第八章 病毒的遗传分析

第八章 病毒的遗传分析
8.1 病毒的形态结构与基因组 8.2 噬菌体的增殖和突变型 8.3 噬菌体突变型的重组测验 8.4 噬菌体突变的互补测验 8.5 噬菌体T4rⅡ的缺失突变与作图 8.6 λ噬菌体的基因组与位点专一性重组 8.7 环状排列与末端重复
补充：细菌和病毒遗传研究的意义
细菌和病毒在遗传研究中的优越性 细菌和病毒的拟有性过程
一、细菌和病毒在遗传研究中的优越性
1.繁殖世代所需时间短。 2.易于管理和进行化学分析。 3.遗传物质较简单。 4.便于研究基因的突变。 5.便于研究基因的作用。 6.可作为研究高等生物的简单模型。
二、细菌和病毒的拟有性过程
1.真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过 有性过程(减数分裂——受精)实现。 2.细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因 子(如噬菌体和质粒，也被称为核外或染色体外 因子)，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌 染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重 组体。这种重组体结构类似于真核生物减数分裂 过程中形成的重组体结构。
8.1 病毒的形态结构与基因组 二、细菌和病毒的拟有性过程
3.拟有性过程——引起细菌、病毒间遗传物质转 移与重组的过程。拟有性过程的存在是细菌、 病毒在遗传学研究，特别是作为真核生物的模 型研究遗传重组和基因结构的重要前提。
8.1.1 病毒的形态结构
1.形体极微小，只有在电子显微镜下才能观察 到； 2.化学组成简单，主要是核酸和蛋白质；无细胞 结构，为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒； 3.只含一种核酸（DNA或RNA），是单倍体，只有 一条染色体； 4.病毒的多样性； 5.缺乏独立代谢能力；
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6.繁殖方式独特，只能依赖宿主活细胞的代谢机 器； 7.具有双重存在方式，或营专性寄生在活细胞 内，或在细胞外以大分子颗粒状态进行传播； 8.对干扰素敏感，而对抗生素不敏感。
病毒的基本结构
病毒粒子（毒粒）： 基本结构：
蛋白质衣壳 位于毒粒中心的核酸构成的核壳 包膜——脂质或脂蛋白 蛋白质或糖蛋白突出的结构——刺突
螺旋对称，二十面体对称，复合对称
8.1.2 病毒的基因组
病毒的类型
根据宿主细胞的不同可将病毒分为: 1.植物病毒 2.动物病毒 3.细菌病毒(又称噬菌体) 4.亚病毒 类病毒 拟病毒 朊病毒
每种病毒只含一类核酸(DNA或RNA)
含DNA的病毒称DNA病毒 含RNA的病毒称RNA病毒
病毒基因组的类型极为多样化
有单链(ss)与双链(ds) 正链(+)与负链(－) 正链：基因组碱基排列顺序与mRNA相同 负链：基因组碱基排列顺序与mRNA互补 有线状(L)与环状(O)
噬菌体以线状的dsDNA居多。已发现的真菌病毒 都是dsRNA，藻类病毒都是dsDNA。 大多数病毒粒子中只含一个核酸分子，但少数 病毒RNA含2个或2个以上的核酸分子，并且各个 分子担负不同的遗传功能，它们共同构成了病 毒的基因组。 不同病毒的核酸含量差别较大， 每种病毒粒子核酸的长度是一定的，一般由5～ 500kb组成。 最大的病毒基因组有几百个基因，最小的病毒 如MS2噬菌体仅有3个基因。
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8.2 噬菌体的增殖和突变型
8.2.1 噬菌体的增殖
根据噬菌体与宿主的关系
烈性噬菌体 温和噬菌体
（1）烈性噬菌体的增殖
烈性噬菌体（virulent phage）： T系噬菌体 (T1-T7)
病毒的繁殖：增殖，感染周期（phage infection cycle）或生活周期
吸附细菌细胞→后代噬菌体释放
T4噬菌体从大 肠杆菌中释放
?结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状： T偶列噬菌体 头部：双链DNA分子的染色体； 颈部：中空的针状结构及外鞘； 末端：由基板、尾针和尾丝组成。
裂解周期：吸附 蛋白质的生物合成
侵入 装配
核酸的复制、转录与 释放
?首先是早期基因(early gene)表 达，多为调节基因，启动自身基因 表达，抑制宿主细胞的RNA合成 ?其次是与DNA复制有关的基因表 达，其产物是核酸酶和与DNA复制 有关的酶 ?最后是晚期基因(1ate gene)的表 达，它们是一些控制形态发生过程 的基因和为噬菌体结构蛋白质编码 的基因 ?包装完成后由噬菌体裂解基 因表达产生裂解酶(1ysozyme)，消 化宿主细胞壁
（2）温和噬菌体的感染周期
