分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容
RT-PCR
（一）总 RNA的提取
实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：
TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。
8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free
Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。
注意事项：
1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭
菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水
配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
二）反转录
实验安排：
每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样
μl4 5× Buffer
μl6dNTPs
μl1RNA 酶抑制剂
μl1Oligo （dT）μ随机引
μ反转录AMV1
μ提取RNA6
总体μ20
1h
42反应条件：℃
注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer 加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20
PCR
（三）实验安排：每人做一管。
：按下列顺序加样μ l）反应体系（50
ddHO 32.7 μl 2510×PCR Buffer μl
4μldNTPs
2P1 μl
2μlP2
0.3Taq
μl
4cDNA template μl
μl50Total
反应程序：
预变性94℃2min
30s 变性94℃
45s 退火50℃
1min 延伸72℃
30 cycles
10min ℃ 72 终延伸
PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳TBE(10×)的配制：1、电泳缓冲液，定溶至1000ml。，并加入称取Tris-base 54g，硼酸27.5g0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 、1.5% 琼脂糖凝胶的配制：2加100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10TBE 缓冲液，并加水定容至称取 1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子EB(10mg/ml) 热溶解后加入5μ l 即可用于电泳。3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μ l 产物5μl 与Loading Buffer 1 取PCR 电流进行电泳，约100V DL2000 DNA Marker 作对照，以电压，50mA 品孔旁加入 5 μ l 15min 后于紫外灯下观察结果。
注意事项：、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。 1 的试污染的手套随意拿其它无EB、禁止将盛有2EB 的器皿随意乱放，且不要戴有EB 剂或仪器。
产物的纯化(四) PCR实验安排：Gel 产物合并后作为一管，用PCR 产物回
收试剂盒( E.Z.N.A. 每两人的PCR DNA 。)回收目的Extraction Kit
操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好、1PCR产物经 1.5% 管中。1.5ml Ep重量的空管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。Ep、将装有胶粒的2．
3、按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer ，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep 管2－3 次，使胶粒完全溶解。
4、将上述溶胶液加入到HiBind spin -column 中，10000× g 离心1min ，弃去收集管中的液体。
5、加入300μl Binding Buffer ，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。
6、加入750μl SPW Buffer，静置2min，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。
7、重复步骤6。
8、空管10000×g 离心1min，以弃去DNA 回收柱中的残余液体。
9、将DNA 回收柱放入新的 1.5ml Ep 管中，并加入30μ l DNA Elution Buffer 至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA ，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。
注意事项：
1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH 升高而降低DNA 的产量。
2、在切下含目的DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜(如一次性手套) ，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。
3、切胶过程要尽可能短，防止DNA 在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA 的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。
4、DNA 的洗脱效率与Elution Buffer 的pH 有关，因此用ddHO 洗脱DNA 时，应调节2ddHO 的pH 值至8.0。2
二、基因的克隆
（一） DNA片断与载体的连接
本实验做PCR 回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。
TA克隆原理：
利用Taq酶能够在PCR产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T 载体是一种带有3'T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR 产物的克隆和测序。
实验安排：
每两人做一管。
反应体系（10μ l）：
Ligation Solution I 5μl
PCR 回收产物 4.5μl
pMD -18T vector 0.5μl
μl 10 总体积
以上16℃ 4h 反应条件：
（二）感受态细胞的制备实验安排：每人做一管。
