位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲斑马鱼动物模型的构建及其初步应用_卢晶
2015年12月第36卷第6期
首都医科大学学报Journal of Capital Medical University
Dec．2015Vol.36No.6
基金项目：国家自然科学基金项目（81270918，81471014），北京市自然科学基金重点项目（7131005）。This study was supported by National Natural
Science Foundation of China （81270918，
81471014），Natural Science Foundation of Beijing （7131005）．*Corresponding author ，E-mail ：jinkui．yang@gmail．com
网络出版时间：2015－12－1410?21网络出版地址：http ：∥www．cnki．net /kcms /detail /11．3662．r．20151214．1021．038．html
［doi ：10．3969/j．issn．1006-7795．2015．06．001］
·糖尿病基础与临床研究·
β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用
卢
晶
1
吴谦
2
谢荣荣
1
仇海燕
1
程呈
1
杨金奎
1*
（1．首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京100730；
2．北京大学生命科学院，北京100871）【摘要】目的构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2（β-site APP-cleaving enzyme 2，BACE 2）基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法
运用CＲISPＲ/Cas9技术，在斑马鱼中设计针对靶点的gＲNA ，使之诱导靶点突变，经测序鉴定得到突变体。结果
BACE 2纯合突变体在早期部分无法存活，ＲT-PCＲ结果显示BACE 2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论BACE 2基因敲除
的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE 2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。
【关键词】基因敲除；CＲISPＲ/Cas9；斑马鱼；β位淀粉样前体蛋白裂解酶2【中图分类号】Q 31
Construction and preliminary application of BACE 2gene knockout in zebrafish using CＲISPＲ/Cas9
Lu Jing 1，Wu Qian 2，Xie Ｒongrong 1，Qiu Haiyan 1，Cheng Cheng 1，Yang Jinkui 1*
（1．Key Laboratory of Diabetes Prevention and Control ，Department of Endocrinology ，Beijing Tongren Hospital ，Capital Medical
University ，Beijing 100730，China ；2．Life Sciences ，Peking University ，Beijing 100871，China ）
【Abstract 】Objective To construct β-site APP-cleaving enzyme 2knockout zebrafish animal model and preliminarily explore its
application．Methods By using the CＲISPＲ/Cas9technology ，the gＲNA against target in zebrafish was designed to induce mutations ；afterwards the mutant was obtained by DNA sequencing．Ｒesults BACE 2homozygous mutants were unable to survive in the early part．Ｒesults of ＲT-PCＲshowed continued BACE 2gene expression in zebrafish early development．Conclusion BACE 2knockout zebrafish
animal model may provide an effective tool for further study of the mechanism of pancreas development and drug screening．【Key words 】gene knockout ；CＲISPＲ/Cas9；zebrafish ；β-site APP-cleaving enzyme 2
β位淀粉样前体蛋白裂解酶1（β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1）在阿尔茨海默病（Alzheimer ’s dis-ease ，AD ）脑组织中的β-淀粉样蛋白沉淀中起重要作
用［1］
。BACE2是BACE1的密切同源物，在阿尔茨海默
病的发病中同样起重要作用。已有研究［2］
表明，糖尿病与阿尔茨海默病的发病密切相关。BACE1和BACE2
均在人类胰腺组织中高表达，
BACE1在胰腺的内分泌和外分泌腺中均有表达，而BACE2仅在胰岛β细胞中特异性表达
［3］
。BACE2在维持胰岛β细胞的形态方面
具有重要作用。将小鼠BACE 2基因敲除后，小鼠的胰岛β细胞团增大，空腹血糖下降。葡萄糖刺激后，敲除
鼠的胰岛素分泌增加，血糖降低明显［4］。BACE2特异
性阻滞剂在小鼠中可刺激新的胰岛β细胞生成。BACE2已经成为2型糖尿病的药物治疗新靶点［5］。BACE2在胰岛β细胞生成和胰腺发育中的具体作用机制尚不清楚，此外，为寻找糖尿病药物治疗新靶点，针对BACE 2基因的大规模药物筛选亟须建立。糖尿病动物模型是研究糖尿病发病机制、临床表现和药物靶点筛选的基础。糖尿病动物模型可分为自发性和实验性糖尿病动物模型两类。前者与人类的单基因及多基因遗传的2型糖尿病仍相差甚远。新近的实验性糖尿病动物模型包括采用基因敲除技术构建基因修饰动物模型。传统的基因敲除技术包括胚胎干细胞（embryonic stem cell ，ES ）细胞打靶技术、锌指核酸酶
首都医科大学学报第36卷
