以来普遍认为细胞内外的水分子是以简单扩散的方式透过脂双层膜的。后来发现某些细胞在低渗溶液中对水的通透性很高，这很难以简单扩散来解释。如将红细胞移入低渗溶液中，很快吸水膨胀而溶血，而水生动物的卵母细胞在低渗溶液中不膨胀。因此人们推测水的跨膜转运除了简单扩散外还存在着某种特殊的机制，并提出了水通道的概念。直到
蛋白的酵母双杂交操作手册大全
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
生化复习资料：酵母单杂交技术
酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method） 一、原理 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。 二、实验步骤 ①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因； ②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度； ③提取总RNA，合成c DNA双链； ④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆； ⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆； ⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。如可进一步分析DNA确切的结合位点。 三、图片分析 1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。 2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。证实15mM[3-AT]的选择是正确的。挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化E .coli Top 10F'后，酶切鉴定，共得到31个初筛阳性克隆。 四、严谨性分析 1、为了克服His3基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响，我们选择克隆株重复进行3-AT 梯度试验。菌株在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT下被明显抑制，
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂交实验流程(精).doc
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
酵母双杂交试验流程
4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml
蛋白质相互作用研究方法
蛋白质相互作用研究方法 人类基因组序列测定工作的完成与结束标志着生物学研究已经进入后基因组研究时代。虽然在人类细胞中编码功能蛋白的基因并非想象的那么多（不到三万条），但是仅靠这些有限的基因就能组成并控制人类这样极其复杂有机体的生殖、生长、衰老与死亡，说明由遗传密码编码的这些有限的蛋白质的功能可能比人们想象的要复杂与精密。值得注意的是，我们现在往往忽视对于已知蛋白质功能进行新的探索。现在的情况是这样，一方面，已知蛋白的功能研究需要拓展；另一方面，新基因的功能需要探索。由此看来，研究手段显得非常重要。在蛋白质功能研究或蛋白质组学研究中，大多数研究者都采用蛋白质相互作用研究方法作为技术平台。这方面的文献日益增多。为什么蛋白质相互作用研究方法如此流行？原因之一就是“直接与明了”。在细胞内，所有蛋白在发挥作用时都不是孤立的，而是相互联系的，尤其在复杂的胞内信号转导网络体系中这种情况更为突出。一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调节或介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入一个新的天地。对于新基因情况也是如此。一般普遍认为，新基因的研究往往令人感觉无从下手。但实际上情况并非如此，现有的各种技术与方法总能使我们找到研究的切入点。首先我们可以通过在结构上寻找功能提示，再在实验中进行验证。在新基因的研究中，蛋白质相互作用研究方法也是必不可少的。但是方法毕竟是方法，一旦确定了蛋白质之间有相互作用就要进行功能研究。本文对目前文献上报道的各种蛋白质相互作用研究方法进行介绍与总结。 1，酵母双杂交1-5 酵母双杂交的原理是，把报告基因HIS3和lacZ整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子GAL4的调控表达。一旦GAL4蛋白结合到HIS3和lacZ调控序列相应的位点，则启动报告基因的表达。通过检测报告基因的表达判断阳性或阴性。实际应用中，把GAL4基因分成两个部分：DNA结合区（gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）。分别把GBD和GAD构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（GBD-X和GAD-Y）。然后把GBD-X和GAD-Y两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当GBD-X 融合蛋白中X蛋白与GAD-Y融合蛋白中Y蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的GBD和GAD蛋白靠近并具有完整的GAL4蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。 （1）筛选相互作用的蛋白 酵母双杂交技术能用于对cDNA 文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到GBD载体上，作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到GAD载体上。然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用的蛋白。也许你能够筛选到多株阳性克隆。虽然酵母双杂交技
酵母单杂交实验方法.
酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。 【实验目的】 了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。
“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一个简单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。 图2 用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选protein-DNA相互作用的原理 The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process主要包括以下步骤： 1 将已知序列（bait）克隆到pAbAi载体。 2 pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter酵母菌株。 3 检测Y1HGold bait菌株AbAi r基因的本底表达水平。 4 合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选cDNA文库。 5 筛选结果的验证和分析。 【实验准备】 1 仪器设备 微量取液器（2.5 μL；20 μL；50 μL；100 μL；200 μL；1000 μL）、PCR仪、低温离心机、台式离心机、CHROMA SPIN TM+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿等。