试剂配制：：液体培养基（Luria-Bertani）、1LB 去800mlNaCl 10g，溶于称取蛋白胨（Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeast extract） 5g，分钟。高压下蒸气灭菌20 加去离子水至总体积1升,NaOH离子水中，用调pH 至7.5,
溶液：、0.1mol/L CaCl22m0.22μ定容至100ml，高压灭菌或称取 1.11g CaCl （无水，分析纯），溶于超纯水中， 2 滤膜过滤除菌。3、无菌甘油：100ml，高压灭菌即可。取甘油
（无菌操作）：操作步骤液体培养基中，2ml LBDH5 α的平板上挑取一个单菌落，接种于1、从生长有大肠杆菌振荡培养过夜，作为一级种子。℃
200r/min37 振荡培养200r/min℃ 50 比例无菌转接到5ml LB 液体培养基中，371: 2、将一级种子按0.5达到左右。约2h-3h，至细菌的OD600 30min。3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的 1.5ml Ep管中，冰浴，弃上清。离心4000 r/min10min4、4℃ 。－30min0.1mol/L CaCl、加入1ml 冰预冷的重悬沉淀，继续冰浴15min52 10min，弃上清。℃ 4000 r/min 离心6、4 悬浮的感受态细胞可直接用轻轻重悬。用冰预冷的0.1mol/L CaCl2007、沉淀中加入μ l2℃保存管，-70/10015%于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为，分装μ l 备用。
注意事项：
1、细胞生长状态：不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中取适量在LB 固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。
2、细胞生长密度：以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 来控制。6007OD 菌株的DH5 α个/ml 左右（不同菌株情况有所不同，细胞密度在
5×10）为0.5600 时比较合适。密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl 等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最2好于-20℃分装保存。
（三）连接产物的转化
实验安排：
每人做一份。
试剂配制：
1、氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：
用灭菌的ddHO将氨苄青霉素粉配成100mg/ml 水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌 2 后，置-20℃保存备用。
＋）：、LB 液体培养基（Amp2在LB 液体培养基中加入1μl 100mg/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。
＋）：固体培养基（LBAmp 3、在LB 液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉，15磅高
压蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右，加入1μl 100mg/ml 的氨苄青霉素母液后，铺制平板。待培养基凝固后，于4℃保存备用。
操作步骤：
1、取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μl ，轻轻混匀，冰浴30min 。
2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min 。
3、加入400μl LB 液体培养基，37℃ 200r/min-220r/min 振荡培养45min 后，以恢复质粒的抗性。
4、4℃ 4000r/min 离心5min，弃去上清400μl ，将剩余的100μl 菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。
注意事项：
1、质粒的浓度：转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。
3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2：以质粒代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应出现大量菌落。
四）质粒的抽提
实验安排：
每人抽提一管，采用质粒快速提取试剂盒进行。
实验原理：
本试剂盒所带Resin质子化以后，具有在高盐、低pH 值情况下吸附DNA ，在低盐、高pH 值情况下释放DNA 的性质。
试剂组成：
1、离心柱（50 个）：柱上含Resin（树脂），最大吸附量15μg，4℃保存。
2、溶液A（0.6m1）：RNase A 10mg/m1，-20℃保存。
3、溶液B（9m1）：50mM Tris/HCl ，10mM EDTA ，10mg/m1溶菌酶，pH 8.0，4℃ 保存。
4、溶液C（18m1）：1％SDS，0.2M NaOH（室温低于15℃时会有沉淀析出，加热
溶解即可）。
5、溶液D（24m1）：4M 盐酸胍，0.75M KAc pH4.6 。
6、溶液E（12ml）：洗液Ⅱ （用时加入96m1无水乙醇，充分混匀）。
7、溶液F（12ml）：洗液Ⅲ （用时加入96ml 无水乙醇，充分混匀）。
8、溶液G （5ml）：TE 缓冲液（10mM Tris/HCl ，1mM EDTA ，pH8.0），4℃保存。
操作步骤：
1、用灭菌牙签挑取单菌落于5ml 含氨苄青霉素的LB 液体培养基中12h－
16h。：注（。清上尽弃，30s心离15000r/min，液菌3ml-5ml集收管心离
1.5m1、用2．在 1.5ml 离心管中加入 1.5ml 菌液，离心收集菌体，弃上清后再加入 1.5ml 菌液，收集菌体，如此反复。）
3、加入150μl溶液B，10μl溶液A，充分振荡悬浮，室温放置5min。（注：悬浮细菌，消化RNA ，若RNA 含量很大，则消化时间可以延长。）
4、加入300μl 溶液C，温和反复颠倒混匀4-6 次，室温放置5min。（注：混匀时用力不宜过度，看到溶液变粘即可。）
5、加入450μl 溶液D，反复颠倒混匀4-6 次。（注：此时可见白色絮状物，颠倒力度可以比上步稍剧烈。）
6、12000r/min 离心5min，去沉淀。
7、将上清置于离心柱中，静置2min。（注：此时离心柱置于2ml 离心管中。）
8、8000r/min 离心30s，弃掉收集管中的液体。（注：此时DNA 被吸附于离心柱中的Resin 上。）
9、加入500μl 溶液E，8000r/min 离心30s，弃掉收集管中的液体。（注：目的是将Resin 上吸附的蛋白质、盐等杂质洗脱。）
10、加入500μl 溶液F，8000r/min 离心30s，弃掉收集管中的液体。
11、12000r/min 再次离心1min，以甩干剩余液体。（注：主要是去掉残余酒精，以利DNA 溶解。）
