葛根和粉葛高效液相色谱指纹图谱及化学模式识别_李生茂

DOI?10．13192/j．issn．1000-1719．2016．05．048

葛根和粉葛高效液相色谱指纹图谱及化学模式识别

李生茂1，刘琳2，谭睿3，甄汉深

4

（1.川北医学院药学院，四川南充637000；2.川北医学院附属医院内分泌科，

四川南充637000；3.西南交通大学医学院，四川成都610031；4.广西中医药大学，广西南宁530001）

摘要：目的：建立并比较葛根和粉葛的高效液相色谱（HPLC ）指纹图谱，为其质量控制提供依据。方法：采用

HPLC 法，色谱柱为Kromasil C 18（4.6mm ?200mm ），流动相为乙腈－0.03mol /L 醋酸铵溶液（梯度洗脱），流速为0.9mL /min ，柱温为40?，检测波长为250nm ，进样量为20μL 。收集16批次的葛根和粉葛样品进行测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版》软件进行相似度评价，采用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行化学模式识别研究。结果：16批葛根和粉葛药材的指纹图谱有6个共有峰，经对照指认出葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素的色谱峰。相似度分析结果显示葛根和粉葛的相似度较高，均在0.910以上；聚类分析将葛根和粉葛样品分别归为两类；主成分分析提取得到8个主成分，累计方差贡献率达到93.548%，前3个主成分得分投影结果与聚类分析基本一致。结论：葛根和粉葛所含化学成分既有一定的相似性，也存在一定差异，该方法可作为葛根和粉葛的质量控制及临床应用的依据。

关键词：葛根；粉葛；HPLC 指纹图谱；聚类分析；主成分分析

中图分类号：Ｒ284文献标志码：A 文章编号：1000-1719（2016）05-1034-04HPLC Fingerprint and Chemical Pattern Ｒecognition of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii

LI Shengmao 1，LIU Lin 2，TAN Ｒui 3，ZHEN Hanshen 4

（1．School of Pharmacy ，North Sichuan Medical College ，Nanchong 637000，Sichuan ，China ；2．Department of Endocrinology ，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College ，Nanchong 637000，Sichuan ，China ；3．Southwest Jiao Tong University ，College of Medicine ，Chengdu 610031，Sichuan ，China ；4．Guangxi University of Chinese Medicine ，Nanning 530001，Guangxi ，China ）

Abstract ：Objective ：To establish and compare HPLC fingerprints of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii ．Methods ：HPLC was used to analyze16batches of samples．The determination was performed on Kromasil C 18column with mobile phase consisted of acetonitrile －0．03mol /L ammonium acetate with gradient elution at the flow rate of 0．9mL /min．The detection wavelength was 250nm and column temperature was set at 40?．The sample size was 20μL．TCM fingerprint evaluation software （2004edi-tion ）was used to evaluate the similarity of 16batches of samples．Hierarchical cluster analysis （HCA ）and principal component analysis （PCA ）were applied to chemical pattern recognition．Ｒesults ：There were 6common peaks of fingerprints of Pueraria lo-bata and Pueraria thomsonii ．Four components were identified as Puerarin ，Daidzin ，Daidzein and Genistein．The similarities of 16batches of samples were proved to be higher than 0．910．Sixteen batches of Pueraria lobata sample and Pueraria thomsonii ware classified into two groups （Pueraria lobata sample and Pueraria thomsonii sample ）based on HCA．Eight principal components （PC ）were observed via PCA and the values of 8principal components accounted for 93．548%of the total variance．The classifi-cation result according to PCA was consistent with the HCA．Conclusion ：The components of Pueraria lobata and Pueraria thomso-nii are different．The method can be used for identification and quality evaluation of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii ．

Keywords ：Pueraria lobata ；Pueraria thomsonii ；HPLC fingerprint ；HCA ；PCA

收稿日期：2015－12－09

基金项目：2012年四川省教育厅科研项目（12ZB216）

作者简介：李生茂（1981－），男，四川成都人，

讲师，博士，研究方向：中药药效物质基础及质量标准化研究。

通讯作者：谭睿，教授，博士，研究方向：中药、民族药及复方药效物质基

础及质量标准化研究，

E －mail ：93230430@qq．com 。葛根和粉葛分别来源于豆科葛属植物野葛［

Puer-aria lobata （Willd.）ohwi ］和甘葛藤（Pueraria thomso-nii Benth.）的干燥根［1］，长期以来两者均作为葛根药