温和性噬菌体（temperate phage）:以溶源体 或质粒的形式存在的一类噬菌体。如P1和λ 噬菌体。
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互补单链黏性末 端(sticky end)
?温和噬菌体的感染周期
λ噬菌体的感染周期有两种途径
裂解途径 溶源途径
通过这两种途径所进行的生活周期分别称为
裂解周期(1ytic cycle) 溶源周期(1ysogenic cycle)
λ噬菌体的宿主也是大肠杆菌K12
⑴溶源周期：
λ噬菌体：噬菌体侵入后，细菌不裂解 附在E.coli染 色体上的gal和bio位点间的attλ座位上 通过交换整合到细 菌染色体，并能阻止其它λ噬菌体的超数感染。
（2）温和噬菌体的感染周期
原噬菌体（prophage）或原病毒（provirus）： 这类噬菌体侵染细菌后，其DNA整合到宿主染 色体中。 溶源性细菌（lysogenic bacteria）：含有原 噬菌体的宿主细菌称为溶源性细菌，或溶源体。 带有原噬菌体的大肠杆菌K(λ)就称为溶源性 细菌。
?溶源性细菌有两个重要特性：
①免疫性：溶源性细菌含有原噬菌体而产生一种阻 遏蛋白，这种阻遏蛋白不但可抑制原噬菌体DNA复 制，也可抑制再度感染的同类或另一近缘的噬菌 体DNA的复制，因而能抵抗同类噬菌体的超感染 (superinfection)。 ②可诱导性：通常由于原噬菌体的自发诱导，每一 代可能有万分之一溶源性细菌被裂解，释放出大 量噬菌体，这一过程称为裂解周期。
Lysogenic bacterium are immune to further injection by the same phage
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（2）温和噬菌体的感染周期
⑵裂解周期： 原噬菌体经诱导可转变为烈性噬菌 体 裂解途径。用紫外线或化学物质如丝裂霉素 C(mitomycin C)诱导，90%的溶源性细菌进入裂 解周期。 非溶源性细菌(non-lysogenic bacterium)：失 去原噬菌体的细菌。 P1噬菌体：它并不整合到细菌的染色体上，而是 独立地存在于细胞质内。
（2）温和噬菌体的感染周期
溶源菌中原噬菌体的存在形式有两种：
染色体外的以游离形式存在，如P1； 整合到细菌染色体上，如λ。
8.2.2 噬菌体的突变型
Phages are so small that they are visible only under the electron microscope We cannot produce a visible colony by plating
The formation of a plaque ( a clear area)
(1)条件致死突变型
限制条件(restrictive condition) 许可条件(permissive condition) 常用的有两大类条件致死突变： ①“温度敏感”突变(temperature sensitive mutation，ts) ②“抑制因子敏感”突变(suppressor一sensitive mutations，sus)
①“温度敏感”突变
野生型噬菌体能在很大的温度范围内感染宿主并进 行繁殖 热敏感突变型(heat sensitive mutants，hs)，通常在 30℃(许可条件)感染宿主进行繁殖，但在40～42℃ (限制条件)条件下就是致死的，不能形成噬菌斑 冷敏感突变型(cold sensitive mutants，cs)在较低温 度下就是致死的。 温度敏感性几乎总是一种突变的结果，基因突变后 所编码的蛋白质中有一个氨基酸的替换，而这种蛋 白质在“限制温度”下不稳定而丧失活性。
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②“抑制因子敏感”突变
sus突变的实质：原来正常的密码子变成了终止密 码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而 产生有活性的蛋白质。 带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因 (suppressor，su+)(许可条件)的宿主菌时能产生 子代，但在感染另一种没有抑制基因(su-)(限制 条件)的宿主菌时，不能产生子代。 野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。
根据在带有专一性抑制基因的宿主中的非致死 性，可以将sus突变分为三类： 琥珀突变(amber，amb) 赭石突变(ochre，och) 乳白突变(opal，op)
无义突变与无义抑制基因
无义密码子(nonsense codon)：因为终止密码子 不编码任何氨基酸，它们是蛋白质合成的终止 信号。这些密码子是琥珀型(amber)UAG，赭石 型(ocher)UAA和乳白型(opal)UGA。 无义突变(nonsense mutation):编码多肽链中某 一氨基酸的密码子突变为终止密码子，使多肽 链合成到此便会中断，从而使多肽链变短而失 去活性的突变。