（zinc finger nucleases，ZFNs）技术和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclea-ses，TALEN）技术［6］。成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic re-peats，CＲISPＲ）-Cas9是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。2013年1月，科学家们利用ＲNA引导Cas9核酸酶技术可以在多种细胞中特定的基因组位点进行切割、修饰，这一技术随即被运用到构建基因敲除动物模型中［7-9］。目前这一技术已广泛用于斑马鱼的敲除动物模型。
斑马鱼的内脏器官、血液与视觉系统，在基因水平上87%与人类同源。斑马鱼具有胚胎透明、体外发育、发育快、后代数量大等优势，逐渐使其成为遗传发育研究领域中的一种重要的模式生物［10］。斑马鱼在药物筛选方面尤其具有极强应用价值。斑马鱼胚胎可以同时提供大量互不干扰的形态学信息，在药物筛选初期就可评估药物的毒性，并尽早排除那些能引起毒性的化合物，因此构建疾病基因相关的转基因斑马鱼可以筛选治疗相关疾病的潜在药物［11］。此外，尽管人和斑马鱼的胰腺形态上存在一定的差别，但是与胰腺发育和疾病相关的分子机制相似。因此，构建斑马鱼动物模型可以观察特定基因对胰腺发育的影响。
本研究拟应用CＲISPＲ/Cas9技术构建BACE2大片段删除的斑马鱼模式动物模型。该动物模型将被用于斑马鱼BACE2基因对胰腺发育的功能研究，为阐释斑马鱼胰腺发育机制提供了动物模型。本课题组将在后续研究中进一步运用BACE2斑马鱼模式动物模型进行大规模药物筛选，筛选出针对糖尿病的新型药物。
1材料和方法
1．1实验材料
本研究在北京大学生命科学院张博教授斑马鱼饲养中心培育斑马鱼。选用AB品系的斑马鱼作为研究对象。斑马鱼的养殖条件是28．5?的恒温鱼房，14h光照/10h黑暗交替循环，饲养环境保持日夜循环水，每天另补充10%新鲜去离子水。
pMD19-gＲNA scaffold质粒由北京大学熊敬维教授馈赠。MirVana TM miＲNA isolation kit（Ambion公司，美国）；动物组织总ＲNA提取试剂盒（货号DP431），Fast Quant cDNA第一链合成预混试剂（货号KＲ108）均购自天根生化科技有限公司。1．2实验方法
1．2．1设计BACE2基因敲除靶点
本实验从斑马鱼基因组网站（http：//www．ensem-bl．org/Danio_rerio/Info/Index）得到斑马鱼BACE2基因的序列和结构信息。根据CＲISPＲ/Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变靶点设计原则，对BACE2基因进行靶向设计。Cas9基因打靶系统由Cas9核酸酶和guide ＲNA（gＲNA）构成，其中gＲNA中含有主位点序列，负责识别靶基因；Cas9核酸酶负责切割靶点，造成DNA 双链断裂（double strand break，DSB）。Cas9靶点要求包含20个碱基的主位点和紧邻主位点3’端的PAM 区。PAM区的序列要求为NGG，N为任意碱基。
本研究采用大片段删除的突变（deletion）的方法，因此需要同时设计两个位点。删除长度应控制在0．5 3Kb之间，两个靶点的效率应分别在30%和50%以上。根据这一原则，最终选择BACE2的两个靶点序列分别为：上游靶位点序列5'-GGTTGAGTAG-CATGTGATGCAGG-3'；下游靶位点序列为5'-GGTGT-GCTATGTTGGAGATGGG-3'。
1．2．2gＲNA的制备
1）制备gＲNA体外转录模板
根据BACE2靶点设计、合成含有SP6启动子序列的引物序列。上游的引物序列为：5'-ATTTAGGT-GACACTATA GGTTGAGTAGCATGTGATGC GTTT-TAGAGCTAGAAATAGC-3'。下游的引物序列为5'-ATTTAGGTGACACTATA GGTGTGCTATGTTGGAGAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'（5'下划线加粗部分为SP6启动子序列，中间画框为Cas9主位点序列，3'下划线部分为gＲNA scaffold固定序列）。
合成Tracr rev引物，序列为5'-AAAAAAAGCAC-CGACTCGGTGCCAC-3'。使用SP6引物和Tracr rev 引物对，以pMD19-gＲNA scaffold质粒（质粒图谱详见图1）为模板，采用PCＲ扩增得到体外转录gＲNA模板。PCＲ产物采用DNA产物超薄纯化试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP203）回收。
2）体外转录和回收gＲNA
按照gＲNA体外转录体系配置方法，体外转录gＲNA。体外转录体系（20μL）如下：SP6Enzyme2μL，5?TransBuffer2μL，100mmol/L DTT2μL，ＲNa-sin0．5μL，NTP（10mmol/L）2μL，DNA模板1μg，补足DEPC H2O至20μL。37?体外转录1h，加入1
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第6期卢晶等：β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用
图1pMD19-gＲNA scaffold质粒载体示意图
Fig．1pMD19-gＲNA scaffold plasmid vectors
μL TUＲBO DNase，再次放入37?，15min；取3μL电泳查看转录效果，采用mirVana TM miＲNA isolation kit 回收gＲNA。
1．2．3制备F0斑马鱼和靶点突变效率筛选
将Cas9mＲNA和gＲNA混合注射到一细胞期的斑马鱼鱼卵中，注射量为：Cas9mＲNA300pg，gＲNA 150pg；取注射后受精后2 4d（2 4days post fertili-zation，2 4dpf）的斑马鱼胚胎，提取基因组DNA，进行PCＲ。PCＲ上游引物为5'-TGTTCCGCGGATGCAT-TAAG-3'；下游引物为5'-TACCACACGACACCCAAT-GC-3'。反应条件为：95?5min；95?30s，59?30 s，72?60s，33cycles；72?5min，自然冷却至室温。将Deletion的条带回收、连接、转化，构建到pGEM-T-easy载体后测序。
将突变成功的F0胚胎饲养直至性成熟（90dpf），与野生型（wild type，WT）成鱼交配，收集1dpf胚胎，4个为一组，针对每一条F0分组提取基因组DNA，进行PCＲ。1．2．4筛选BACE2基因删除的F1成鱼
将含有BACE2基因大片段删除的F0斑马鱼与WT交配，产生大量F1，至少需要60条成鱼，筛选F1（杂合子）。将F1饲养至两个月左右剪尾鳍，提基因组，进行PCＲ，PCＲ反应条件同1．2．3。将Deletion的条带回收、连接、转化，构建到pGEM-T-easy载体后测序确定基因型。带有同一突变的杂合子的鱼可以混合饲养。以筛选出的F1作为亲本，建立突变群体。1．2．5ＲT-PCＲ检测不同时间BACE2表达