材使用［2－4］

，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止

泻，通经活络，解酒毒之功效［1］

。现代研究显示，

葛根和粉葛均含有葛根素、大豆苷和大豆苷元等异黄酮类活性成分，但由于基源的不同，两者所含化学成分及药

理作用存在一定差异

［5－8］

，《中华人民共和国药典》从2005年版开始也将葛根和粉葛分别单列。目前，有关葛根和粉葛化学成分比较的研究大多采用紫外光谱法

［9－11］、红外光谱法［12］、薄层色谱法［13－14］

、高效液相色谱法

［5－6，10－11，15－19］

等对二者的总黄酮等大类成分或部分活性成分的定性或定量的对比，未能更深入对葛根和粉葛药材化学成分异同进行系统比较分析。因于此，本实验采用高效液相色谱法建立葛根和粉葛的指

纹图谱，并结合聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行模式识别，以期为进一步系统比较这二者化学成分的异同，并为更为合理使用葛根药材提供一定的依据。1仪器与试药

1.1仪器

岛津LC－10A高效液相色谱仪包括两个LC－10A泵、DGμ－12A在线脱气机、SPD－10A检测器、SIL－10A自动进样器、CTO－10A柱温箱（日本岛津）；Sartoius BS110电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2试药

实验所用葛根药材经西南交通大学生命科学与技术学院宋良科副教授鉴定为豆科植物野葛［Pueraria lobata（Willd．）Ohwi］或甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根，药材来源详见表1。葛根素、大豆苷对照品（中国药品生物制品检定所）、大豆苷元对照品（SHENZHZN TAVTO BIOTECH CO.，LTD，CHINA）以及染料木素对照品（成都曼斯特生物技术有限公司），纯度均大于98%。乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水（自制）。

表1药材来源

样品品种来源样品品种来源

s1Pueraria lobata（Willd.）Ohwi云南昆明s9Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川平武s2Pueraria lobata（Willd.）Ohwi广西南宁s10Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川北川s3Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川广元s11Pueraria thomsonii Benth.广西南宁s4Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川凉山s12Pueraria thomsonii Benth.广西贺州s5Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川简阳s13Pueraria thomsonii Benth.云南昆明s6Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川彭州s14Pueraria thomsonii Benth.云南大理s7Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川彭州s15Pueraria thomsonii Benth.四川成都s8Pueraria lobata（Willd.）Ohwi四川成都s16Pueraria thomsonii Benth.四川成都

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（4.6mm?200mm）；流动相：A为乙腈，B为0.03mol/L醋酸铵溶液，梯度洗脱（0 25min，10%A；25 60min，10%→25%A；60 80 min，25%→40%A；80 90min，40→58%A）；流速：0.9mL/min；柱温：40?；检测波长：250nm；进样量：20μL。

2.2溶液制备

2.2.1混合对照品溶液制备分别精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素对照品适量，置具塞容量瓶中，加入30%乙醇制成葛根素、大豆苷和大豆苷元0.2mg/mL以及染料木素0.16mg/mL的对照溶液，摇匀，测定时适当稀释，即得。

2.2.2供试品溶液制备取葛根粉末（过四号筛）约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入30%乙醇100 mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，分别加入30%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.3参照峰的选择

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。其中葛根素色谱峰的峰面积最大，且与相邻峰分离良好，出峰位置适中。故选定葛根素的色谱峰为指纹图谱参照峰S。

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验取同一供试品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录色谱图，以葛根素色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及ＲSD。结果表明各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的ＲSD均小于5%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2稳定性实验取同一供试品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h6个时间点按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以葛根素色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及ＲSD。结果表明各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的ＲSD均小于5%，表明样品在24h内稳定。

2.4.3重复性实验取葛根药材粉末5份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以葛根素峰色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间、相对峰面积及ＲSD。结果表明各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的ＲSD均小于5%，表明本方法的重复性良好。