无义突变与无义抑制基因
无义突变都是条件致死突变 有相应的无义抑制基因(su+)。 这些sus突变型在翻译过程中，在终止密码子 处插入一个特定的氨基酸，防止在终止密码 子位置上提前终止。 如琥珀突变就有许多种抑制基因，各插入某 个氨基酸以防止提前终止(表8—3)。
（2）噬菌斑形态和宿主范围的突变型 ①噬菌斑形态的突变型：
烈性噬菌体（virulent phage）：如T2、T4等形 成清晰噬菌斑（clear plaque） 温和噬菌体（temperate phage）：如λ和P1等 形成混浊的噬菌斑（turbid plaque）
T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，可以通 过感染不同的大肠杆菌将它们区别。
② 宿主范围的突变型：
本质上也是条件致死突变型
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8.3 噬菌体突变的重组测验 1.原理：
8.3.1 Benzer的重组测验与基因的精细结构分析 它是以遗传图的方式确定突变子之间的空间 关系。 本泽尔利用经典的噬菌体突变和重组技术 详细分析T4噬菌体rⅡ区基因的微细结构。 r+ 野生型T4噬菌体：侵染E.coli B株和 K(λ) 株； rⅡ突变型T4噬菌体：只能侵染B株，不能 侵染K(λ)株。 让两个rⅡ突变型杂交 侵染K(λ)株，选 择重组体r+r+ 计算两个r+r+ 突变座位 间的重组频率。
2.方法： 3.重组值计算：
两种rⅡ突变类型：r47+ × + r104 ↓混合感染 E.coli B株 形成噬菌斑后收集溶菌液 接种 B株 K12(λ)株 计数 计数 r47+、+ r104、r47r104、+ + + + 四种基因型 仅一种重组 均能生长 型能生长
r47r104是rⅡ双重突变的重组子，但不能在大 肠杆菌K(λ)菌株中生长，不能检测，但其数量 与重组子+ +相同，计算重组子个数时，用+ + 噬菌体数×2。
基因内重组
rIIA
m1
利用大量rⅡ区内二点杂交结果，绘制出该区座 位间微细的遗传图：
rIIA
m2
Chromosome carring mutation 1 Recombination within the gene
Chromosome carring mutation 2
Chromosome carring mutation 1 and 2
Wild type
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此方法测定重组频率极 其灵敏，理论上可测定 两个rⅡ突变之间重组频 率为0.0002％，即十万 分之一的rⅡ+重组值。 但实际观察到的为0.02%。 此图距约为2个核苷酸对。 可见重组子的单位可小 到2个核苷酸对。
8.3.2 T2突变型的两点测交与作图
噬菌体遗传性状可分为 形成的噬菌斑形态 宿主范围 1.噬菌斑突变：T噬菌体 r-突变体 野生型噬菌体，r+，产生的小而边缘模糊菌斑 突变噬菌体，r-，产生大两倍而边缘清晰的菌斑 2.宿主范围突变 大肠杆菌B株是T2的宿主，大肠杆菌B/2株对T2产生抗性 一种发生在T2上的h-突变体，能利用B和B/2株，而h+只能 利用B株
8.3.2 T2突变型的两点测交与作图
h+r-×h-r+
接种在同时长有 B和B/2株的培养基上
h+r半透明,大
h-r+
透明,小
h+r+
半透明,小
h-r透明,大
重组值=重组噬菌斑数/总噬菌斑数 ×100%
=[(h+r+ + h-r-)/(h+r- + h-r+ + h+r+ + h-r-)]×100%
去掉%即可作为图距。
h+r-×h-r+接种在同时长有B和B/2株的培养基上
?不同速溶性噬菌体的突变在表型上不同，可分别 写成ra- 、 rb- 、rc-
?由于有3个不同的r基因，可列出4种可能 的基因排列连锁图：
?根据结果，可作出ra、rb、 rc与h之间的顺序 ra
24 h
?根据rc-rb+ X rc+rb-杂交，将所得重 组值与rb-h距离比较，确定排列顺 h 序， ra在h哪一侧都正确，T2噬菌体 的连锁图为环状。
rb
12.3
h
rc
1.6
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8.3.3 λ噬菌体的基因重组与作图
s系产生小噬菌斑，mi系产生微小噬菌斑，c系产
生完全清亮的噬菌斑，co1系产生除了中央一个 环之外其余部分都清亮的噬菌斑，co2系产生比
Kaiser用s co1 mi × + + +，杂交所得后代有8 种类型。结果及分析作图可归纳于表8-6
co1更浓密的中央环噬菌斑。
