蛋白质冻干

蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展

1.引言

由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。

冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。

2.药品冷冻干燥原理及特点

药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可分为：药品准备、预冻、一次干燥(升华干燥)和二次干燥(解吸干燥)、密封保存等五个步骤。药品按上述方法冻干后，可在室温下避光长期贮存，需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复到冻干前的状态。与其它干燥方法相比，药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点：

a)药液在冻结前分装，剂量准确；

b)在低温下干燥，能使被干燥药品中的热敏物质保留下来；

c)在低压下干燥，被干燥药品不易氧化变质，同时能因缺氧而灭菌或抑制某些细菌的活力；

d)冻结时被干燥药品可形成"骨架"，干燥后能保持原形，形成多孔结构而且颜色基本不变；

e)复水性好，冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态；

f)脱水彻底，适合长途运输和长期保存。

虽然药品冷冻干燥具有上述优点，但是干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等仍是该技术的突出缺点。

3.药品冻干损伤和保护机理

药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。

因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。它需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。

常用的保护剂有如下几类物质：

a)糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；

b)聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；

c)无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；

d)表面活性剂：Tween 80等；

e)氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；

f)盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等；

由于冷冻干燥过程存在多种应力损伤，因此保护剂保护药品活性的机理也是不同的，可以分为低温保护和冻干保护。

对于低温保护，目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的机理之一是优先作用原理。优先作用是指蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用。在有起稳定作用的保护剂存在的条件下，蛋白质优先与水作用(优先水合)，而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外(优先排斥)。在这种情况下，蛋白质表面就比其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理同样适用于冷冻-融解过程。蛋白质保护剂，在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋白质。但是优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。

在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中，目前主要有两种：

a)水替代假说。许多研究者认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。

b)玻璃态假说。研究者认为在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂-水混合物就会玻璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。

目前大部分学者赞同"水替代假说"，因为可以通过实验检测到蛋白质和保护剂之间的氢键，为理论提供证据。事实上，无论是"水替代假说"还是"玻璃态假说"，它们的基础都是基于药液实现了部分或全部玻璃化冻结。

4冻干工艺及优化

由于药品冷冻干燥过程会产生多种应力，对冻干药品的药性有很大的影响，因此对药品冷冻干燥过程进行合理设计，对于减少冻干损伤和提高冻干药品的质量有重大的意义。

4.1冻结研究

冷冻干燥过程中的冻结过程非常重要，因为在冻结中形成的冰晶形态和大小以及玻璃化程度不仅影响后继的干燥速率，而且影响冻干药品的质量。因此在冻结过程中必须考虑配方、冻结速率、冻结方式、以及是否退火等问题。4.1.1配方的影响

配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体含量少于2%，那么冻干药品结构的机械性能就会不稳定。尤其在干燥过程中，药品微粒不能粘在基质上，逸出的水蒸气会把这些微粒带到小瓶的塞子上，有时甚至会带到真空室当中。

此外，为了获得均匀一致、表面光滑、稳定的蛋白质药品，配方中必须含有填充剂、赋形剂、稳定剂等保护剂，这些保护剂对实现药品的玻璃化冻结有重大的影响。很多糖类或多元醇经常被用于溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质的稳定剂，它们既是有效的低温保护剂又是很好的冻干保护剂，它们对冻结的影响取决于种类和浓度。文献[16～23]对不同的保护剂进行了详尽的研究，探讨了它们的冻结特性。文献[4]还研究了其它保护剂的冻结特性。但是蛋白质种类很多，而且物理化学性质各异，因此不同的蛋白质需要不同的保护剂配方，因此它们的冻结特性就不同，一般需要实验。

4.1.2冻结方式

冻结方式不同，产生的冰晶的形态和大小就不同，而且会影响后继的干燥速率和冻干药品质量。根据冻结机理，可以把冻结分为全域过冷结晶和定向结晶两类。

全域过冷结晶是指全部药液处于相同或相近的过冷度下进行冻结的方式。在全域过冷结晶中，冻结速率和冰晶成核温度是重要的参数。

全域过冷结晶按冻结速率的快慢可分为慢速冻结和快速冻结。快速冻结的冰晶细小，而且没有冻结浓缩现象，但是存在不完全冻结现象。相反，慢速冷却产生较大的冰晶，并且存在冻结浓缩的现象。Thoma s W Patapoff等人发现如果把药品直接浸入液氮或干冰-乙醇溶液槽中(快速冻结)，那么晶核首先在瓶壁产生，然后冰晶向中心扩散，再垂直向上扩散。由于长成的冰晶细小，而且有水平方向的结构，导致干燥阶段的传质阻力很大，升华速率降低。实验证明，快速冻结导致升华速率低，解吸速率快，慢速冻结导致升华速率快，解吸速率慢。

James A Searles等人认为冰晶成核温度是全域过冷结晶的重要因素，因为它是升华速率的主要决定因素。他们在研究中发现，冰晶成核温度从本质上来说是随机的、不稳定的，不容易控制，但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核体等影响因素。正是冰晶成核温度的随机性导致升华干燥速率的不均匀性以及与形态相关的参数，如冻干药品表面积和解吸干燥速率。

定向结晶是指一小部分药液处于过冷状态下进行冻结的方式。Thomas W Patapoff介绍了一种垂直冻结方式。溶液用湿冰冷却，在瓶子底部用干冰冷却，形成晶核，然后放到-50℃的搁板上冻结。用这种方式冻结的样品的冰晶在垂直方向呈现烟囱状，在药品表面没有冻结浓缩层，而且整个药品的结构均一性很好，因此在干燥时的传质阻力很小，加快了冻干速率。Martin Kramer等人采用了另外一种方式实现了定向冻结。他们在真空室压力为0.1kPa，搁板温度为+10℃的条件下，让溶液开始表面冻结，形成1～3mm左右