2.5葛根和粉葛指纹图谱的建立及相似度评价

分别取16批葛根或粉葛药材粉末约0.1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次测定指纹图谱，记录HPLC色谱图。将色谱数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行分析。以s1药材的图谱为参照，采用中位数法多点校正得到16批葛根药材的对照指纹图谱，共有6个共有峰，并计算得到16批葛根药材的共有模式指纹图谱。经与对照品比对，指认了其中葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素在药材中的色谱峰，结果见插页Ⅲ图1。

直观比较发现，葛根HPLC色谱图中的色谱峰在24min 38min、42 48min和78 80min3个时间段内较粉葛色HPLC色谱图中相应位置的色谱峰数量或峰面积分别增加，成分更为复杂。相似度计算结果显示，16批葛根药材HPLC指纹图谱相似度依次为：0.985、0.976、0.993、0.959、0.942、0.990、0.982、0.991、0.934、0.988、0.975、0.975、0.919、0.969、0.963和0.973，均在0.910以上，表明各批次葛根总体相似度较好。

2.6模式识别研究

2.6.1聚类分析16批葛根和粉葛HPLC色谱图色谱峰面积数据导入SPSS1

3.0统计软件，采用中间数，平方欧式距离进行聚类。结果显示，16批样品聚为两类，第一类为粉葛，包括s11、s12、s13、s14、s15和s16；第二类为葛根包括s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9和

s10，结果见图2。

2.6.2主成分分析以16批葛根和粉葛药材HPLC 指纹图谱中色谱峰峰面积为变量，采用SPSS1

3.0软件对其进行原始数据标准化处理及主成分分析，主成分的提取原则为特征值大于1。16批葛根药材共提取到8个主成分，8个主成分累积贡献率达到93.548%，可较好的代表16批葛根和粉葛药材HPLC图谱信息，结果见表2、表3