后3个突变系的溶源性反应受到干扰，仅能进入 裂解周期，所以形成清亮噬菌斑。野生型噬菌体 的溶源性反应正常，因而有部分溶源化的细菌不 被裂解，仍旧留在噬菌斑里，所以形成的噬菌斑 是混浊的。
s
3.83
co1
6.21 8.32+2×0.86=10.04
mi
8.3.4 T4突变型的三点测交与作图
用T4噬菌体的两个品系感染E.coli。一个品系是小噬菌 斑(m)、快速溶菌(r)和浑浊溶菌斑(tu)突变型。另一个 品系是对这三个性状都是野生型(+++)。
根据这些结果，可绘出这三个基因的染色体图：
m
12.9
r
20.8
tu
?三点测交所得8种噬菌斑都可观察到，因为病 毒是单倍体，亲组型与重组型可直接从后代中 表现出来，直接统计各种噬菌斑类型即可，不 必考虑对子代如何进行选择。
?噬菌体杂交与真核生物杂交在杂交机制上是 完全不同的，这是因为： ①噬菌体的重组既不同于真核生物中由于减数分 裂，使每个亲代对子代提供基本相等的遗传物 质，也不同于细菌的二等分裂。 噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传 贡献取决于感染细菌时每种亲代噬菌体的相对数 量。如基因型A与基因型B的亲代比=10：1，则产 生重组子代的数量A型常多于B型子代数；
②噬菌体的基因重组是发生在噬菌体的DNA复制 以后。 ③噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换，如 将3种突变型XY+Z+ 、X+YZ+和X+Y+Z 噬菌体感 染同一个细菌，结果会出现XYZ的重组子噬菌 体。 ④在噬菌体中基因重组频率可以随着宿主细胞裂 解时间的延长而增加。
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因此噬菌体杂交时，应该注意：
①控制每种亲代噬菌体基因型的投放量； ②控制允许发生复制和重组的时间。只有控制 这两个因素并在标准条件下进行杂交所得重 组频率才能用于绘制近似的遗传图。
8.4 噬菌体突变型的互补测验
8.4.1 互补测验与顺反子 一、互补测验原理和方法 重组测验与互补测验是确定遗传学中突变型 之间关系性质的两个基本方法。 重组测验是确定突变的空间关系，互补测验 是确定突变的功能关系。
一、互补测验原理和方法
设有两个独立起源的隐性突变，具有类似的表 现型。 判断是属于同一个基因突变，还是属于两个基 因的突变？ ①建立双突变杂合二倍体； ②测定突变间有无互补作用。 由此可判断是否属于同一基因。
互补测验
双重感染的细菌中不产 生子代噬菌体，那这两 种突变型一定有一相同 功能受到损伤，属同一 基因 双重感染的细菌中产 生两种亲代基因型的 子代噬菌体，那这两 种突变型的功能相互 补偿，这两个突变称 为彼此互补，属不同 基因
二、顺反子
互补测试常用的方法： 斑点测试法（spot test）
反式排列：两个突变座位位于不同的染色体上 顺式排列：是两个突变座位位于同一条染色体上 顺反测验：根据顺式表现型和反式表现型来确定两 个突变体是否属于同一个基因（顺反子）。
突变型1 噬菌体1/细菌10 感 染K（λ）涂平板
红色区域滴突变2 的培养基
红色区域形成 噬菌斑，表明 突变1和2互补
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实质上Benzer是进行反式测验来检验突变之间的 关系： 顺式排列为对照，不论是同一基因还是两个基因 的突变，在互补测验中均表现出互补效应，其表 现型都为野生型。 反式测验中： ①反式排列 如个体表现为突变型则无互补 作用，突变来自同一基因座位。只能产生突变的 mRNA，形成突变酶和个体，显示突变的表现型。 ②反式排列 如个体表现为野生型则有互补作 用，突变来自不同的基因座位。每个突变的相 对位点上都有一个正常野生型基因， 最终可 产生正常mRNA，其个体表现型为野生型。 本泽尔提出的顺反子（cistron）是指不同突 变之间没有互补的功能区。表示功能的最小单 位和顺反的位置效应。
8.4.2 ΦX174条件致死突变型的互补测验
一个顺反子就是一个功能水平上的基因，现常 用顺反子作为基因的同义词。例如在rⅡ区里， rⅡA 是一个顺反子，rⅡB也是一个顺反子。 每个顺反子在染色体上的区域称为基因座，每 个基因座中有若干突变位点，每个位点就是顺 反子内部能发生突变的最小单位。 顺反子具有功能上的完整性，又具有结构上的 可分割性。
无子代噬菌体 同一顺反子 产生子代噬菌体 不同的顺反子
将突变型成对地进行互补测验以确定不同来源的 两种条件致死突变影响的是不同的遗传功能还是 相同的遗传功能。
温度敏感型(42℃为限制条件) 用这两种突变型噬菌体同时感染细菌细胞
?根据互补测验结果，ΦX174的39种条件致 死突变分属于8个顺反子
8.4.3 T4突变型的互补测验
条件致死突变在基因组内似乎是随机发生的， 已发现所有已知的T4基因都有这种突变，通过 这些突变就可以表明不同基因在发育过程中的 功能。 T4的条件致死突变型同样都可以用互补测验法 把它们归属于特定的顺反子中。 R．S．Edgar和W．Wood还进一步证明一些产生 不同形态缺陷的突变型可在离体条件下互补。