的冰晶薄层。然后解除真空，降低搁板温度到结晶温度以下进行冻结。在这种条件下长成的冰晶粗大，也呈烟囱状。同时在干燥阶段发现，升华干燥时间比采用一般冻结的时间节省了20%。分析冻干药品时还发现，对甘露醇，采用这种方式冻结的冻干品的剩余含水量比采用一般冻结的要多；但对蔗糖和甘氨酸，两者差别不大。H Schoof等人在冻干胶原质时也采用了定向结晶的方式。

冻结方式不同，产生的冰晶形态和大小就不同，后继的干燥速率也不同。实验证明，采用定向结晶方式的冻结药品的干燥速率比全域过冷结晶的快。但是无论采用哪种冻结方式，药品溶液必须部分或全部实现玻璃化冻结，以保护药品药性。

4.1.3退火

退火是指把冻结药品温度升到共熔温度以下，保温一段时间，然后再降低温度到冻结温度的过程。在升华干燥之前增加退火步骤，至少有三个原因：

a)强化结晶。在冻结过程特别是快速冻结过程中，配方中结晶成分往往来不及完全结晶。但是如果该成分能为冻干药品结构提供必要的支撑或者蛋白质在该成分完全结晶后会更稳定，那么就有必要完全结晶。此外，冻结浓缩液中也会有一部分水来不及析出，使其达不到最大浓缩状态。实验证明，当退火的温度高于配方的最大浓缩液玻璃化转变温度Tg’时，会促进再结晶的形成使结晶成分和未冻结水结晶完全。

b)提高非晶相的最大浓缩液玻璃化转变温度Tg’。从非晶相中除去Tg’较低的结晶成分，能够提高非晶相的Tg’。Barry J Aldous在研究非晶态碳水化合物的水合物结晶规律时发现，经过退火之后的海藻糖干燥溶液的玻璃化转变温度由31℃上升到79℃，大大提高了稳定作用。

c)改变冰晶形态和大小分布，提高干燥效率。James A Searles等人研究认为不同的成核温度产生不同的冰晶形态和粒径大小，继而导致升华干燥的速率的不均匀。但是一个过程中的干燥速率是由最慢的干燥药品确定的，因此不均匀的干燥速率会影响药品的质量和生产的经济性。研究证实退火过程中的相行为和重结晶可以减小由于成核温度差异造成的冰晶尺寸差异及干燥速率的不均匀性，提高干燥效率和药品均匀性。

为了达到退火目的，在退火操作中，必须考虑加热速率、退火温度、退火时间等参数。但是目前由于实验手段不够先进和理论知识比较缺乏，退火机理尚有疑问，退火参数的选取仍然没有依据。

4.2干燥

药品冷冻干燥的干燥过程可以分为两个阶段，一次干燥和二次干燥。在一次干燥阶段除去自由水，在二次干燥阶段除去部分结合水。干燥过程占据了药品冷冻干燥过程的大部分能耗，因此采取有效措施提高干燥速率显得非常有意义。目前，大都采取控制搁板和药品温度、冷阱温度和真空度的做法来实现干燥速率的提高。

药品温度的控制。包括冻结层和已干层的温度控制。控制冻结层温度的原则是在保证冻结层不发生熔化(在低共熔点以下)的前提下，温度越高越好。控制已干层温度的原则是在不使物料变性或已干层结构崩塌的前提下、尽量采用较高的干燥温度。而搁板温度的控制是以满足药品温度控制为标准。冷阱温度。冻干过程中水升华的驱动力是药品和冷阱间的温差。由于药品温度受加热方式的限制，同时不能高于共熔温度，因此冷阱温度越低越好。为了提高经济性，在升华干燥过程中应至少低于药品温度20℃；在解吸干燥过程中，对于那些要求很低残余水分的配方，冷阱温度要求更低。

真空度。一般认为，压力对冻干过程有正反两方面的影响：

a)在药品共熔点温度和崩塌温度以下，升华界面温度越高，升华水汽越多，所需热量越大。压力越高，相应提高了已干层导热系数，表面对流作用也越大，因此升华水汽也越快，即冻干速率越大。

b)升华界面通过已干层到外部的水汽逸出速度与界面和表面之间的压力差，即界面温度所对应的饱和压力与干燥室的真空度之差相关。这个压差大，有助于水汽逸出。这个压差越小，逸出越慢，干燥速率也越小。如果冷冻干燥是传热控制过程，则干燥速率随着干燥室压力升高而提高；如果冷冻干燥是传质控制过程，干燥速率随着干燥室压力升高而降低。

经验证明升华阶段的真空度在10～30Pa时，既有利于热量的传递，又利于升华的进行。若压强过低，则对传热不利，药品不易获得热量，升华速率反而降低，而且对设备的要求也更高，增加了成本。而当压强过高时，药品内冰的升华速度减慢，药品吸收热量将减少，于是药品自身的温度上升，当高于共熔点温度时，药品将发生熔化导致冻干失败。根据真空度对冻干速率的影响，文献[40]采用了循环压力法，得到了不错的效果。

药品冷冻干燥过程是一个连续的操作，不同的药品配方，有不同的冻结特性，而且冻干曲线也不同，因此应在基础研究的基础上广泛开展个体研究，优化冻干曲线，提高干燥速率，降低能耗。

5药品冷冻干燥机

药品冷冻干燥机的分类方法很多，按其搁板面积可分为大、中、小三种类型，通常冻干面积小于1.5 m2为小型，介于1.5m2至50m2之间为中型，大于50m2为大型；按其目的和用途可分为实验型冻干机、中试型冻干机和工业生产型冻干机。