。

图2葛根和粉葛系统聚类分析结果

表2特征值与贡献率

PCA特征值贡献率（%）累积贡献率（%）

111.94036.18336.183

2 6.01718.23554.418

3 3.31410.04364.461

4 2.6688.08672.547

5 2.5137.61680.163

6 1.886 5.71485.877

7 1.381 4.18590.062

8 1.150 3.48693.548

表3葛根与粉葛样品的主成分得分

样品PCA1PCA2PCA3PCA4PCA5PCA6PCA7PCA8

s10.1740.023－0.086－0.068－0.0110.089－0.0110.010

s20.0880.0210.186－0.0440.0010.023－0.0150.008

s30.168－0.1300.0070.114－0.044－0.0070.0410.015

s40.000－0.015－0.0250.0290.1320.013－0.026－0.007

s5－0.0280.0250.024－0.0060.0270.0470.071－0.033

s6－0.025－0.0150.0050.0360.093－0.020－0.0040.006

s70.030－0.0670.004－0.033－0.018－0.058－0.052－0.042

s80.073－0.065－0.037－0.1040.016－0.0750.0470.029

s90.1480.219－0.0220.049－0.018－0.050－0.009－0.002

s100.012－0.078－0.0190.017－0.0370.030－0.058－0.032

s11－0.1160.015－0.0070.002－0.0220.0130.048－0.043

s12－0.1190.0000.0000.016－0.0170.023－0.0160.094

s13－0.0880.026－0.0090.001－0.0290.0140.000－0.005

s14－0.1110.012－0.0150.003－0.0280.006－0.012－0.003

s15－0.0950.0180.002－0.006－0.021－0.0330.0050.003

s16－0.1100.011－0.008－0.005－0.023－0.017－0.0100.001

以第1、2、3个主成分建立坐标系，进行投影得到16批

葛根和粉葛药材主成分得分3维图，从图3中可见，6

批粉葛样品在空间中比较集中，而10批葛根样品在空

间中较为分散，但大致可分为2类，其结果与聚类分析

结果较为相似

。

图3葛根和粉葛主成分得分图

3讨论

3.1供试品溶液的制备

葛根化学成分复杂，富含异黄酮类成分，分析难度

较大。为了较为全面的反映其化学信息，实验优化了

提取主要条件：提取溶剂（甲醇、乙醇、水以及不同浓

度的乙醇溶液）、提取方式（冷浸、超声和加热回流）及

提取时间（15min、30min和45min），最终选择用

30%乙醇超声30min。所用方法简便快捷，得到的色

谱图信息丰富。

3.2色谱条件考察

实验还重点考察了影响HPLC分离效果的几个主

要因素：流动相（甲醇－水、乙腈－水和乙腈－0.03

mol/L醋酸铵）、流速（0.8mL/min、0.9mL/min和1

mL/min）、柱温（25?、30?、35?和40?）、检测波

长（205nm、230nm、250nm、280nm、300nm）。最后

确定以柱温为40?，乙腈－0.03mol/L醋酸铵按0.9

mL/min流速梯度洗脱，检测波长为250nm时，色谱峰

数量多，主要色谱峰形好、分离度高。

3.3指纹图谱分析

实验建立葛根和粉葛HPLC指纹图谱，从HPLC

色谱图直观分析来看，不同批次的葛根和粉葛HPLC

色谱图存在一定相似性，均具有葛根素、大豆苷和大豆

苷元等主要活性成分色谱峰，同时也有一定的差异，葛

根在部分时间段内色谱峰数量明显较粉葛明显增多，

且10批葛根普遍存在染料木素的色谱峰，而6批粉葛

仅一批样品检测到该成分。

相似度计算结果显示，葛根和粉葛药材的HPLC

指纹图谱相似度均较高，达0.910以上，表明从指纹图

谱的相似度角度来看，葛根和粉葛内在化学成分存在

较好的共性。

进一步采用聚类分析和主成分分析的化学模式识

别方法对葛根和粉葛HPLC色谱图的数据进一步挖掘

分析，发现葛根样品化学成分差异较大，其各自样品在

聚类分析树状图中距离较远，在PCA投影图中投影点

较为分散，而粉葛样品化学成分较为一致，其各自样品

在聚类分析树状图中距离近，在PCA投影图中投影点

也比较集中。但总体来看，两种分析方法判断结果较

为一致，均将16批样品分为两类（葛根和粉葛），可较

好地区分葛根和粉葛的样品。

实验结果表明，葛根的化学成分较粉葛更复杂，这与陈珺等［18］研究结果相似，提示在临床使用中应注意区别运用。通过指纹图谱相似度评价并结合聚类分析、主成分分析两种化学模式识别方法，在一定程度上反映葛根和粉葛内在化学成分的一致性和差异性，可用于葛根、粉葛药材的质量控制。

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收稿日期：2015－12－18

基金项目：国家公益性行业科研专项经费项目（201507004－03）

作者简介：曹佳（1992－），女，山东莱州人，硕士研究生，研究方向：中药有效成分研究。

通讯作者：许枬（1968－），女，辽宁丹东人，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向：中药有效成分及质量研究，E－mail：xudanbs@

163．com。

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DOI?10．13192/j．issn．1000-1719．2016．05．049

天雄的炮制与功用辨析

曹佳，许枬，张凡，林晓彤，张婷婷，陈俏

（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

摘要：天雄的炮制始于汉代，用热草木焖熟，剥去外皮及尖底，干燥。唐宋时期产生了醋腌、盐腌、童便渍等方法，明清时炮制方法最多，除沿用各代方法外，还新产生了大豆煮等方法。诸多炮制方法之目的无外乎防腐、解毒及缓和药性，其中“炮”法沿用最久。天雄、附子、乌头同源，性效有异，天雄善守，重于补下焦之阳，乌头性轻疏气雄烈，逐寒止痛之力更强，附子走而不守，长于温化在脏腑之寒湿。通过天雄的文献资料剖析，为天雄的炮制方法传承及临床应用提供了可靠的文献依据。

关键词：天雄；炮制；功效；临床应用

中图分类号：Ｒ283文献标志码：A文章编号：1000-1719（2016）05-1037-03

Discrimination on Processing and Application for Aconitum carmichneli

CAO Jia，XU Nan，ZHANG Fan，ZHANG Tingting，CHEN Qiao

（School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian116600，Liaoning，China）