12、将离心管柱置于新的 1.5mlEp 管中，室温敞开离心管盖放置5-10min，加入30μl－50μl 溶液G（50℃预热）保温5min，12000r/min 离心1min，管底即为质粒DNA 。（注：溶液G 可用无菌双蒸水代替，加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。50℃预热，目的是提高产量，温度不需很准，50℃一65℃ 均可。）
13、0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
注意事项：
1、细菌培养不要超过16 小时，否则细菌会崩解，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。
2、抗生素浓度要正确，确保大肠杆菌中含有目的质粒，具体浓度可参看各类工具书。
3、电泳若显示有残余RNA ，则可延长“ 3”步消化时间。
4、若发现有染色体DNA（大分子DNA）污染，则可能是菌体太多或“ 4”步振荡过于剧烈，使染色体DNA 被打断。
5、此方法提取DNA 质量非常高，适用于分子生物学任何实验要求，OD/OD~1.5，一般情况能达到 1.7—1.8，若比值偏低，可能是菌体028260 密度太高所致，可适当减少振摇时间。此质粒若用来测序，可将第9、第10 步各重复一遍，质粒的质量会更高。
。定而质性粒质、量菌视量产体具，gμ15 为率收大最盒剂试此、6．
（五）重组质粒的酶切鉴定
实验安排：每人做一管。
反应体系（20μ l）：
重组质粒5μl
10×Buffer2μl
BamHⅠ0.5μl
EcoRⅠ0.5μ
ddHO12 2
μl 20 总体积
以上37℃ 3h 反应条件：
结果检测：同时设琼脂糖凝胶电泳检测，用1%与2μl Loading Buffer 混合后，取酶切产物10μ l 作对照。DL15000 DNA Marker
注意事项：DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。1、酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则、反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随 2 后的反应。否则，之下，的甘油中，实验中应将反应液中甘油浓度控制在1/10、3 酶通常保存在50% 酶的活性将会受到影响。时，应尽量缩短光照时间并DNADNA 分子有切割作用，因此从胶上回收4、紫外光对DNA 。采用长波长紫外灯（300-360nm），以减少紫外光切割洒到桌面EB、5EB 是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。或地面上。凡是沾污了EB
三、外源基因在大肠杆菌中的表达（一）含有表达质粒的重组细
菌的诱导表达实验安排：组）人每组做一份（6/
操作步骤：
1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3ml含Amp的LB 液体培养基中，37℃培养过夜。
2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5ml含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃ 振荡培养至OD≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3h）。600
3、取1ml 菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG 诱导剂至终浓度为0.5mM 作为实验组，两组继续
37℃振荡培养3h。
4、分别取菌液1ml 于 1.5ml Ep 管中，12000g离心30s，收获菌体。
5、用100μl 无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min。
6、通过SDS-PAGE 电泳检测外源蛋白的表达情况。
注意事项：
1、IPTG 的最佳诱导浓度的确定：将IPTG 以不同浓度（0.2－2.0mM ）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE 电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG 浓度作为其最佳诱导浓度。
2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的IPTG 诱导6h ，其间每隔1h （在第1h、2h、3h、4h、5h、6h）分别取菌液1ml，通过SDS-PAGE 电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。
（二） SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAG）E 实验安排：示范性操作。
实验原理：细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS 与
某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT ）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达
的重组体。
试剂配制：
1、30%丙烯酰胺贮存液：
丙烯酰胺29.2g，亚甲双丙烯酰胺0.8g，混匀后加ddHO，37℃溶解，定容至
100ml， 2 ℃。4 棕色瓶存于
2、1.5M Tris-HCl（pH 8.0）：
Tris base 18.17g加ddHO 溶解，浓盐酸调pH 至8.0，定容至100ml，4℃保存。
23、
1M Tris-HCl （pH 6.8） ：
Tris base12.11g 加 ddHO 溶解, 浓盐酸调 pH 至 6.8，定容至 100ml ，4℃保存。 24、 10% SDS ：
电泳级 SDS 10.0 g 加 ddHO 68℃助溶，浓盐酸调至 pH 7.2，定容至 100ml 。 25、 电泳缓冲液 （pH 8.3）：
Tris 3.02 g ，甘氨酸 18.8 g ，10% SDS 10ml 加 ddHO 溶解，定容至 1000ml 。 26、 10%过硫酸铵（ AP ）：
1g 过硫酸铵加 ddHO 至 10ml 。 27、2?SDS 电泳上样缓冲液：
1M Tris-HCl (pH 6.8) 1.0ml ， ?-巯基乙醇 1.0ml ，SDS 0.4 g ，甘油 2.0ml ，0.1%溴
酚蓝 1.0ml ，ddHO 5.0ml 。 28、考马斯亮蓝染色液：
考马斯亮蓝 R250 0.25 g ，甲醇 45ml ，冰醋酸 10ml ，ddHO 45ml 。 29、脱色液： 甲醇 45ml ，冰醋酸 10ml ，ddHO 45ml 。 2
操作步骤：
采用垂直式电泳槽装置
1、安装电泳槽
2、配制分离胶 （12%）（ 10ml ）：
ddHO 3.3ml 230%丙烯酰胺贮存胶
4.0ml 1.5M Tris-HCl
10% SDS
10% AP
2.5ml 0.1ml 0.1ml TEMED 4.0μl
混匀后灌入玻璃板间， 以水封顶，注意使液面水平。（凝胶完全聚合需 30-
60min ） 3、配制积层胶（ 5%）（3ml ）： ddHO