药品冷冻干燥机主要由干燥箱、真空系统、制冷系统、冷阱系统、加热系统、加盖系统、自动控制系统等几大部分组成。此外，大中型冷冻干燥机还常有蒸气灭菌系统(SIP)、在位清洗系统(CIP)。

制冷系统分别为冷冻干燥箱和冷阱系统提供冷源。目前采用的单级制冷压缩循环的板层制冷温度约在-35℃～-40℃之间，冷阱温度在-50℃左右；双级制冷压缩循环的板层制冷温度在-45℃～-50℃之间，冷阱温度在-65℃左右；复叠式制冷循环的板层制冷温度在-55℃～-60℃之间，冷阱温度在-75℃左右。

冷冻干燥机的控制主要是对制冷机、真空机组、加热功率的起停及温度的控制，对真空度、温度的测定、监控、以及自动保护、报警装置等。采用全自动控制或微电脑控制的冻干机都能显示各主要部件的工作状态，显示干燥箱内搁板和药品的温度、真空度、捕水器温度，都能进行参数设定、修改和实时显示。

药品冷冻干燥机必须执行GMP规范标准，实现高度无菌化、无尘化，达到高度可靠、安全、维护简便。为此药品冷冻干燥机往往采用蒸气灭菌系统(SIP)以保证灭菌彻底、无死角。同时辅以在位清洗系统(C IP)，对干燥室、冷凝器、主阀及管道进行就地清洗预设排液坡度，保证无液体滞留。同时具有应对停电、停水、误操作的保护措施，一旦出现故障，可以对药品实行保护；实现冻干机操作运行的计算机控制，具有停电停水三对策系统，可以多路联锁自动报警。

由于药品冷冻干燥机必须执行GMP规范标准，因此今后药品冷冻干燥机的研究仍将朝着无菌化和高度可靠性的方向进行，如自动进料方式、真空控制方式等的研究。

随着生物技术的高速发展，多肽蛋白质类药物不断涌现，可应用于临床的多肽、蛋白酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等成为开发重点。为防止药品变性，目前广泛采用冷冻干燥法制备称固态药品。经过几十年的发展，药品冷冻干燥技术虽然有了很大的进展，但是仍存在不少问题，亟需解决。在冷冻干燥过程中会产生多种冻结和干燥应力，使药品发生不同程度的变性，而且冻干法本身也存在干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等缺点。因此为了提高药品的稳定性和经济性，必须对药品在冻干过程中的损伤和保护机理进行进一步的研究，同时利用先进的制冷和真空设备及控制手段开发价格低、性能好的冷冻干燥机，继续完善低温低压下的传热传质理论，优化冻干工艺。

吨的中等规模的冻干车间。

冻干曲线程序的制定

生物制品经冷冻干燥后具有一定的物理形态，如均匀的颜色、合格的残余水份含量、良好的溶解性、高的存活率或较长的保存期等。因此，不仅要对冻干过程和冻干后的密封保存进行控制，更重要的是对冷冻干燥过程的每一阶段的各参数进行全面的控制，才能得到优质的产品。冻干曲线和时序就是进行冷冻干燥过程控制的基本依据。

冻干曲线和时序不仅是手工操作冻干机的依据，也是自动控制冻干机操作的依据。例如，利用凸轮法和滚筒法进行冻干机的自动控制时，凸轮和滚筒的刻划依据就是冻干曲线和时序，在用微处理机对冻干机进行控制时，操作程序的编制依据也是冻干曲线和时序，按照微机的一定要求把冻干曲线和时序用操作键盘输入微机的贮存器内。

冻干曲线是冻干箱板层温度与时间之间的关系曲线。一般以温度为纵坐标，时间为横坐标。它反映了在冻干过程中，不同时间板层温度的变化情况。

冻干时序是在冻干过程中不同时间，各种设备的启闭运行情况。

制定冻干曲线以板层为依据是因为产品温度是受板层温度支配的。控制了板层温度也就控制了产品温度。

制定冻干曲线要考虑下列因素：

产品的品种：产品不同则共熔点亦不同，共熔点低的产品要求预冻的温度低；加热时板层的温度亦相应要低些。有些产品受冷冻的影响较大，有些产品则影响较小；一般细菌性的产品受冷冻的影响较大，病毒性的产品受冷冻的影响较小。要根据试验找出一个产品的最优冷冻速率，以获得高质量的产品和较短的冷冻干燥时间。另外产品不同，对残余水份的要求也不同。为了长期保存产品，有些产品要求残余水份含量低些。有些则要求高些。残余水份含量要求低的产品，冻干时间需长些。残余水份含量要求高的产品，冻干时间可缩短。

装量的多少也影响着冻干曲线的制定。一个是总装量的多少，一个是每一容器内产品装量的多少。装量多的冻干时间也长。

容器的品种也是需要考虑的因素，底部平整和较清洁的瓶子传热较好。底部不平或玻璃厚的瓶子传热较差，后者显然冻干时间较长。

冻干机性能的优劣直接关系到冻干曲线的制定，冻干机有各种不同的型号，因此它们的性能也各不相同。有些机器的性能好，例如板层之间，每板层的各部分之间温差小；冷凝器的温度低，冰负荷能力大；冻干箱与冷凝器之间的水蒸汽流动阻力小；真空泵抽速快，真空度好而稳定。有些机器则差一些。因此尽管是同一产品，当用不同型号的冻干机进行冻干时，曲线也是不一样的，照搬其它型号机器的冻干曲线不一定能冻出好的产品来。

制定冻干曲线和时序时要确定下列数据：

1.预冻速度

预冻速度大部分机器不能进行控制，因此只能以预冻温度和装箱时间来决定预冻的速率，要求预冻的速率快，则冻干箱先降至降低的温度，然后才让产品进箱；要求预冻的速率慢，则产品进箱之后再让冻干箱降温。