Abstract：In Han dynasty，Aconitum carmichneli（Tianxiong）was putting in unburned out ash of grass and wood until the cortex of the medicine is broken，then the cortex and the root in bottom were stripped，which was called“Pao”in Chinese．From that time to Qing dynasty，the processing method of Tianxiong is changed constantly，and the“Pao”is continuously used．The aims for the processing all are anticorrosion，detoxification and ease of the drug．Tianxiong，monkshood and the rhizome of Chinese monkshood are from same plant，but their function is different．Tianxiong is good for tonifying Yang．The chief function of rhizome

紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析讲解

生长在同一地段而致误采。其二是三脉叶马兰生长范围较广而且量多，某些药农见利忘义有意伪充。 ４．２ 药材切成饮片后，形状上较难分辩，但二者的 头状花序较易区分，刘寄奴的呈椭圆形，白色似米粒，小花全为管状花，其叶脉羽状，无离基三出脉。药材具芳香气，味淡。而三脉叶马兰头状花序呈半球形，较大，小花有舌状花和管状花，其叶有离基三出脉和羽状脉。气微，苦、辛。４．３ 二者的显微特征差别较大，刘寄奴药材表面 具“Ｔ”字形非腺毛，腺毛顶面观呈鞋底形；叶主脉底部钝圆略呈圆锥形，上表面稍突起，且中央微凹。叶 图６三脉叶马兰的粉末显微特征 １．非腺毛２．草酸钙针晶３．方晶４．腺毛５．簇晶６．花粉粒７．叶下表皮及气孔 肉组织与茎髓薄壁细胞中有草酸钙簇晶散在。三脉叶马蓝无“Ｔ”字形非腺毛，叶主脉上下面突起明显，底部钝圆呈半圆形。髓部薄壁细胞内含多数短小的草酸钙针晶。二者花粉粒的形态和大小，表面特征差异也较明显。 参 １ 处理２０ｍｉｎ，过滤，取滤液加９５％乙醇稀释至适量浓度。于岛律ＵＶ２４５０型紫外分光度计上，在２００— ４００ ｎｍ波长范围内测定其紫外光谱。结果：刘寄奴 考 文献 在３３０ｎｍ波长处有一最大吸收峰，在３００ｎｍ波长处有肩峰；而三脉叶马兰仅在３２９ｎｍ波长处有一最大吸收峰。 ４４．１ 中国医学科学院药用植物资源开发研究所，中国医学科学院药物研究所等．中药志．第四册．ｊＥ京：人民卫生 出版，１９８８：４３ 讨论 刘寄奴的混杂原因可能有二：其一是二者均 ２ 李时珍．本草纲目（校点本，上册）．北京人民出版社，

１９９ｌ：９５９ 来源于菊科植物，在开花之前茎叶的形状和色泽均有相似之处，其生长环境与习性相似，且二者常混杂 （２００３一１１—２６收稿） 紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析 周军辉１伍蔚萍１谢子民２孙文基ｈ （１．西北大学陕西省生物医药重点实验室，西安７１００６９；２．西安市药品检验所，西安７１００６８） 摘要目的：建立紫菀药材的反相液相色谱定性和定量鉴别分析方法。方法：Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ。。色谱柱（２５０ ｍｍ×４．６ｍｍ，５斗ｍ），流动相为甲醇－乙腈（１：２）－０．４％磷酸梯度洗脱，流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长为３６０ｎｍ，柱温为２５℃。紫菀药材经８０％甲醇超声处理，进行指纹图谱分析，并对紫菀药材中的主要成分槲皮素进行含量测定。结果ｉ在该色谱条件下，６份不同紫菀药材的ＲＰ－ＨＰＬＣ指纹图谱中可检出１０个共有峰作为定性鉴别；紫菀药材中槲皮素的含量在０．１３５％一０．２４６％之间。结论：本方法样品处理简便，准确性好，可用于紫菀药材的质量控制。 关键词 紫菀槲皮素反相高效液相色谱法 紫菀为菊科植物Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ￡的干燥根 在我们制定的紫菀指纹图谱中，含有分离较好的槲皮素色谱峰，这样，既可以得到指纹图谱提供的紫菀化学成分组成信息，又可测定槲皮素有效成分的含量。１ 及根茎，有润肺下气、消痰止咳的功能，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血，是许多常用的止咳平喘复方中药制剂中的重要药物之一。槲皮素（ｑｕｅｒｃｅ．ｔｉｎ）为紫菀中已知的有效成份之一，现代药理研究表明，它具有较好的祛痰、止咳和一定的平喘作用。 －５６２? 仪器与试药 ＢｅｃｋｍａｎＧｏｌｄ Ｓｙｓｔｅｍ高效液相色谱仪，包括