为了研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育过程中的表达情况，本研究采用ＲT-PCＲ的方法对不同时间点的斑马鱼胚胎进行分析。采用动物组织总ＲNA提取试剂盒提取成鱼的ＲNA，采用FastQuant cDNA第一链合成预混试剂合成cDNA。β-actin基因作为内参。采用DragonPCＲ仪器检测BACE2基因在不同时间的斑马鱼胚胎中的表达情况。β-actin基因上游引物：5'-TGTTTTCCCCTCCATTGTTGG-3'；下游引物：5'-TTCTCCTTGATGTCACGGAC-3'。BACE2基因上游引物：5'-TATTTGCGGGGAAATTCAAC-3'；下游引物：5'-TGATGTAGGGATGTGCTGCT-3'。PCＲ反应体系为20μL，2?Enzyme mix10μL；正向引物0．4μL；反向引物0．4μL；cDNA1．5μL，DEPC H
2
O7．7μL。扩增条件为94?5min；94?30s，60?30s，72?20s，35 cycles；72?5min，自然冷却至室温。
2结果
2．1成功构建BACE2大片段删除的F0斑马鱼将Cas9mＲNA和gＲNA混合注射到一细胞期的斑马鱼鱼卵中，取注射后2 4dpf的斑马鱼胚胎，提取基因组DNA，进行PCＲ。PCＲ结果见图2。结果显示，WT为一条带，大小为1025bp，含有BACE2基因删除的斑马鱼除了WT条带，还有一条477bp的条带。将477bp条带切胶回收构建到pGEM-T-easy载体，测序结果显示该条带为BACE2基因删除548bp 后的序列（图3，测序图为反向互补序列）。
图2PCＲ扩增BACE2删除序列附近PCＲ产物
Fig．2PCＲamplification of BACE2，delete PCＲ
product near the sequence
1：wild type zebrafish；2：takara2000-plus marker；3：KO1zebrafish；4：KO2zebrafish；5：KO3zebrafish；KO：knock out．
图3BACE2基因删除548bp测序图及序列示意图
Fig．3Sequencing graph of BACE2gene after
deleting548bp using reversed complementary se-
quence
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2．2
BACE 2基因缺失对斑马鱼生长发育的影响本研究将筛选后得到的BACE 2基因大片段删除F1经内交后得到F2代斑马鱼。F2代斑马鱼继续饲
养至12 16d 时，有部分幼鱼死亡。收集死亡幼鱼尸体，
提取基因组，经PCＲ检测鉴定死鱼大部分为BACE 2纯合突变体。为深入研究这一现象，本研究收集100条幼鱼进行常规饲养，饲养至12 16d 时共收集到24条死亡幼鱼的尸体，经PCＲ扩增后鉴定结果显示，
24条死鱼中有14条为BACE 2纯合突变体。这一数据表明，缺失BACE 2基因的幼鱼在发育早期部分无法存活。
本研究继续饲养F2斑马鱼至其成熟后剪尾鳍，做PCＲ检测鉴定其基因型发现只有极少的纯合突变体可以长至成鱼。BACE 2纯合突变斑马鱼的体质量、体长与野生对照组无明显差异。2．3
BACE 2基因在斑马鱼胰腺的表达谱
为研究BACE 2基因在斑马鱼胰腺发育过程中的
表达情况，
本实验采用ＲT-PCＲ对不同时间点的斑马鱼胚胎的BACE 2基因表达进行检测。选用β-actin 作为内参。结果显示BACE 2基因在斑马鱼发育早期（从受精后18h 到3d ）持续表达，这说明BACE 2基因
在斑马鱼胚胎胰腺发育中起重要作用。详见图4
。
图4ＲT-PCＲ扩增BACE 2在斑马鱼发育早期的表达Fig．4Expression of ＲT-PCＲamplification of BACE 2in the early development of zebrafish
1：0h β-actin ；2：6h β-actin ；3：18h β-actin ；4：1d β-ac-tin ；5：2d β-actin ；6：3d β-actin ；7：0h BACE 2；8：6h BACE 2；9：18h BACE 2；10：1d BACE 2；11：2d BACE 2；
12：3d BACE 2；13：Takara 2000-plus marker ；BACE2：β-site APP-cleaving enzyme 2．
3讨论
本研究利用CＲISPＲ/Cas 9基因打靶技术，成功构
建了BACE 2基因大片段删除的斑马鱼动物模型。筛选F1代成鱼后结果显示，
BACE 2纯合突变体在发育早期部分死亡，仅有部分能存活至成鱼。通过ＲT-PCＲ检测发现，BACE 2基因在斑马鱼发育早期从5hpf 到6d 持续表达，这说明说明BACE 2在斑马鱼胚胎的胰腺发育中起重要作用。
本研究采用新型的基因敲除技术，即CＲISPＲ/Cas 9基因打靶技术。这一技术具有以下几点优势。首先，CＲISPＲ/Cas 9基因打靶技术无物种限制，可以用于小鼠［12-13］、大鼠、酵母［14］、线虫、斑马鱼［15］
等多种生物。其次，与其他基因敲除技术，如传统的ES 细胞
打靶技术、
锌指核酸酶技术和TALEN 相比，CＲISPＲ/Cas 9敲除技术具有时间周期短的优点。传统的ES 细
胞打靶技术周期约为12个月，
采用TALEN 技术构建基因敲除动物模型周期约为9个月，而CＲISPＲ/Cas 9
敲除技术仅需要6个月即可得到F1代基因敲除斑马
鱼。第三，
与锌指核酸酶技术和TALEN 技术相比，CＲISPＲ/Cas 9技术具有敲除效率更高，脱靶率更低的优点。第四，
CＲISPＲ/Cas 9基因打靶技术操作简单，需要的仪器较少。根据靶点选择原则设计合适的
CＲISPＲ/Cas 9靶点，构建gＲNA 后与Cas9共同注射斑马鱼卵，检测敲除效率即可。本研究利用最新的CＲISPＲ/Cas 9基因打靶技术，3个月内即成功构建了BACE 2基因大片段删除的斑马鱼动物模型。本研究的后续工作将围绕胰岛发育机制和药物
筛选两方面进行。首先，
本课题组将检测BACE 2杂合或纯合突变体和WT 斑马鱼的血糖和胰岛素分泌
情况。为进一步研究BACE 2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用机制，本课题组将利用原位杂交技术和实时荧光定量PCＲ技术探究胰腺主要表达基因，如标记内分泌腺的胰岛素、胰高血糖素、生长抑素以及标记外分泌腺的胰蛋白酶等，在BACE 2杂合或纯合突变体中的表达情况。此外，
运用斑马鱼作为整体动物模型进行高通量的筛选并跟踪考察药物在斑马鱼模型体内的吸收、代谢及分布等情况，将为糖尿病研究提供更多的具有临床应用价值的有效信息。本课题组将运用本研究构建的BACE 2敲除斑马鱼动物模型进行糖尿病的药物筛选，
寻找糖尿病的药物治疗新靶点。
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（收稿日期：2015-10-21）