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图8—12 T4条件致死突变型之间的体外互补 A：基因突变型23产生尾和尾纤维但无头，而基因27突 变型产生头和尾纤维但无尾。将这两个流产感染细胞 群的溶解液混合到一起并保温应会产生能感染的颗粒
图8—12 T4条件致死突变型之间的体外互补 基因13的突变型的工作进程和A图一样，但它证明基因13 所产生的头部是不完整并有缺陷的，还证明只有当完整 的头部存在时，尾和尾纤维等才能装配上去
?T4颗粒的装配(即成熟) 是循着严格规定的形态 发生途径进行的
8.4.4 基因内互补 （intragenic complementation）
一般情况下同一 顺反子内两个突 变不能互补，但 也有例外。
?控制形态发生，编码结 构蛋白的“晚期基因”的 表现完全依赖于控制DNA 复制等的“早期基因”行 使正确的功能
8.5 噬菌体T4 rⅡ的缺失突变 与作图
基因内的互补作用与基因间的互补作用可以区 分。 ①任何两个不同基因间的突变总是互补的。 ②基因内两个突变能互补的也只能是点突变，无 缺失。 ③基因内互补作用的酶活性往往明显低于正常水 平，形成的蛋白质常有某种异常。
8.5.1 缺失作图原理
点突变（point mutation）：由于核苷酸对发 生了改变的突变。 缺失突变（deletion mutation）：由于缺失 了单个或相邻的许多核苷酸对引起的突变。 这两种突变可形成相同的表型效应，但两者 是有区别的：
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Deletion mapping of the rII region
点突变与缺失突变的区别:
①点突变是单个位点的突变，缺失突变是多个 位点的突变； ②点突变可以发生回复突变，缺失突变是不可 逆的； ③点突变与其他点突变之间可以发生重组，而 缺失突变与另一基因组内缺失区的点突变之 间不可能重组。
Benzer carried out the analysis in the following way. For example, consider the following gene map, showing 12 identifiable mutational sites: Let us suppose that one mutant, D1 , fails to give rII+ recombinants when crossed with mutants carrying altered sites 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8; therefore, D1 behaves as if it has a deletion of sites 1 to 8: Another mutant, D2 , fails to give rII+ recombinants when crossed with 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12; therefore, D2 behaves as if it has a deletion of sites 5 to 12:
Deletion mapping of the rII region
These overlapping deletions now define three areas of the gene. Let's call them i, ii, and iii:
For example, assume that a mutant in area iii is crossed with D1 . We would envision the cross schematically as follows, where the mutant site is shown with a red bar:
A new mutant that gives rII+ recombinants when crossed with D1 but not when crossed with D2 must have its mutational site in area iii. One that gives rII+ recombinants when crossed with D2 but not with D1 must have its mutational site in area i. A new mutant that does not give rII+ recombinants with either D1 or D2 must have its mutational site in area ii.
