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转肝细胞生长因子的脐带间质干细胞移植促进大鼠脑出血后髓鞘再生

[文章编号]　1000-4718(2009)10-1936-05

　[收稿日期]2009-03-30 [修回日期]2009-08-21

Tel:020-********;E -mail:docliuam@yahoo https://www.wendangku.net/doc/4a3868599.html,

转肝细胞生长因子的脐带间质干细胞移植

促进大鼠脑出血后髓鞘再生

刘安民1

,　罗　铭2

,　蔡望青1

,　李方成1

,　李　国3

,　潘伟生

(中山大学附属第二医院1神经外科,2肿瘤科,广东广州510120;3香港中文大学,中国香港)

[摘　要]　目的:研究转人肝细胞生长因子(hHGF )人脐带间质干细胞(h UC M S Cs )移植对脑出血后脱髓鞘再生和神经功能恢复的影响。方法:S D 大鼠60只,随机分为3组:脑出血+h UC MSCs -HGF 组、脑出血+h UC M S Cs 组和脑出血+P BS 组,每组20只。胶原酶诱导建立脑出血模型,据不同组别于术后7d 立体定向下进行侧脑室相应的移植。分别于移植前1d 和移植后1、7、14、21、28、35d 利用mNSS (modified neur ol ogical severity scores )评分检测大鼠神经功能情况,应用劳克坚牢蓝检测脑损伤区的神经纤维恢复情况,利用免疫组化和W estern bl otting 检测髓鞘碱性蛋白(MBP )的表达变化。结果:脑出血模型大鼠术后3周(即移植术后2周)mNSS 评分检测的神经功能,

h UC MSCs -HGF 组和h UC MSCs 组的神经功能改善较P BS 组明显提高(P <0105),而且h UC MSCs -HGF 组较h UC 2M SCs 组神经改善更加显著(P <0105)。h UC MSCs -HGF 组的神经纤维修复较其它组明显改善,髓鞘碱性蛋白的

表达较其它组亦明显提高(P <0101)。结论:转hHGF 人脐带间质干细胞移植较单纯细胞移植能明显提高神经纤维髓鞘再生能力,促进脑出血后神经功能缺失的修复。

[关键词]　间质干细胞;肝细胞生长因子;髓鞘再生;脑出血;大鼠

[中图分类号]　R743.34 [文献标识码]　A

Hepa tocyte growth factor m od i f i ed hu man u m b ili ca l cord m esenchy ma l ste m cell therapy pro m otes re m yeli n a ti on after i n tracerebra l he m orrhage i n ra ts

L IU An -m in 1,LUO M ing 2,CA IW ang -qing 1,L I Fang -cheng 1,L I Guo 3

,P OON W ai -sang

(1D epart m ent of N eurosurgery,2

D epart m ent of O ncology,The Second A ffiliated Hospital,Sun Yat -sen U niversity,Guang 2

zhou 510120,China;

Chinese U niversity of Hong Kong,Hong Kong,China .E -m ail:docliuam @yahoo .co https://www.wendangku.net/doc/4a3868599.html, )

[ABSTRACT]　A I M :To study the effects of neur ol ogical i m p r ove ment and re myelinati on after intracranial he mor 2

rhage (I CH )in rats by a novel therapeutic strategy with hepat ocyte gr owth fact or (HGF )gene transfected hu man u mbilical cord mesenchy mal ste m cells (h UC MSCs )by lentiviral vect or .M ETHOD S:I CH was induced in 60adult male Sp rague -Da wley rats by a stereotactically guided injecti on of bacterial type I V collagenase int o the right internal cap sule .Non -mod 2ified h UC MSCs,HGF -modified h UC MSCs with lentiviral vect or or P BS were ad m inistered left intraventricularly 7d after right internal cap sule I CH.A ll rats under went modified neur ol ogical severity scores f or 35d .Luxol fast blue staining,i m 2munohist ol ogical staining and W estern bl otting assess ments for myelin basic p r otein (MBP )were app lied .RESU L TS:The I CH rats receiving HGF -modified h UC MSCs de monstrated significant functi onal recovery,deter m ined by modified neur o 2l ogical severity scores,compared t o the other gr oup s fr om 2weeks after cell therapy .A s indicated by Luxol fast blue stai 2ning,the percent area of demyelinati on was obvi ously reduced in the HGF -h UC MSC treat m ent gr oup compared t o the P BS contr ol gr oup and h UC MSC -only treat m ent gr oup at 5weeks after I CH.The exp ressi on ofMBP detected by i m munohist o 2l ogical staining and W estern bl otting was significantly higher in HGF -h UC M S Cs treated brain than that in other gr oup s (P <0101).CO NCL US I O N:Our data suggest that the HGF gene -modified h UC MSCs contribute t o the re markable func 2ti onal recovery after I CH compared t o h UC MSCs trans p lantati on al one .The treat m ent p r omotes nerve fiber remyelinati on by

?6391?中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysi ol ogy 2009,25(10):1936-1940

up-regulating the MBP after I CH in rats.