2.预冻的最低温度

这个温度取决于产品的共熔点温度，预冻最低温度应低于该产品的共熔点温度的5℃～7℃。

3.预冻的时间

产品装量多，使用的容器底厚而不平整，不是把产品直接放在冻干箱板层上冻干，冻干箱冷冻机能力差，每一板层之间以及每一板层的个部分之间温差大的机器，则要求预冻时间长些。为了使箱内每一瓶产品全部冻实，一般要求在样品的温度达到预定的最低温度之后再保持1－2小时的时间。

4.冷凝器降温的时间

冷凝器要求在预冻末期，预冻尚未结束，抽真空之前开始降温。降温时间要由冷凝器机器的降温性能来决定，要求在预冻结束抽真空的时候，冷凝器的温度要达到-40℃左右，好的机器一般半小时后开始降温。

冷凝器的降温通常从开始之后一直持续到冻干结束为止。温度始终应在-40℃以下。

5.抽真空时间

预冻结束就是开始抽真空的时间，要求在半小时左右的时间真空度能达到20Pa。

抽真空的同时，也是冻干箱冷凝器之间的真空阀打开的时候，真空泵和真空阀门打开同样一直持续到冻干结束为止。

6.预冻结束的时间

预冻结束就是当物料被预冻至共熔点温度以下约2小时左右（视物料冻干量而定），通常在抽真空及进行程序控温启动之前结束。

7.开始加热时间

一般认为开始加热的时间（实际上抽真空开始升华即已开始）。开始加热是在真空度达到10 Pa之后（接近1×10-1毫米汞柱），开始加热；有些冻干机是在抽真空之后半小时开始进行程序控温，这时真空度已达到10 Pa甚至更低。

8.产品加热的最高许可温度

板层加热的最高许可温度根据产品来决定，在升华时板层的加热温度可以超过产品的最高许可温度因为这时产品仍停留在低温阶段，提高板层温度可促进升华；但冻干后期板层温度需下降到与产品的最高许可温度相一致，由于传热的温差，板层的温度可比产品的最高许可温度略高少许。

9.冻干的总时间

冻干的总时间为预冻时间，加上升华时间和第二阶段工作的时间。总时间确定，冻干结束时间也确定。

这个时间根据产品的品种，瓶子的品种、装箱方式、装量、机器性能等来决定，一般冷冻工作的时间较长，在18－24小时左右，有些特殊的产品需要几天的时间。

药品冷冻干燥技术

1 引言 由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。 冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。 2 药品冷冻干燥原理及特点 药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可分为：药品准备、预冻、一次干燥(升华干燥)和二次干燥(解吸干燥)、密封保存等五个步骤。药品按上述方法冻干后，可在室温下避光长期贮存，需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复到冻干前的状态。与其它干燥方法相比，药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点： a) 药液在冻结前分装，剂量准确； b) 在低温下干燥，能使被干燥药品中的热敏物质保留下来； c) 在低压下干燥，被干燥药品不易氧化变质，同时能因缺氧而灭菌或抑制某些细菌的活力； d) 冻结时被干燥药品可形成"骨架"，干燥后能保持原形，形成多孔结构而且颜色基本不变； e) 复水性好，冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态； f) 脱水彻底，适合长途运输和长期保存。 虽然药品冷冻干燥具有上述优点，但是干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等仍是该技术的突出缺点。