编辑孙超渊
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斑马鱼作为研究营养与生长的模式生物：向水产鱼类的营养基因组学的研究提供参考
斑马鱼作为研究营养与发育的模式生物：为水产鱼类的营养基因组学的研究提供参考摘要 斑马鱼是最普遍的用来研究毒理学、发育生物学、神经生物学和分子遗传学的模式生物。人们提出把它当做一个可能的研究鱼类营养与发育的模型。斑马鱼用于这一领域研究的好处是它们尺寸小、生殖周期短（12-14周）可以产出大量的卵。后来有了大量的分子工具，同时可以通过基因分析获得相关信息，但是斑马鱼仍然在鱼类的营养基因组学的研究中当做模式生物使用。作为模式生物，对其每一个特点的研究都是细微的，这是因为这些特点是用来推理几个生物过程是如何在相关生物身上发生的，同时为扩增我们在鱼类营养和发育机制方面的知识做出重大的贡献。这篇综述的目的是展示斑马鱼在营养和发育方面的相关研究，从而说明斑马鱼作为研究鱼类营养基因组学的模式生物的价值。我们特别强调斑马鱼中由营养因素导致的基因表达和遗传变异可以用来阐明水产养殖鱼类中的类似过程。 关键字：斑马鱼，发育，营养，营养基因组学，比较基因组学 前言
斑马鱼已经成为研究在个体发育、神经生物学分子遗传学研究的十分普遍的模式生物(Driever et al. 1994; Roush 1996; Bergeronet al. 2008)。近来，人们提出在鱼类营养和发育的研究方面斑马鱼可以作为一种模式生物(Alestro m etal.2006; Dahm andGeisler 2006; De-Santis and Jerry 2007; Wright et al.2006; Johnston et al. 2008)。 人们一个主要的研究兴趣就是生长发育的特点。因为这与水产养殖行业中，鱼类的生产量和可获取的利益密切相关(De-Santis and Jerry 2007)。这些特点中，表型性状是基因控制的，但也取决于环境因素，这些因素中，又直接由营养条件影响(Moriyama et al.2000)。基因研究工具的发展，使我们有机会去弄清楚数量性状相关的基因的变化，随着那些影响养殖生物生长特征的QTL基因座图谱的建立，在生长发育中鉴别候选基因变得非常有效的(Davis and Hetzel2000; Fjalestad et al. 2003; Reid et al. 2005; Aranedaet al. 2008; Lo Pestri et al. 2009; Dumas et al. 2010)。在这一方面，斑马鱼有比其它养殖动物更加多样的分子工具和可获得的基因分析的数据。 人们建议把斑马鱼作为研究鱼类营养基因组学研究的模式生物，同时期望从这一途径获得的结果可以为水产养殖鱼类提供合适的比较基因组学信息(Metscher and Ahlberg 1999; Drew et al. 2008;Robison et al. 2008; Crollius and Weissenbach 2008)。营养基因组学是一门合营养学和遗传学的学科。是一门通过“营养基因组学”（研究日常食物是如何影响某些基因表达的）和“营养遗传学”（研究基因突变对个体“营养应答”的影响）两种手段研究营养-基因相互作用的一门科
2011 基因工程动物模型
第十一讲基因工 程模 因工程模型 梁虹 中国医学科学院医学实验动物学研究所 2011-10-28
WASHINGTON, DC - The international Mouse Genome Sequencing Consortium today announced the publication of a high-quality draft sequence of the mouse genome - the genetic blueprint of a mouse - together with a comparative analysis of the mouse and human genomes describing insights gleaned from the two sequ en ces. Th e paper appears in the Dec. 5 issue of the journal Nature. The Mouse Genome And The Measure of Man December 2002 基因工程技术，包括基因打靶、基因沉默和转基因技 术等首先在小鼠的基因修饰和品系培育上广泛使用， 并产生了大量的基因剔除、转基因疾病小鼠模型和基 因功能研究模型，成为生命科学研究、医学研究和药 学研究的重要支撑条件，并推动了对生命规律的探索 和医药研究的发展。
基因导入方式 一、显微注射法 在倒置显微镜下通过显微操作系统用注射针将DNA样品注射到受精卵雄原核中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。 ?特点：对DNA大小无限制，不需要载体，转基因成功率约20%，外源基因在小鼠染色体上常呈成串的头尾项链的多拷贝插入。 ?缺点：外源基因的插入位点和插入拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变。 二、慢病毒感染法 将具有一次性感染的病毒注射到小鼠受精卵透明带下。 ?特点：转基因成功率和转基因表达率可达到70%以上，且大多为单拷贝或低拷贝整合。?缺点：目的基因插入容量＜10kb，制备病毒需要一定的安全考虑。 三、精子载入法 将精子与DNA混合，然后通过单精注射或IVF获得转基因小鼠。
(整理)α-淀粉酶综述
α-淀粉酶综述 佚名2013-10-06 摘要：α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用发展史、分离纯化及结构的研究史、催化机制及其研究史、工业化生产和应用现状与发展趋势等。 关键词：α-淀粉酶发现应用分离纯化结构催化机制研究史发展趋势 α- 淀粉酶( α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。 1 α-淀粉酶的发现和应用史 1.1 α-淀粉酶的发现 啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖。这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚，直到淀粉的发现。 在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff（1815年）做了一个巧妙的实验。他将4份的冷水加入到2份的淀粉中，并边加边搅拌。之后加入20份的沸水使其形成一层厚厚的淀粉糊。在淀粉糊还是余温的时候，加入被粉碎的麸质（或麦芽），然后在40－60°列式温度下水浴。1－2小时后发现，淀粉糊开始缓慢液化。8－10小时后，淀粉糊被转化为一种甜的溶液。之后，他将其通过过滤和蒸发浓缩得到了糖浆，品尝后发现，其和发酵液一样甜。在操作的过程中，他注明了实验过程中仅添加了非常少的麸质，并且得到的糖浆与淀粉的量成正比。此外，如果在加入麸质前加入几滴高浓度的硫磺酸，最终就没有糖生成。从这个实验中他得到结论1）麸质是一种能够使温水中的淀粉粉末转化为糖的物质。2）作为种子发芽的结果，相比种子内的物质而言，麸质能过将更多的淀粉转化为糖。至此,Kirchhoff奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。