[KE Y WO RD S]　Mesenchy mal ste m cells;Hepat ocyte gr owth fact or;Re myelinati on;B rain he morrhage;Rats

自发性脑出血(intracranial he morrhage,I CH)是一种临床常见病,其发病率、死亡率很高,即使生存者也往往留下明显的神经功能障碍。近些年来,随着干细胞研究的不断发展和深入,发现干细胞移植对脑出血后等神经系统功能的恢复具有治疗作用[1]。但由于单纯干细胞移植效果的有限性,采取联合基因治疗为疾病的治疗创造了新的前景。而肝细胞生长因子(hepat ocyte gr owth fact or,HGF)不仅具有促肝再生作用,还可用来治疗神经系统等多种疾病[2-5]。近来我们成功建立了脑出血模型和转肝细胞生长因子人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchy mal ste m cells,h UC MSCs)[6,7]。因此本研究建立I CH模型导致神经功能损害,将HGF修饰的hUC MSCs治疗脑出血模型,探讨其对脑出血后神经功能的影响及其机制,期待为脑损伤后的神经再生和修复治疗带来新的希望。

材　料　和　方　法

1　主要材料

S D大鼠(香港中文大学实验动物中心提供),胶原酶Ⅳ型(Sig ma)、鼠抗MBP(髓鞘碱性蛋白)单克隆抗体和鼠抗actin多克隆抗体为Santa Cruz产品。主要仪器:立体定位仪为David Kopf I nstruments产品,微型颅钻为日本NSK Volvere GX,上海安亭微量进样器厂微量进样器,Rotar od test测试仪由香港中文大学器械服务公司制作,B i o-Rad电泳仪,Oka mo2 t o X3自动X线显影仪,B i o-Rad Model GS-670灰度分析扫描仪、Canon照相机和Zeiss显微镜成像系统。

2　动物和分组

健康雄性S D大鼠60只,体重220g,鼠龄10周。实验随机分为脑出血+P BS组、脑出血+hUC MSCs 和脑出血+h UC MSCs-HGF组3组,每组大鼠20只。

3　模型制作

内囊脑出血动物模型定位[6]:模型的制作方法:腹腔注射麻醉后,俯卧位将大鼠头部固定在立体定位仪上,保持前囟和后囟在同一水平。于颅正中线上切开皮肤约115c m,据定位用颅钻钻一直径约1mm的骨孔,通过立体定位仪定位,利用微量进样器将0121CDU/115μL胶原酶Ⅳ型缓慢推进脑内,注射时间维持5m in,注射完后将针停留5m in后缓慢退针,再用骨蜡封闭骨孔、缝合头皮。

4　转hHGF基因hUC M SC的制备

我们已经成功完成了运用慢病毒载体系统进行转hHGF基因hUC MSC的制备,并获得重组人肝细胞生长因子在人脐带间质干细胞中高效表达,见参考文献[7]。

5　细胞移植方法

大鼠左侧脑室模型定位[8],颅骨背侧中线左旁113mm,前囟前018mm,深度为脑表面下317mm。操作步骤:操作步骤基本同模型制作,通过立体定位仪定位,利用微量进样器据不同组别将5×106/6μL P BS的h UC MSCs-HGF、hUC MSCs和P BS缓慢推进I CH模型大鼠的左侧脑室内,注射时间维持5m in,注射完后将针停留5m in再缓慢退针。

6　大鼠行为学检测

mNSS(modified Neur ol ogical Severity Scores)评分[9]:mNSS评分为0-18分(正常为0分,最大功能障碍为18分),该评分涉及运动、感觉、反射和平衡实验。分数越高表示神经功能受损更严重,1-6分表示轻度受损,7-12分表示中度受损,13-18分表示重度受损。

7　标本处理、组织学染色和蛋白定量分析

行为学实验后处死大鼠,脑组织按常规处理,石蜡包埋固定,做层厚5μm切片,进行劳克坚牢蓝(Luxol fast blue)染色观察神经纤维情况和免疫组化染色观察MBP。常规取脑组织,提取组织蛋白通过W estern bl otting测定MBP蛋白含量。