冷冻干燥技术在食品方面的应用实践分析

冷冻干燥技术在食品方面的应用实践分析 发表时间：2019-09-21T14:40:24.110Z 来源：《基层建设》2019年第19期作者：余志刚 [导读] 摘要：本文主要针对在食品方面冷冻干燥加工处理技术的实践应用开展深入研究，望能够为相关专家及学者对这一课题的深入研究提供有价值的参考依据。 佛山市南海区西樵食品集中加工中心有限公司广东佛山 528000 摘要：本文主要针对在食品方面冷冻干燥加工处理技术的实践应用开展深入研究，望能够为相关专家及学者对这一课题的深入研究提供有价值的参考依据。 关键词：冷冻干燥；技术；食品方面；应用实践； 前言： 伴随着社会经济持续发展，带动了各行业领域的快速发展，比如食品加工领域发展势头呈现着日益迅猛趋势，对各项加工处理技术要求逐渐提升。冷冻干燥加工处理技术，属于食品方面加工处理主要技术之一，需得到食品加工领域的普遍关注及重视。 1、概述冷冻干燥加工处理技术 1.1 技术原理 冷冻干燥加工处理技术基本原理即为：把含水新鲜物料全部冷冻至冰点下范围，以至于物料内部游离水逐渐转变成冰晶的形态，再把冰转化成水蒸气，将水分去除的冷冻干燥加工处理技术。从总体上来说，该项技术主要就是把水实现物质变化及转移全过程。水处于不同温度与压力状态，会以三种形态存在着，即为固态冰、液态水及气态水。这几种状态能够实现相互依存及转化。水，它三相点的温度即为 0.0098℃，三相点的压力即为609.3Pa，处于以上条件之下，三种状态的水可处于平衡状态。依据压力减小而沸点降低这一原理，环境压力只要处于三相点的压力范围下，物料内部水分便可不经液相直接实现升华及去除，故借助该方法便可实现产品加工操作。 1.2 产品特征 食品在经冷冻干燥加工处理之后，在食品基质当中水分活度可得到降低，对于部分酶活性与微生物的生长可起到抑制作用，将生化与化学反应速度降低，促使食品腐烂与变质的速度逐渐减缓，维持天然食品最初新鲜度、营养成分、风味、色泽等，食品保质期能够得到延长，以下是对冷冻干燥加工处理技术基本特征的具体阐述： 1.2.1 保持良好营养成分 因冷冻干燥加工处理技术，属于低温环境下实施加工操作，故能够保持住被加工物料内部所含蛋白质、碳水化合物、微生物等多种营养成分，冷冻干燥加工处理期间，VC实际损失率会控制在10%范围。 1.2.2 维持原有风味 通过在食品加工方面运用冷冻干燥加工处理技术，能够有效维持被加工物料原有风味构成，并不会对风味成分结构产生破坏作用，可以维持着被加工物料原有外部形态，不会改变热敏性的物质与天然色素，确保芳香物质有着较低损失率。 1.2.3 较长保质期 食品物料处于低温环境下开展冷冻干燥加工处理，物料内部酶作用与微生物在加工处理期间均会有被抑制现象出现，物料经冷冻干燥加工处理过后，产品内部并不含有着游离水，故食品并不容易出现腐烂变质情况，食品的保质期限能够得以延长。 1.2.4 方便运输 冷冻干燥加工处理技术，其脱水相对较为彻底，经冷冻干燥加工处理之后，产品体积相对较小，质量也相对较轻，比较方便于常温下贮存及运输。 1.2.5 复水性良好 冷冻干燥加工处理技术，其复水性良好，实际复水率一般会超过90%，复水过后，与加工处理前期相比，食品在口味、形态、色泽、外观方面并无明显差异性。因被干燥物料内部所含水分处于冻结状态被直接蒸发处理，故干燥处理期间，水分并不会带动着可溶性的物质逐渐转移至物料表面，物料表面并不会有硬质薄皮形成，物料干燥加工处理过后，也不会出现收缩坍塌变形情况。故而，冷冻干燥加工处理后产品的内部会有多孔海绵状的结构出现，吸水后可恢复至原有状态。 1.3 工艺流程与实际操作要点 1.3.1 流程 冷冻干燥加工处理技术工艺流程主要包括：预处理原料、速冻处理、脱水干燥加工处理、包装至成品。 1.3.2 要点 ①预处理操作 在这一加工处理工序当中，是指筛选物料、其清洗与切分物料，并对物料进行漂烫及杀菌处理，目的为将杂质与被污染的变质部分去除掉，彻底清除掉附在食品表面虫卵或者泥土等，但应当尤为注意漂烫的时间与温度必须得以合理把控，防止加热漂烫过度而对食品品质产生不良影响。 ②速冻处理 迅速冻结已经预处理后物料，冻结的温度通常低于共晶点的温度约5℃，也可依据实际情况调至更低的温度状态。物料共晶点往往有差异性存在着，故应调整好冻结的实际温度，冻结期间应冻透物料，防止残留过多水分，对物料形态与品质等产生不良影响，需注重对冻结速度合理把控，所形成冰晶若越小，则物料内部组织结构遭受到的破坏程度也就相对较小一些。此外，还应当注意预处理物料过后，必须尽快实施速冻加工处理，防止其长时间暴露于空气当中而影响到食品品质。 ③脱水与干燥处理 脱水干燥加工处理，主要包含着升华与解析两个环节，升华，是将物料内自由水去除掉，而解析则是将物料内部结合水去除掉。升华加工处理环节，经速冻处理后产品必须及时实施升华干燥处理，防止原料升温对干燥产生影响，应从食品表面着手进行升华加工处理，带走热量，及时供给好升华热，以维持住升华温度处于恒定不变状态；解析环节，待升华加工处理完毕，物料内部已去除了游离水，但仍然存在着结合水，若未能得到及时处理，则会对产品保质期与稳定性产生不良影响，故必须及时做好解析加工处理，确保水分子所获取足够

04 冷冻干燥保护剂

04 冷冻干燥保护剂 冻干保护剂 一、冻干损伤机理: 蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。预冻 过程中水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏，从而使活性损失;另外，水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在 不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化，导致活性物质所处的环境 发生变化而造成失活或变性。 二、冻干保护作用机理: 第一，“水替代假说”:认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢 键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，蛋白的主相变温度会升高，发生变性。但某些糖类属于亲水性物质，形成氢键能力较强，能替代蛋白表面的水的羟基，与蛋白质中的极性基团形成氢键，使得蛋白的主相变温度变化不大，低于操作温度，从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。能够直接测量到冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键。 第二，“玻璃态假说”:认为在含糖溶液的干燥过程中，糖-水混合物会玻璃 化，兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶;且分子扩散系数很低， 因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。 研究表明，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行 为，只是玻璃化转变温度不同而已。由于某些糖的玻璃化温度较高，在较高的保存温度下，仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态。(大于玻璃化温度就不形成玻璃态了)

一般说来，如工作温度低于保护剂的玻璃化温度，高于被保护的活性物质的主相变温度，那么该活性物质就能有效地保持活性。但在目前，这两种假说还不能完全解释现有的实验现象。 三、冻干保护剂的选择: 冻干保护剂需要具备四个特性:玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。常用的保护剂有如下几类物质: 1.糖类/多元醇:蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等;其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。 2.聚合物:HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等; 3.无水溶剂:乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等; 4.表面活性剂:Tween 80等; 5.氨基酸:L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等; 6.盐和胺:磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等; 具体分类: (一)按相对分子量分 1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用。如: 酸性物质:谷氨酸、天冬氨酸、乳酸; 中性物质:葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇D; 碱性物质:精氨酸、组氨酸。 2.高分子化合物高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如:白蛋白、明胶、蛋白胨、脱脂奶粉。 明胶水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为,12?。对微生物的保护作用高出普通明胶10,以上。

冷冻干燥原理

. 冻干机的原理 干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多， 如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是 在0℃以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩 小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会 损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。微生物 会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等。因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。而冷冻干燥法不同于以上的干燥方法，产品的干燥基本上在0℃以下的温度进行，即在产品冻结的状态下进行，直到后期，为了进一步降低产品的残余水份含量， 才让产品升至0℃以上的温度，但一般不超过50℃。 冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体， 然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后疏松多孔体积不变。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对 产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。 物质在干燥前始终处于低温（冻结状态），同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象，避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状，体积基本不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上防止干燥物质的理化和生物学方 面的变性。