内参基因βActin简介
内参基因βA c t i n简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
内参基因β-Actin简介 日期：2012-05-03来源：未知作者：周慕云点击：次 β-Actin 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。 β-Actin简介 Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin; 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等。因此β-Actin
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
水稻已报道的淀粉酶基因总结
Enzyme Gene CHR Position BAC/PAC Accession Expression Function Mutant Literature ADGP small sub 1 OsAGPS1 9 ~13cM OJ1381_H04 AK073146 E ADGP small sub 2a OsAGPS2a 8 55.4cM P0410E11, 97kb AK071826 E ADGP small sub 2b OsAGPS2b 8 55.4cM P0410E11, 99kb AK103906 E ADGP large sub 1 OsAGPL1 5 117.9cM OSJNBa0017N18 D50317 E ADGP large sub 2 OsAGPL2 1 ~105cM P0663E10U66041 E ADGP large sub 3 OsAGPL3 3 135.7cM OSJNBa0027J18 AK069296 E ADGP large sub 4 OsAGPL4 7 47cM OJ1341_A08AK121036 E SSI OsSSI 6 12.3cM P0681F10 D16202 E, L 与BE一起参与支链淀粉的合成，负责DP~6-7到DP~8-12的合成 SSIIa (SSII-3) OsSSIIa (OsSSII-3) 6 38cM P0525F01 AF419099 E 使DP~10的短链延 长为DP~13-22的 中长链 alk SSIIb (SSII-2) OsSSIIb (OsSSII-2) 2 132cM OJ1118_G04 AF395537 L, R SSIIc (SSII-1) OsSSIIc (OsSSII-1) 10 36cM ? AF383878 E
常见内参基因
β-A c t i n Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、 β-Actin 移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletalmuscleactin，α-cardiacmuscleactin，α-smoothmuscleactin，和 γ-smoothmuscleactin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和 γ-non-muscleactin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数。内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三个动物细胞内参抗体。β-Actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。Beta-actin 由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。 β-actin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时，Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同，这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。 GAPDH GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。 GAPDH结构图
基因敲除技术研究进展
兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16
基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、
基于易错PCR技术的α淀粉酶基因的定向进化研究
２０１０Ｎ０．２ ?９４?ＳｅｒｉａｌＮｏ．２１５ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇＩ衄。ｖａｔｉ。ｎ ａｎｄＫｎ。、Ⅳ１ｅｄｇｅＴｒ嬲ｓ衔 基于易错ＰＣＲ技术的仅一淀粉酶基因的定向进化研究 张建云１，谷立坤协，陈红歌２ （１．河南工程学院资源与环境工程系，河南郑州４５１１９１；２．河南农业大学生命科学学院，河南郑州４５０００２）摘要：采用基因体外定向进化策略巾易错Ｐｃ刚支术，用碱基类似物５挨脱氧尿苷三磷酸（５．ＢｒｄＵＴＰ）部分取代脱氧胸苷三磷酸（ｄ１１限），对野油菜黄单胞菌的Ｏｔ．淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选，得到５个具有高酶活的诱变基因，利用生物学软件ＤＮＡｓｔａｒＮ出发基因序列进行比较，分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示：基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变向引起的，而不是由启动了的变化引起的。 关键词：定向进化：碱基类似物；诱变；ａ．淀粉酶基凶 中图分类号：Ｑ５５６文献标识码：Ａ文章编号：０２５４—５０７１（２０１０）０２—００９４＿０３ Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖ／ｔｒｏｏｆｏｒ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｂｙｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ ＺＨＡＮＧＪｉａｎｙｕｎｌ，ＧＵＬｉｋｕｎ”，ＣＨＥＮＨｏｎｇｇｅ２ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５１１９１。