8　统计学处理

数据以均数±标准差( x±s)表示,运用SPSS 1310统计软件、采用均数的t检验统计分析。

结果

1　一般情况

所有动物术后均存活,无伤口感染、死亡等。术后脑出血模型大鼠均出现肢体偏瘫症状,再次手术进行细胞移植后大鼠均存活,无死亡例数。

2　术后神经功能评估

在3组的脑出血模型术后1、7和14d(移植术

后7d )的mNSS 评分无显著差异。而脑出血模型大鼠术后3周(即移植术后2周),hUC MSCs -HGF 组的mNSS 评分较hUC MSCs 和P BS 组明显降低(P <0105),h UC MSCs 和P BS 组无显著差异(P >0105)。

脑出血模型大鼠术后4、5周(即移植术后3、4周),h UC MSCs -HGF 组和h UC MSCs 组的mNSS 评分较P BS 组明显降低(P <0105),而且h UC MS Cs -HGF 组

较h UC MSCs 组神经改善更加显著(P <0105),见图1。3　劳克坚牢蓝(L uxol fa st blue)染色

组织学染色有髓神经纤维呈鲜蓝色,神经细胞胞体及尼氏体呈微紫色。在内囊区血肿周围,h UC 2MSCs -HGF 组和h UC MSCs 组较P BS 组的神经纤维

损害的范围小,而h UC MSCs -HGF 组比h UC MSCs 组损害范围更加明显减少,见图2

。

Fig 1　Results of mNSS test .h UC M S Cs -HGF -trans p lantated

gr oup showed better perf or mance fr om 21d,and these benefits continued up t o 35d . x ±s .n =6.3P <0105vs h UC MSCs +HGF;#

P <0105vs h UC MSC;

○

P <0105vs

h UC MSCs .

图1　各组细胞移植后m NSS

结果比较

Fig 2　Rep resentative i m ages of the Luxol fast blue staining of myelin in cor onal secti ons of the i p silateral internal cap sule of intracere 2

bral hemorrhage for five weeks .A:re markable de myelinati on in I CH rat with intracranial injecti on of saline;B:re myelinati on in I CH rat trans p lanted with non -transduced h UC M SCs;C:significant re myelinati on in I CH rat trans p lanted with HGF -transduced h UC MSCs (×50).

图2　各组L uxol fa st blue 染色结果

4　髓鞘碱性蛋白(M BP)的变化免疫组织化学染色显示,MBP 主要位于胼胝体和白质的神经细胞的细胞浆内;h UC MSCs -HGF 和h UC MSCs 移植大鼠的脑损伤周围的MBP 表达较

P BS 组高,见图3。经W estern bl otting 蛋白定量分

析,MBP 的含量在h UC MSCs -HGF 组高于hUC MSCs 和P BS 组,而hUC MSCs 移植组高于P BS 组,差异显著(P <0101),见图4

。

Fig 3　Rep resentative i m ages of i m munohist ochem ical staining of myelin basic p r otein (dark br own )in cor onal secti ons of the i p silater 2

al internal cap sule of intracerebral he morrhage (I CH )f or five weeks .A:I CH rat with intracranial injecti on of saline;B:I CH rat trans p lanted with non -transduced h UC M S Cs;C:I CH rat trans p lanted with HGF -transduced h UC MSCs (×100).

图3　各组M BP 免疫组化结果

8391?

Fig4　W estern bl otting for myelin basic p r otein(MBP)extrac2 ted fr om the i p silateral thala muses of rats for five weeks.

x±s.n=6.33P<0101vs I CH gr oup;##P<0101vs

h UC MSCs gr oup.I CH:intracerebral he morrhage gr oup.

图4　各组M BP的W estern blotti n g结果比较

讨论

长期以来,中枢神经系统的损伤与再生一直是困扰人类健康的难题,也是科学家们研究的焦点。因此越来越多的研究目的在于如何提高神经系统损伤患者的生存质量。在大多数情况下,内源性干细胞产生的神经组织不足以替代损伤后缺失的神经组织[6]。I CH后运动功能损伤的机制十分复杂,近期的研究发现I CH后神经功能的缺损是由于神经通路受损而引起[10]。因此,科学家现在着重于神经功能的再建,把脑出血后神经纤维脱髓鞘变作为主要的治疗目标。