and draw the actual pairing as follows:
8.5.2 缺失作图方法
1滴缺失型噬菌体 1滴待测的rⅡ区 突变噬菌体 0.5mL大肠杆菌B菌 株培养物
大肠杆菌K(λ) 菌株
8.5.2 缺失作图方法
步骤：一般是通过两个步骤把未定位的rⅡ突变 定位在rⅡ区域47个小片段上的。 第一步是将待测的突变型与(图8—15)最上方的7 个“大缺失”突变型分别进行杂交，以确定这一 突变位点所属的大范围； 第二步是将待测突变型进一步与有关的“小缺失” 突变型分别进行杂交，以缩小这一突变点所属的 范围。
滤纸 回复突变
重组
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rII
放 大 图
Detailed deletion map of the rII gene. Each deletion (horizontal orange bar) has an identification number. Along the bottom are the arbitrary identification numbers of the regions defined by the deletions. Note that some deletions extend out of the rII gene.
8.6 λ噬菌体的基因组与位点专一性重组
8.6.1 λ噬菌体的基因组 λ噬菌体基因组的分析是通过突变型之间的重 组频率而构建的。 根据是否能形成噬菌斑，λ噬菌体的基因可归 为两类： ①噬菌斑形成所必需的基因，在基因组中用大 写字母表示； ②噬菌斑形成非必需基因，用小写字母或希腊 字母表示(图8—16)。 ?形成噬菌斑所必需的λ噬菌体的基因24个 可分为5类。(P204) 可通过条件致死突变，如ts突变或sus突 变均可鉴别这些基因，对这些突变的互 补分析表明，这些必需的基因分属于24 个顺反子。
其他基因是噬菌斑形成非必需的：
①att为噬菌体附着区； ②int和xis为专一位置重组所必需； ③c I、cⅡ、cⅢ为噬菌体进入溶源化所必需，其产物是 阻遏物，抑制噬菌体其他基因表达，如果这些基因突 变则形成清晰的噬菌斑，故c I、cⅡ和cⅢ这些基因突 变就不会发生溶源化，所以称为裂解突变型，在感染 后一定出现裂解过程； ④exo为核酸外切酶基因，rex为重组基因。
非必需的基因可能通过噬菌斑形态或者通过基 因组中这些基因所在部分的缺失而鉴别出来。 λDNA分子可以丢失占全长22％的中间部分， 但不影响噬菌体生成噬菌斑的能力，然而这些 缺失突变型不能发生溶源化或者不能完成遗传 重组。
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λ噬菌体基因组约有49 000个核苷酸对的线状 DNA分子： ①许多功能相关的基因聚集在一起，如头部形成 基因，接着是尾部形成基因等，调控基因也集中 排列在DNA链的一个区域； ②结构基因及其编码蛋白质所作用的部位也处在 邻接的区域，如整合基因int和切离基因xis位于 附着位点att的旁边，因att位点是这两基因产物 的作用部位。另外复制基因0和P也位于复制起点 旁边； ③从λ噬菌体颗粒中分离出的DNA是双链线状 分子，具有由12个核苷酸组成的互补的单链 粘性末端。在进入宿主细胞以后，这些“粘性 末端”退火(annealing)形成的环状分子上的 单链“缺口”(nick)，在细胞DNA连接酶作用下 形成共价键而被封闭。
8.6.2 λ原噬菌体与合子诱导
20世纪50年代初人们普遍认为原噬菌体和细菌染 色体并没有整合在一起，而是作为非染色体因素 遗传的。 不久有实验表明，它们是整合在一起的： ①1953年，Lederberg等发现在大肠杆菌溶源性菌 株和敏感菌株间的F+×F-杂交中，λ原噬菌体和 gal基因一起分离和重组，而且就像细菌其他基因 间重组一样可以进行测验；
8.6.2 λ原噬菌体与合子诱导
②1955年，E．S．Lennox证明λ原噬菌体和 gal可被噬菌体P1共同转导； ③1956年， M．L．Morse发现λ对gal基因的 限制性转导。