Ｃｈｉｎａ； ２，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌａｎａｌＵｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｔｍａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒａｎｄｏｍｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｎｏｔ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲｓｔｒａｔｅｇｙ．５－ＢｒｄＵＴＰｐａｒｔｌｙｒｅｐｌａｃｅｄｎ限ｗｈｅｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｒｔｅｄ．Ｂｙｕｓｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ，ｗｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｉｖｅｍｕｔａｔｅｄｇｅｎｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｌｉｇｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｇｅｎｅｂｙｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｏｆｔｗａｒｅＤＮＡｓｔａｒ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅ，ｎｏｔｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；５－ＢｒｄＵＴＰ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ａ－ａｍｙｌａｓｅ ｄ．淀粉酶（ａｌｐｈａ－Ａｍｙｌａｓｅ）为１，４一仪一Ｄ一葡萄糖苷水解酶，作用淀粉时可从分子内部切开Ｏｔ一１，４键生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基Ｃｌ碳原子为仅一构型，故称Ｏｔ．淀粉酶。ｄ一淀粉酶在动物、植物、微生物【１】中均能产生，但大量生产主要还是靠微生物发酵闭。微生物中许多种类均能产生饯．淀粉酶，其中有关的属有：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓｐ．Ｔｈｅｌ＂ｍＯＣＯＣＣＵｓｐ．［３１等，从淀粉酶的发现至今ｄ．淀粉酶的种类已越来越多。ａ一淀粉酶能水解淀粉中的仅一ｌ，４葡萄糖苷键，导致淀粉迅速被液化，可被广泛应用于葡萄糖生产、啤酒酿造、酒精工业、发酵行业问以及纺织行业等。因此有关仅．淀粉酶的研究也是酶类中最活跃的研究领域之一。许多研究者通过筛选和育种工作，改变菌种特性，提高丫ｄ一淀粉酶活力，但由于多次使用同种诱变剂，使负变率加大，并且可能发牛平顶效应。近年来基因一Ｉ：程的飞速发展，为（Ｉｔ一淀粉酶的研究开辟了新的道路［５－６１。 酶分子的定向进化不需要事先Ｊ，解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组、门然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）｝Ｈ所需性质的突变酶１７．８１。易错ＰＣＲ技术是在采）｜ｊＴａｑ酶进行ＰＣＲ扩增同的毖阗时，通过调整反应条件（如提高酶离子浓度，改变体系中４种ｄＮＴＰ的浓度等），改变Ｔａｑ酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。ＣＨＥＮＫ等［９１用此策略定向进化枯草杆菌蛋白酶Ｅ获催化活性提高２５６倍的突变体。 本研究使用碱基类似物５．溴脱氧尿营三磷酸为诱变剂，利用热稳定性的Ｔａｑ聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变，经多轮诱变后，获得５株酶活性显著提高的诱变株。 碱基类似物掺入诱变简便、快捷，成为基因体外定向进化的又一新策略∞。研究进一步验证了这一方法的可行性，并为研究仅．淀粉酶基因突变位点和酶功能的关系提供了材料，从而为深入研究ｄ．淀粉酶基因的进化和诱变育种打下了基础。 １材料与方法 １．１试验材料 １．１．１质粒和试剂 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｔｉｃｈｉａｃｏｂ３ＤＨ５０ｔ菌株和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ质粒（２．９６ｋｂ）均ｒｆｌ本实验室保存；含野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ｃｔ一淀粉酶基冈的质粒ＰＨＮＨ００３：南术实验室构建（ｄ一淀粉酶基冈人小为１８０８ｂｐ）；限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ：均购ｆＩＴａｋａｒａ公叫：ＴａｑＤＮＡ聚介酶、肤ＲＮＡ酶、ｄＮＴＰ、矿油、ＩＰＴＧ、Ｘ—ｇａｌ、ＳＤＳ、ＴＲＩＳ、ＥＢ：购自上海生工生物工程公司。１．１．２培养基 ＬＢ培养基：在９５０ｍＬ去离子水中加入蛋白胨１０９，酵母 收稿日期：２００９．１１－０８ 基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（０９２１０２２１０２１２） 作者简介：张建云（１９７９．），女，河南南召人，讲师，研究方向为应用微生物技术；谷立坤?，讲师，通讯作者。
基因敲除大鼠模型成功建立
2010-8-24 9:53:35 Nature：基因敲除大鼠模型成功建立 8月11日，Nature在线发表了华裔科学家应其龙研究组的 最新研究成果。他们首次成功的获得了基因敲除大鼠，这是世界上第二种完成基因敲除的动物模型，该研究为进一步分析人类疾病提供了一种新的平台。 小鼠基因敲除技术是研究许多新基因的重要工具，因此这项研究成果也获得了诺贝尔奖，但是这一技术至今还未在第二种动物中实现过，而作为与小鼠同样应用广泛的模式动物：大鼠，迄今为止，科学家们还不能从遗传操作的角度在这种动物中敲除，或者添加某种基因。但是由于大鼠在很多方面更接近于人类，因此如果能实现这种模式动物的基因敲除，将有利于未来创建更有效的动物模型，用于人类疾病的研究。正如钱其军教授说的那样，“由于大鼠在很多方面更接近于人类, 因此大鼠的基因敲除模型将会广泛应用于各种研究。” 要想获得大鼠基因敲除模型，势必会遇到许多技术难题，其中的关键就在于建立能生殖传代的大鼠的胚胎干细胞株，同时也需寻找最佳受体的囊胚。研究人员首先需要对动物进行遗传工程操作，这要求科学家能将干细胞（比如生殖细胞）培养成完整的动物个体，而该研究组在之前的研究中就积累