近来Seyfried等[1]运用MSCs静脉移植治疗脑出血大鼠进行研究,发现骨髓间质干细胞移植能提高局部骨髓间质干细胞的聚集、神经元的迁徙等,改善I CH的神经功能障碍。本实验结果也显示,脐带间质干细胞移植能一定程度地促进脑损伤后神经纤维的再生,进而改善脑出血后的神经功能缺损。研究表明,MSCs可以自身分化为神经细胞,具有分泌营养因子、抗凋亡等作用,而MSCs的移植效果取决于移植细胞的数量[11],但往往由于移植MSCs的活性相对较低而导致治疗效果有限,MSCs移植后神经系统功能只能得到一定程度的恢复[12];所以寻找增强移植MSCs治疗效果的新方法是当前科学家面临的重要课题。

越来越多的研究证实,HGF可作为神经营养因子,在神经系统发育和损伤后再生过程中发挥神经保护作用,可用于治疗神经组织损伤。Shi m a mura 等[3]通过基因转染将人HGF基因注入大脑中动脉闭塞动物模型蛛网膜下隙,发现HGF基因过度表达,脑梗死体积缩小、大脑皮质毛细血管密度增加、血脑屏障破坏减少,而脑水肿减轻。Shi m a mura等[4]进一步研究发现转HGF基因治疗能有效改善脑梗死后大鼠的学习和记忆功能。Tsuzuki等[5]的实验表明,HGF可使梗死灶的面积减少、凋亡细胞减少、血管生成增加,其机制可能是HGF的抗神经元凋亡和促血管形成的作用。

进来研究发现,HGF作为神经营养因子,在神经系统发育和损伤后对神经元的发育、存活和轴突生长及导向,对周围神经损伤后神经元的保护、轴突侧促生长及神经纤维的修复等均起重要作用[2]。本研究利用HGF基因修饰的MSCs移植入I CH大鼠模型,发现联合治疗组大鼠的神经纤维再生和神经功能的恢复较单纯细胞移植的效果明显增强;劳克坚牢蓝染色发现在内囊区血肿周围,h UC MSCs-HGF 组较h UC MSCs组的神经纤维损害范围缩小,免疫组化和蛋白印迹检测髓鞘碱性蛋白(MBP)的含量也明显升高。Ebens等[13]的研究发现,在脊髓运动神经元发生的后期阶段HGF是一种化学诱导物及神经营养因子;HGF可以促进大鼠脊后根神经节的轴突生长和感觉神经元的存活。研究发现,HGF能调节出生后早期树突的形态及增强轴突的生长;给以外源性HGF能促进皮质第2层锥体细胞神经元的树突生长和分支,而抗HGF抗体可阻断内源性HGF,导致神经元树突形态及复杂程度显著下降[14],而且HGF能提高NGF的神经营养活性,增强依赖于NGF 存活的感觉及交感神经元等的存活效应,促进依赖于NGF的感觉神经元轴突外向生长[15]。以上结果结合本研究表明,HGF能促进作为神经髓鞘重要结构的髓鞘蛋白的增加,从而促进神经纤维的再生和修复。HGF对神经系统具有较强的保护作用,通过促进髓鞘再生是其发挥保护作用的机制之一,将HGF的基因对MSC进行修饰用于组织损伤性疾病的修复治疗具有广泛的前景。

[参　考　文　献]

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一种可阻断致癌蛋白E W -FL I 1与RNA 解螺旋酶A 相互作用

抑制尤文氏肉瘤生长的小分子

许多肉瘤和白血病带有非随机的染色体转位,这些转位位点编码肿瘤特异的变异融合转录因子。尤文氏肉瘤家族肿瘤

(E wing πs sarcoma fa m ily tu mors,ESFTs )含有一个致癌融合蛋白E W S -F L I 1表达的特征性t (11;22)转位。由于E W S -F L I 1

是一个错位蛋白,无法使用常规基于结构的方法设计小分子抑制物。鉴于E W S -F L I 1与RNA 解螺旋酶A (RNA helicase A,

RHA )的结合对其致癌功能十分重要,美国科学家使用表面电浆子共振筛查(surface p las mon res onance screening )的方法筛选

能与E W S -F L I 1结合并能阻断其与RHA 相互作用的小分子化合物。其中YK -4-279是在筛查中获得的有效先导化合物,能阻断RHA 与E W S -F L I 1的结合,诱导ESFT 细胞凋亡并使ESFT 的原位移植物生长受限。实验结果证实该化合物能抑制变异的肿瘤特异转录因子与致癌效应所需的细胞成分相结合,同时提供了一种寻找特异性抗肿瘤有效成分的新方法。

NatMed,2009;15(7):750-756(王皓帆)

0491?