原噬菌体是溶源性的决定者，位于细菌染色体 的特定位置上。 Jacob和Wollnan用合子诱导法绘制了几个不同 的原噬菌体在大肠杆菌染色体图上的座位。 合子诱导（zyotic indution）：当含有λ的Hfr 品系与F-品系接合时，溶源化状的噬菌体从供 体一旦进入受体由于不受cI蛋白的抑制而迅速 进入裂解周期，使受体细胞破裂，释放大量噬 菌体。
8.6.3 原噬菌体的插入与切除
λ原噬菌体是插入大肠杆菌染色体的gal和bio基因之 间的，这两个基因控制了半乳糖利用和生物素的合成。 λ噬菌体int基因编码的酶催化环状λ基因组上附着位 点(attP)与细菌染色体上附着位点(attB)之间的位点专 一重组，而attP位点不是在粘性末端内，而是位于噬 菌体基因组中间，所以当attP位点断裂重组后，改变 了原噬菌体基因的次序。这一过程说明环状λ基因组 通过噬菌体int基因的作用而插入细菌染色体。
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原噬菌体的诱导：从宿主染色体上切除原噬菌体， 其方式刚好与插入过程相反，但是切除过程受int 与xis两个λ基因控制。切除结果产生一个环状的 λ基因组，它首先通过θ模式进行复制产生一些子 代基因组，大约复制几次后DNA复制的模式转为δ 型复制模式，产生线状的子代噬菌体基因组，这些 子代基因组被包装进头部蛋白。 λ原噬菌体偶尔会发生不适当的切除，形成的环状 DNA分子失去了原噬菌体图上一端的λ基因组的一 部分，而增加了与原噬菌体图另一端邻接的大肠杆 菌染色体的一部分。
8.6.3 原噬菌体的插入与切除
杂合分子能否形成有活力的噬菌体颗粒，取决于是 否丢失了λ基因组中的必需基因。 带有大肠杆菌bio基因(λdbio)的分子一般是有活力 的，因为它们通常只丢失了attP与N基因之间的非必 需基因。一旦N基因也丢失，那么λbio噬菌体也就 不能形成噬菌斑。 带有大肠杆菌gal基因(λdgal)的分子一般是有缺陷 的。这是由于attP左端都是必需基因。一旦丢失就 无法形成噬菌斑。
8.6.3 原噬菌体的插入与切除
这种“缺陷λdgal与λdbio的噬菌体”在正 常λ噬菌体存在的情况下也能增殖，这是由 于正常λ噬菌体补偿了它们已丧失的功能。 因为λdgal与λdbio噬菌体有把gal一与bio一 的细菌转导成gal+与bio+的能力，根据这一特 点很容易鉴别这两种噬菌体。
8.6.3 原噬菌体的插入与切除
这种转导噬菌体也能出现溶源化，大肠杆菌 (λgal)就是一例。 通过重组测验或互补测验可确定λdgal与 λdbio品系中λ基因组被置换部分的范围。如 λdgal噬菌体与一系列已知位点的sus突变噬菌 体品系杂交，检测它们是否形成野生型重组 体，如果λdgal品系中某个待测基因有缺陷， 就不会形成野生型重组体。
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根据重组测验的结果，参照一系列sus突变在遗传 图中的图谱位置就可以确定gal置换片段的左侧端 点，而右侧端点总是在整合位点attP上。
相反,要确定未知位置的点突变相对于gal置换片段左侧 端点在图上的位置。只要测定未知突变型与一组已确定 了图谱的λdgal品系之间是否产生野生型重组体。此作 图方法与确定rⅡ突变型缺失作图的技术相似。
8.6.4 位点专一性重组的分子机制
位点专一性重组(site-specific recombination) 或保 守性重组(conservative recombination)、整合式重 组(integrative recombination) ：
重组事件只涉及特定位置的短同源区或是特定的碱 基序列之间。 重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去，不 合成。 两个DNA分子并不交换对等的部分，有时是一个DNA 分子整合到另一个DNA分子中。