了这方面的许多经验，其研究组一直以来都从事胚胎干细胞研究，曾发表多篇Nature，Cell文章，比如曾在Nature文章中证实干细胞移植主要原因可能是细胞融合而不是分化，这是干细胞开创性进展之一。 在最新的这项研究中，研究人员在大鼠中成功的敲除了一种p53抑癌基因，这个基因可以说是癌症研究中的明星基因，对它的研究已经从一种抑癌基因，发展到几十种抑癌基因群体，从一条单一细胞通路，发展成多种细胞信号网络。因此p53敲除大鼠模型的建立对于未来分析癌症机理，信号网络具有重要的意义。 那么为什么研究人员会选择了p53作为敲除基因？钱教授在回答这一问题的时候说，“P53基因是目前研究最多的基因之一，如P53基因突变与肿瘤发生有关，小鼠的P53基因敲除可发生肉瘤，而并非发生类似于人类癌症，而且P53基因小鼠肉瘤的发生率也较低。在大鼠中进行P53基因敲除是否会发生类似于人类癌症组织值得关注。” 在敲除基因操作方面，小鼠和大鼠有何区别？钱教授表示这两者并无明显的区别，那么也就是说在未来的应用方面，大鼠基因敲除技术很可能会像小鼠基因敲除技术一样，成为一种新型分子生物学技术，被广泛应用到生物学领域中的各个方面！（生物谷https://www.wendangku.net/doc/454029186.html,）
内参基因1
内参基因 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达 水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差， 保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样 半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改 变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本 纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内 源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物 是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解 酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的 基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、 或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数 情况下持续表达，因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的 功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1, 不存在假基因（Pseudogene），以 避免基因 DNA的扩增； 2,高度或中度表达，排除低表达； 3,稳定表达于不同类型 的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别； 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5, 其稳定的表达水平与目标基因 相似；6, 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响. 近年来的研究发现：这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织 细胞增殖和器官发育的不同阶段体外培养各种实验条件等情况下它们的表达量通 常变异较大。正确的选择内参基因, 很大程度上依赖所研究的细胞或组织, 不同的试验 需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择, 需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在 各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着 性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。
基因敲除技术的原理、方法和应用
基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
内参基因
何为内参基因 1、我记得常用的就是[color=magenta]GAPDH[/color]（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和actin，至于什么是内参，可以打个比方，比如我们要比较两个不一样大的西瓜的含糖量，不好直接比较，那就找他们都有的东西来比较，就拿西瓜子嘛，假设西瓜子是均匀分布的，而且随着西瓜的变大，糖分的增多，西瓜子也变多，那么这个西瓜子就可以作为内参了！ 不知比方准确否，请高手指教，共同进步！ 2、内参基因一般会选管家基因，是维持细胞基本代谢活动所必须的基因，在各组织和细胞中的表达相对恒定，如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 3、内参基因,表达稳定，通常用的有GAPDH,beta-actin，18s rRNA等 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。 一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。 4、半定量RT-PCR和qPCR都需要内参，简单的说内参就是在你的那个培养条件下恒定表达的某个基因。做内参就是以内参引物PCR扩增该内参基因，看在你选定的几个时间点是不是都恒定表达，如果恒定才能说明你做PCR选的RNA（一部发RT-PCR）或cDNA(两步法RT-PCR)的量是等量的，这样比较你的目的基因的丰度才有意义。 内参是相对的，不是绝对的，因为内参基因有时会受到影响。 量PCR问题--绝对定量与相对定量有什么区别？ 绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是 绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。