0.5 ml 1M Tris-HCl 2.1 ml 230%丙烯酰胺贮存胶 0.38 ml
10%SDS 10%AP l μ 3.0
TEMED 将分离胶上的水倒去， 并用滤纸吸干多余水份， 加入上述混合液， 立即将梳子插 入玻璃板间，完全聚合需 15-30min 。
4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。
5、样品处理：将样品加入等量的 2×SDS 上样缓冲液，100℃加热 3-5min ，
12000g 离心 1min ，取上清作 SDS-PAGE 分析，同时将 SDS 低分子量蛋白质 Marker 作 平行处理。
6、上样：取 10μl 诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入 20μl 低分子量蛋白 Marker 作对照。
7、电泳：在电泳槽中加入 1?电泳缓冲液， 连接电源，电泳时， 积层胶电压 80V ， 分离胶电压 120V ，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需 2-3h ）。 0.03 ml
0.03 ml
8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。
9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸
溶液中。
注意事项：
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH 值要准确，10%AP 在一周内使用
室温较低时，TEMED 的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
(三)Western Blot
实验安排：示范性操作。
实验原理：
Western免疫印迹( Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。．试剂准备：
1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml，10%SDS 6.0ml，β-巯基乙醇
0.2ml，ddH2O
2.8ml。
3、电转缓冲液：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml。
4、TBS(pH8.0)：Tris base 1.211g，NaCl 8.766g，加ddH2O 溶解后用HCl 调节pH 至8.0 ，定容至1000ml 。
5、TBST：在TBS 中加入终浓度为0.05% Tween-20 即可。
6、包被液( 5%脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉 1.0g 溶于20ml 的TBST 中。
7、显色液：DAB 6.0mg，TBS 10.0ml，30% H2O2 30μl。
操作步骤：1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞；真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min，然后4℃，13,000g 离心15min，取上清液作为样品。
2、电泳：制备聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移：（半干式转移）（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用电转缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中
10min
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2，转移1-2h。转移结束后，断开电源将膜取出做免疫印迹。
4、免疫反应：
（1）用TBST 洗膜，5min ×3 次。
（2）加入包被液，平稳摇动，室温2h。
（3）弃包被液，用TBST 洗膜，5min×3 次。
（4）加入一抗（按合适稀释比例用TBST稀释，液体必须覆盖膜的全部），平稳摇动，室温1h。
（5）弃一抗，用TBST 洗膜，5min×4 次。
（6）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用TBST 稀释），平稳摇动，室温0.5－1h。
（7）弃二抗，用TBST 洗膜，5min×3 次。
（8）再将膜转入TBS 中洗2遍，每次 5 min-10 min。
（9）加入显色液，避光显色至出现条带时立即放入双蒸水中终止反应。
注意事项：1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验复习题附答案(最新整理)
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学实验课件..
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
分子生物学实验方法与步骤
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
医学分子生物学实验技术
1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。 2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。 3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。 4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。 5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。 7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。 8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。 9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。 10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。
1、RT-PCR的基本原理 将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类 基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。 分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳 3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度 （1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。 (2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。