它的工作原理是将被干燥的物品先冻结到三相点温度以下， 然后在真空条件下使物品中的固态水份（冰）直接升华成水蒸气，从物品中排除，使物品干燥。物料经前处理后，先进行速冻，再真空干燥升华脱水，之后在后处理车间包装。真空系统为升华干燥仓建立低气压条件，加热系统向物料提供升华潜热，制冷系统向捕水器和干燥仓提供所需的冷量。对冻干制品的质量要求是：生物活性不变、外 观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。要获 得高质量的制品，对冻干的理论和工艺应有一个比较全面的了解。冻干工艺包括预冻、升华和再冻干三个分阶段。合理而有效地缩短冻干的周期在工业生产上具有明显的经济价值。 一制品的冻结( 预冻)

冷冻干燥原理

冻干机的原理 干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是在o c以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。微生物会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等。因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。而冷冻干燥法不同于以上的干燥方法，产品的干燥基本上在0C以下的温度进行，即在产品冻结的状态下进行，直到后期，为了进一步降低产品的残余水份含量，才让产品升至0C以上的温度，但一般不超过50C。 冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后疏松多孔体积不变。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。 物质在干燥前始终处于低温（冻结状态），同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象，避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状，体积基本不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上防止干燥物质的理化和生物学方面的变性。

水的相平術图 然后在真空条件下使物品中的固态水份 （冰）直接升华成水蒸气， 从物品中排除，使物品干燥。物料经前处理后，先进行 速冻，再真空 干燥升华脱水，之后在后处理车间包装。真空系统为升华干燥仓建立 低气压条件，加热系统向物料提供升华潜热，制冷系统向捕水器和干 燥仓提供所需的冷量。对冻干制品的质量要：生物活性不变、外观色 泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。要获得高 质量的制品，对冻干的理论和工艺应有一个比较全面的了解。 冻干工 艺包括预冻、升华和再冻干三个分阶段。合理而有效地缩短冻干的周 期在工业生产上具有明显的经济价值。 一制品的冻结（预冻） 在真空冷冻干燥过程中，需要先对被干燥的药品进行预冻，然后 在真空它的工作原理是将被干燥的物品先冻结到 三相点温度以下 , ° 0 0L 374憑度厂C

蛋白药物冻干工艺研究汇

一、冷冻干燥过程研究 真空冷冻干燥是先将制品冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气。再用真空系统的冷凝器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品的技术。该过程主要可分为：制品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存五个步骤。 1 产品预冻 1.1 制品的玻璃化 玻璃化的作用。近年来，人们已经逐渐地认识到，凡是成功的低温保存，细胞内的水均以玻璃态的形式被固化，在胞内不出现晶态的冰。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，分子的能动性几乎为零，由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性。 玻璃化的获得。在产品预冻时，只要降温速率足够快，且达到足够低的温度，大部分材料都能从液体过冷到玻璃态固体。“足够快”的意思是在降温过程中迅速通过结晶区而不发生晶化，“足够低”指的是必须把温度降到玻璃化转变温度Tg以下。 对于具有一定初始浓度的细菌制品，其预冻过程一般通过“两步法”来完成。第一步是以一般速率进行降温，让细胞外的溶液中产生冰，细胞内的水分通过细胞膜渗向胞外，胞内溶液的浓度逐渐提高；第二步是以较高速率进行降温，以实现胞内溶液的玻璃化。此法又称“部分玻璃化法”。 当初始浓度为A的溶液（A点）从室温开始冷却时，随着温度的下降，溶液过冷到B点后将开始析出冰，结晶潜热的释放又使溶液局部温度升高。溶液将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻溶液随温度下降，浓度不断升高，一直下降到熔融线(Ta)与玻璃化转变曲线(Tg)的交点(D点)时，溶液中剩余的水分将不再结晶(称为不可冻水)，此时的溶液达到最大冻结浓缩状，浓度较高，以非晶态的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。 1.2降温速率与预冻温度 预冻速度决定了制品体积大小、形状和成品最初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分钟降温1℃左右。 对结晶性制剂而言，冻结速度一般不要太慢，冻结速度慢虽然便于形成大块冰晶体，维持通畅的升华通道，使升华速度加快，但如果结晶过大、晶核数量过少、制剂的结晶均匀性差，也不利于升华干燥。对于一些分子呈无规则网状结构的高分子药物，速冻能使其在药液中迅速定型，使包裹在其中的溶媒蒸汽在真空条件下迅速逸出，反而能使升华速度加快。因此，溶液的最佳冷冻速度是因制剂本身的特性不同而变化的。如蛋白多肽类药物的冻干，慢速冻结通常是有利的，而对于病毒、疫苗来说，快速降温通常是有利的。20世纪60年代，人们成功地保存了哺乳动物的某些细胞，其降温程序是：以1℃/min