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一)

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一) 【关键词】高效液相色谱法 摘要：综述了高效液相色谱(HPLC)法指纹图谱在中药质量控制方面的应用，并通过供试品的制备、标准品的选择、结果分析方法来阐述中药指纹图谱的应用现状，指出高效液相色谱法应用于中药指纹图谱中现有不足之处和未来的发展方向。 关键词：高效液相色谱；中药指纹图谱ApplicationandAnalysisofFingerprintinTraditionalChineseMedicinebyHPLC Abstract:ThispapersummarizedtheapplicationoffingerprintoftraditionalChinesemedicinebyHPLCto thequalitycontrol.ItalsoreviewedtheactualityoffingerprintintraditionalChinesemedicinethroughth epreparationforsample,thechoiceforstandardsample,andthemethodofresultanalysis.Thenpointed outthemainproblemsatpresentandtheprospectivefutureinapplicationoffingerprintoftraditionalChi nesemedicinebyHPLC. Keywords:HPLC;FingerprintofTraditionalChinesemedicine 当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制〔1〕。我国自200008国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注〔2000〕348号)以来，中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。国家药品监督管理局要求到2002年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，包括中药原料、提取物、产品3种图谱，3种图谱的峰形必须有较大的相关性，否则不予受理〔2〕。 1中药指纹图谱 中药指纹图谱是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成药进行鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性〔3〕。指纹图谱一般包含两层含义：1.必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质；2.对于中药材，指纹特征还能反应出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药，则能反映出同一产品不同批次间的质量差异，差异越小说明药材(或成药)的稳定性越好〔4〕。 2HPLC用于中药指纹图谱的情况 文献分布表明，对中药指纹图谱的研究始于1993年，从1993～1999年共发表11篇〔5〕，指纹图谱的研究基本处于未开发状态。而从2000年开始，研究中药指纹图谱的文献呈直线上升趋势，尤以近2年发展最快，与指纹图谱相关的文献报道就有上百篇，其中又以高效液相色谱法研究的指纹图谱居多，高效液相色谱以其应用的广泛性，检测的精确性成为控制中药质量最主要的检测方法。至今已有50种中药材，21种中成药运用HPLC法测定其指纹图谱并发表。 据文献统计，目前已对下列中药材运用HPLC进行了指纹图谱研究：枸杞、柴胡、新疆雪莲、夏天无、延胡索、白芍、白鲜皮、板蓝根、补骨脂、黄芩、赤芍、川东獐牙菜、川芎、刺五加、大黄、丹参、当归、地黄、茯苓、麻黄、甘草、葛根、马甲、红车轴草、红花、厚朴、怀牛膝、鸡血藤、金银花、绿衣枳实、密花石斛、牛膝、秦艽、人参、西洋参、忍冬、山银花、山楂、芍药、水蔓菁、乌拉尔甘草、五味子、石斛、仙茅、旋覆花、淫羊藿、三七、泽泻、栀子、西红花。中成药中采用HPLC进行指纹图谱研究的有：咳必安胶囊、灯盏花素注射液、白屈菜注射液、板蓝根颗粒、补肾方、川芎制剂、丹参注射液、丹参葡萄糖注射液、复方丹参片、参麦注射液、红花注射液、红景天注射剂、黄连解毒汤、脉络宁注射液、人参

蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展

摘要：指纹图谱技术在食品的质量控制中起着重要的作用。本文主要介绍了高效液相色谱指纹图谱在蜂蜜研究中的应用，以期为蜂蜜的鉴定、质量控制及标准的制定等方面工作奠定基础。 关键词：蜂蜜高效液相色谱指纹图谱 蜂蜜是一种传统的天然保健食品。它是由蜜蜂采集植物的甜味分泌物，通过蜂蜜自身的消化，转化作用及蜜蜂通过气流干燥作用，使水分从花蜜中含６０％以上降低到２０％以下。一般蜜蜂从采集花蜜到酿制为成熟蜜，正常情况下需要３～５ｄ时间［１］［２］。 糖类是蜂蜜的主要的成分，其中有单糖、双糖、低聚糖和多糖，单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的５５％～７５％，而双糖和三糖的含量因蜜源种类的不同而变化。此外，蜂蜜还含有多种蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及人体所必须的矿物质及微量元素，营养十分丰富［２］［３］。多年来的科学研究与医学临床都证明，蜂蜜具有促进食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高肌体免疫能力，促进儿童生长发育等功效；它不仅对婴幼儿、运动员、老人及体弱多病者、重体力劳动者、高强度脑力工作者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对治疗烧伤、烫伤、溃疡愈合、促进伤口愈合及心血管病的辅助治疗等方面来说有很好的疗效［４］｛５］。 蜂蜜作为一种营养丰富、易被人体吸收的天然食品在国内外市场上深受消费者欢迎。为规范蜂蜜市场，保证消费者的利益，我国于１９８２年和２００２年分别颁布了蜂蜜行业标准和推荐性国家标准；但是目前就蜂蜜质量来说，全国各地在蜂蜜生产、流通中仍存在很多不规范的环节，更甚的是出现许多人为掺杂假使的行为，而当前的国家标准不能满足快速、准确的检测需要。 高效液相色谱指纹图谱技术已经广泛的应用于食品行业，特别是药物化学中的中药指纹图谱已经取得了重大的进展。在蜂蜜市场较为混乱且没有准确、快捷的检测方法的情况下，期望建立蜂蜜的高效液相色谱指纹图谱成为必然的趋势。 １．指纹图谱的含义 “指纹（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）”识别技术起源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学。作为一种综合、宏观的和可量化的鉴别手段的指纹图谱，是指经过适当的处理后，采用一定的分析手段如光谱或图谱，得到能够标示该样品特征的色谱或光谱的谱图或图象。在完整地呈现出色谱的特征“面貌”的前提下，表达了对照品与待测样品指纹图谱的相似性，用以产品真伪鉴别，评价其质量的均一性和稳定性。 蜜源植物的花蜜是蜂蜜的主要来源，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此，同一种类的单一花蜜在成分上也具有相似性。同时，经采集、酿造后的成熟蜂蜜其成分除糖类的含量有明显变化外，来源于蜜源植物的次生代谢物质等微量活性成分一般不会发生较大的变化，这使指纹图谱技术应用于蜂蜜种类和真伪鉴别成为可能。借助于现代分析技术对蜂蜜中主要特征功效成分信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，这就是蜂蜜指纹图谱的内涵［１８］。 ２．指纹图谱的种类 指纹图谱已广泛的应用于食品品种和质量的鉴别，其根据测定方法的不同，大体分为色谱指纹图谱、光谱指纹图谱和ＤＮＡ指纹图谱。其中，以高效液相色谱指纹图谱应用最为广泛。 ２．１色谱指纹图谱 色谱技术种类繁多，是获得指纹图谱的最常用的方法。其中，高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是应用最多的一种方法，６０％～７０％的有机物均可应用，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，是所有光谱色谱分析中最适合绘制指纹图谱的方法。近２０多年来，随着仪器和柱技术、样品预处理技术的发展成熟及仪器的日益普及，ＨＰＬＣ作为食品中的营养成分、功能因子、食品添加剂及污染物的一种快速、准确、易于自动化的检测手段，在食品分析中的应用发展很快；高效液相色谱－质谱（ＭＳ）联用，能够将未知成分的各峰进行归属；当前，高效液相色谱已经用于蜂蜜某些糖分的定量与定性的常规分析；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面也有很多的报道［６］。 薄层色谱（ＴＬＣ）法出现于１９５６年，具有操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑斓 蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展 西南大学食品学院王文静