【CN109929876A】Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910196543.8 (22)申请日 2019.03.15 (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 (72)发明人 姜力 丁亚群 东琬婷 张勤 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 魏少伟 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/90(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (54)发明名称 Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和 应用 (57)摘要 本发明公开了Vps28基因敲除小鼠动物模型 的构建方法和应用。 本发明公开的Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法包括向受体细胞中 导入sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突 变，sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2，sgRNA1的靶序 列为序列表中序列1的第1313-1332位，sgRNA2的 靶序列为序列表中序列1的第3118-3137位。本发 明的Vps28基因突变的方法和动物模型，为研究 Vsp28基因在乳腺组织发育、泌乳以及其它生理 生化代谢过程中的作用提供了便捷、可靠、经济 的动物模型。 权利要求书2页 说明书8页序列表9页 附图3页CN 109929876 A 2019.06.25 C N 109929876 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109929876 A 1.细胞中VPS28基因的定点突变方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向VPS28基因的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2； 所述sgRNA1的靶序列为如下A1)、A2)或A3)： A1)序列表中序列1的第1313-1332位； A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列； A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列； 所述sgRNA2的靶序列为如下B1)、B2)或B3)： B1)序列表中序列1的第3118-3137位； B2)与B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA序列； B3)在严格条件下与B1)限定的DNA序列杂交的由B1)衍生的DNA序列。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突变。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白质为如下E1)、E2)或E3)： E1)氨基酸序列是序列2的蛋白质； E2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质； E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。 4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为受精卵。 5.利用权利要求1-4中任一所述的方法制备得到的VPS28基因发生突变的细胞。 6.制备VPS28基因突变动物的方法，包括：利用权利要求1-4中任一所述的方法制备VPS28基因突变的动物细胞，利用所述VPS28基因突变的动物细胞制备VPS28基因突变动物。 7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述动物为r1)或r2)： r1)哺乳动物； r2)小鼠。 8.权利要求1-3中任一所述sgRNA。 9.成套试剂，为成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3或成套试剂4； 所述成套试剂1由权利要求1-3中任一所述sgRNA与所述Cas9蛋白质组成； 所述成套试剂2由与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料和与所述Cas9蛋白质相关的生物材料组成； 所述与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料为下述F1)至F7)中的任一种：F1)编码所述sgRNA的核酸分子； F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒； F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体； F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物； F5)含有F1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因动物细胞系； F6)含有F1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有F2)所述表达盒的转基因动物组织； 2
淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌实验实验报告
(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！) 实验报告： 淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌 （amp+）中的表达
目录 相关背景 目前研究情况 简略研究步骤 相关实验详细介绍 实验结果与讨论 参考文献 1、相关背景 1、1淀粉酶 1、1、1 淀粉酶的发现和分类 淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。 淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类。 第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以钙离子为必需
因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。 按照使用条件α-淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。按产生菌不同又可分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。 第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。 第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。 第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。 1、1、2 淀粉酶的工业应用