对DNA序列和所需蛋白质因子的要求： 重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也 只限于在这一小范围内， 不需要RecA蛋白质的参与，但需要位点专一 性的蛋白质因子参与催化。 可发生位点专一性重组的生物： 在原核生物中最为典型。例如λ噬菌体DNA通 过其attP位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间 专一性重组而实现整合过程。
(1)λ噬菌体的 整合与切离
(2)位点专一性重组涉及断裂和重接
att位点对于DNA序列有特殊的要求。 attP完成功能需要240 bp的DNA序列，如以核 心序列为中心的碱基记为零，则一侧P的必需 长度为160 bp，另一侧P’的必需长度为80 bp。 attB的必需长度仅23 bp，从-11位到+11位， 即一侧的B为11bp，另一侧B’也是11 bp，其中 核心序列的每边仅需要4 bp。片段长度大小上 的差异说明了attP和attB在重组中执行不同的 功能，而attP提供了更多的信息。
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The sequence O is common to attB and attP. It is called the core sequence; and the recombination event occurs within it.
8.7 环状排列与末端重复
8.7.1 线状DNA具有环状遗传图
T2与T4噬茵体相似，它们的大部分基因是相同 的，而且遗传结构也基本相似。 放射自显影证明T2染色体是一个线状DNA，相 对分子质量为1.20×108，有162 000 bp。 对T2和T4各种突变型进行三因子或四因子杂交 的重组分析证明其遗传图为环状结构。 T2噬菌体中分离得到的DNA有末端重复并有环 状排列的基因次序。
8.7 环状排列与末端重复
8.7.1 线状DNA具有环状遗传图
末端重复(terminal repetition)也称末端冗余 (terminally redundancy)，就是T4或T2双链DNA 分子两端带有相同的碱基顺序(如 ABCDEFG…WXYZABC)。 而环状排列又称致环交换，最简单的理解为环 状DNA分子在任意一处切开所产生的线状DNA分 子。环状DNA按这种途径切开就可能有多种致 环交换的分子。
末端重复的实验证据是用外切核酸酶Ⅲ部分酶切 T2 DNA分子，这种酶从DNA双链分子3’一OH末端逐 个切下核苷酸，于是在双链分子上形成一个单链 的5’一PO4末端，将这种经过部分酶切的分子在适 合互补单链顺序之间形成氢键的条件下保温，如 果分子是末端重复的，那么这些单链末端一定是 碱基互补的，而分子就会形成环，实验结果一再 观察到了这类环状分子。 T2：DNA要被酶切去2％以后才能形成这样的环状 分子，说明T2基因组中约1％是末端重复部分。 一般末端重复为基因组的0.5％～3％，即200～1 150 bp。
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环状排列的实验证据是将一群T2噬菌体颗粒DNA提 取出来，加热使这些T2 DNA分子变性，于是每条 双螺旋DNA分子的互补链就分开，然后让这些单链 混合物在适合条件下保温即退火，让互补碱基序 列之间重新形成氢键连接的双螺旋分子，如在这 一群T2 DNA中只有一种分子的话，那么退火后只 能重新形成原来的双链DNA分子，并且都是线状的。 实验结果是：在这一群单链混合物中，大部分单 链都能与来自不同的天然DNA分子的单链形成双链 分子，电子显微镜下可观察到这些混合物中有许 多环状双链分子。
8.7.2 环状 排列与末端 重复的形成
感染初期， 形成更长的 多连体。
感染后期，子代 DNA分子开始包 装到噬菌体外壳 中，每个噬菌体 颗粒能包装多长 DNA分子取决于 壳体本身。
作业 1，4，5, 6, 8, 9
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