蛋白质药品的真空冷冻干燥技术及研究进展

２００６年第１５卷第１３期 蛋白质药品的真空冷冻干燥技术及研究进展 药学专论 张敬如，黄复生，王昆 （第三军医大学基础部病原生物学教研室，重庆４０００３８） 摘要：目的介绍真空冷冻干燥技术制备蛋白质药品的方法。方法查阅国内外近年来有关文献，综述了真空冷冻干燥原理、蛋白质药品的 冻干工艺及药品贮存期间影响其活性的各个因素。结果真空冷冻干燥过程中可引起蛋白质药品不同程度的变性，加入保护剂可增加其稳定性。结论冷冻干燥时，不同的蛋白质药品需加入不同的保护剂。 关麓词：冷冻干燥；蛋白质；保护剂 中图分类号：ＴＱ４６０．６；Ｒ９７７．６文献标识码：Ａ文章编号：１００６—４９３１（２０％）１３—００２５—０３ ＬｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＰｒｏｔｅｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＺｈａｎｇＪｉｎｇｒｕ，ＨｕａｎｇＦⅢｓｈｅｎｇ，ＷａｎｇＫｕｎ ｆＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，ＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙ＂ＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ４０００３８） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｔｒｏｄｕｃｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｓｏｌｉｄｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｂｙｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｏｒｅｖｅｉｗｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｏｆｉｎｌａｎｄａｎｄｏｖｅｒｓｅａｓ，ｄｉｓｃｕｓｓｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｄｕｒｉｎｇｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇａｎｄｌｏｎｇ—ｔｅｒｍｓｔｏｒａｇｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｍａｙｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎｓｄｅｎａｔｕｒｅｄｔｏ ｖａｒｉｏｕｓｄｅｇｒｅｅｓ．Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓｉｎａｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｍａｙｂｅｐｒｏｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｄｕｒｉｎｇｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓａｒｅｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ 为了获得较稳定的蛋白质药品，通常将其制备成固体制剂，最常用的方法是真空冷冻干燥（ｖａｃｕｕｍｆｒｅｅｚｅｄｒｙｉｎｇ），然而，在冷冻干燥过程中存在着引起蛋白质不同程度变性的不利因素。因此，分析导致蛋白质变性的因素，加入适当的稳定剂，优化冷冻干燥过程，有利于生产出高质量的蛋白质药品。 １真空冷冻干燥的原理及特点 冷冻干燥就是将需干燥的物料在低温下先行冻结至其共晶点以下，使物料中的水分变成固态的冰，然后在适当的真空环境下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水，从而获得干燥的药品。冷冻干燥过程主要可分为预冻、一次干燥（升华干燥）和二次干燥（解吸干燥）３个步骤。与其他干燥方法（如热风烘干、喷雾干燥、蒸发、远红外线烘干、微波干燥等）相比，药品冷冻干燥法有极大的优越性：１）药液在冻结前分装，剂量准确；２）由于在低温、真空状态下完成整个干燥过程，因而保持了生物的活性，尤其对于热敏和易氧化的物料；３）冻结时被干燥药品可形成“骨架”，干燥后能保持原形，体积几乎不变；４）冻干药品疏松多孔，呈海绵状，复水性好，可迅速吸水还原成冻干前的状态；５）药品脱水彻底，能长期保存。 ２冷冻干燥过程中影响蛋白质稳定性的因素 ２．１蛋白质变性机理 普遍认为，冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。Ｄｅａｎ等”１认为在缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性，而脱水过程也能使蛋白质损伤、失去活性。关于蛋白质变性的机理，大多数研究者认为，蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温过程中周围的水分子不断被冻结，但只要表面的单层水分子没有冻结，蛋白质就不会变性，反之，蛋白质就会变性。蛋白质表面覆盖的单层水分子开始冻结时，其表面的氢键和极性基团就会暴露在周围环境中而变性担一Ｉ。 ２．２引起蛋白质损伤的各种应力 ２．２．１低温应力：很多研究已证明低温可引起药物活力改变。冷冻过程中，随着温度的降低，蛋白质内水的含量逐渐减少，张力不断增加，达到一定程度时结构会发生显著变化而产生变性［４１ｏ某些蛋白质在一定温度下可达到最大稳定性，温度过高或过低都会引起活性损失。 ２．２．２浓度效应：冷冻时由于冰晶形成，溶液中各组分浓度可快速增加，许多与浓度有关的物理特性（如离子强度等）被相应改变，因而使药物活性受到影响ＩＳｊ。通常低温使化学反应速度减慢，但在部分冷冻液中，由于浓度增加也可使化学反应速度加快。２．２．３ｐＨ值改变：许多药物只有在一定ｐＨ值范围内才能保持稳定，超出此范围，由于电荷间静电排斥等作用的增加可引起其伸展或变性№ｌ。冷冻过程中缓冲盐结晶可引起ｐＨ值改变，进而影响ｐＨ值敏感药物的稳定性。如磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠共熔点为一２℃，冷冻过程中可先从溶液中结晶析出，ＮａＨ：ＰＯ。／Ｎａ：ＨＰＯ。摩尔比发生改变，ｐＨ值随之改变１７“１。另外，如果在配方中加入ｐＨ值较高的缓冲液，可降低其玻璃转化温度（ｇｌａｓｓｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｒ）而破坏其稳定性旧Ｉ。 ２．２．４相分离：由于低温状态下聚合体溶解度发生改变，冷冻过程中聚合物可引起相分离。溶解于磷酸盐缓冲液中的重组血色素冷冻时可产生液一液相分离”ｏＩ，即使在系统中加入５％蔗糖或海藻糖等保护剂也不能预防。冷冻期间相分离引起的聚合物活性变化，可通过选择不同的盐或调整聚合物相关组分来预防”“。 ２．２．５脱水应力：对于亲水性药物，暴露于贫水环境中时，质子可转变为离子导致电荷丢失而引起干燥变性。干燥脱水可破坏蛋白质表面水合层，引起蛋白质变性。冻于脱水时，不同位置药品含水量明显不同，含水量不均可使局部过干，脱水引起的变性更显著。 ３蛋白质冷冻干燥过程中保护剂的应用 为获得均一、稳定的冻干药品，配方中需加入保护剂，除能提高药品的Ｔｇ外，还能与蛋白质表面的极性基团形成氢键，防止药品失水后氢键直接暴露在周围环境中，从而减少药品的损伤、变性和凝聚。关于保护剂使蛋白质保持稳定的机理目前有两种观点：一种认为具有黏性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，阻止蛋白质的伸展和沉淀；另一种认为，由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连结，当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂能通过氢键与蛋白质分子相连，保护氢键的连结 中国药业Ｃｈｉｎ口ＰｈａｒｍｎｃｅＨｔｉｃ口Ｉｓ—————————————————————————————————一‘２５。

蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展

蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展 1 引言 由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知，国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76。 冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。进入上个世纪的八九十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。 2 药品冷冻干燥原理及特点 药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可：药品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）和二次干燥（解吸干燥）、密封保存等五个步骤。药品按上述方法冻干后，可在室温下避光长期贮存，需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复到冻干前的状态。与其它干燥方法相比，药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点： a) 药液在冻结前分装，剂量准确； b) 在低温下干燥，能使被干燥药品中的热敏物质保留下来； 在低压下干燥，被干燥药品不易氧化变质，同时能因缺氧而灭菌或抑制某些细菌的活力；

糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制

糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制 【关键词】蛋白质 摘要论述了冷冻干燥过程对蛋白质药品的损伤及糖类在此过程中的保护作用机制，并分析了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、葡聚糖等几种糖作为保护剂的功能特点。 关键词糖；冷冻干燥；蛋白质；保护剂 1 冷冻干燥的损伤作用 冷冻干燥的实质是物质(水蒸汽)和能量的转换传递〔3〕。生物材料在冻干时，必须经历水变成冰的冻结过程。这是一个物理学的状态变化，同时还伴随着化学变化。这些变化，将使受冻结的生物材料受到影响〔4〕。 蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。预冻过程中水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏，从而使活性损失；另外，水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化，导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。 在第一阶段升华干燥时90 %以上的水分被升华除去。第二阶段再干燥主要是除去药品中的残留水分。残留水分过多，生化活性物质容易失活，大大降低了稳定性。Thomas〔5〕报道，残留水分的水平对冻干物质的是否产生非定形的结晶相当重要。控制冻干药品中的残留水分，关键在于第二阶段再干燥的控制。因此在实际操作中，应该在保证药品活性的条件下，选择能允许的最高温度进行第二阶段再干燥，真空度的控制尽可能提高，有利于残留水分的逸出。但冻干品的水分并不是越低越好〔6〕。因为每种蛋白质药品都含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。另外，Shan〔7〕的研究表明残留水分对蛋白质活力的回复影响最大。 0. . 除此之外，在冷冻贮藏中，由于冰晶与蛋白质的水合水的相互作用，使冰晶接近蛋白质的水合层，形成格子构造，水合层的水分子向冰晶的方向移动，产生脱水合现象，使蛋白质的水合构造遭到破坏〔8～10〕。因而使蛋白质的高级结构发生改变，蛋白质的生理功能受到影响。 关于冷冻干燥对蛋白质的变性机理目前普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。Dean〔11〕认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性；而脱水过程本身能使蛋白质损伤，从而使复水后的蛋白质失去活性。许多学者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温过程中，蛋白质分子周围的水分子不断冻结，但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结，则蛋白质就不会变性；反之，蛋白质就会变性。Hanafusa 〔12〕利用在冷冻干燥过程中把卵清蛋白(ovalbumin)和肌球蛋白(myosin)进行了冷冻干燥对比实验，表明正是由于蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子，才使蛋白质在冷冻过程中不发生变性作用。当蛋白质表面的单层水分子开始冻结时，蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。同样，在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。因此，在冷冻干燥蛋白质药物的过程中，一般要加入保护剂，防止由于

医用真空冷冻干燥技术原理简介 一、真空冷冻干燥的定义与优点： 制品

医用真空冷冻干燥技术原理简介 一、真空冷冻干燥的定义与优点： 制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥（Freeze-drying），简称冻干。 冻干的固体物质由于微小的冰晶体的升华而呈现多孔结构，并保持原先冻结时的体积，加水后极易溶解而复原，制品在升华过程中温度保持在较低温度状态下（一般低于-250C），因而对于那些不耐热的物质，诸如酶、激素、核酸、血液和免疫制品等的干燥尤为适宜。干燥的结果能排出95~99%以上的水份，有利于制品的长期保存。制品干燥过程是在真空条件下进行的，故不易氧化。针对部分生化药物的化学、物理、生物的不稳定性，冻干已被实践证明是一种非常有效的手段。随着生化药物与生物制剂的迅速发展，冻干技术将越来越显示其重要性与优越性。 二、医用冷冻干燥机的结构与功能简介： 医用冷冻干燥机系由制冷系统、真空系统、加热系统、电器仪表控制系统所组成。主要部件为干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵、加热/冷却装置等。 制品的冻干是在干燥箱中进行，干燥箱内搁板采用不锈钢板制成，内有媒体导管分布其中，可对制品进行冷却或热，干燥箱的后面装有真空传感器，它将真空度转变成电讯号，箱门四周镶嵌有密封橡胶圈，临用前可涂以真空硅脂保证箱体的密封。

凝结器最好为缠绕柱面式，不锈钢柱面外绕有多组冷气盘管，其工作温度低于干燥箱内制品的温度，最低可达-550C，从制品中升华出来的水蒸气能充分地凝结在与冷盘管相接触的不锈钢柱面的内表面上，从而保证冻干过程的顺利进行，光滑的柱面式结构最大的优点是容易清洁，在冻干结束后，可用电热将霜层除去。 旋片式真空泵用以对系统抽真空，在机械泵的进气口安装了一个带自动放气的电磁真空阀，它与旋片泵为同一电源控制，当停泵时，电磁阀门自动关闭，同时向真空泵内放气，既保护了真空系统，又防止了真空泵向系统返油。 在制冷系统中，二台2.2Kw的半封闭冷冻机并联使用，由风冷凝器出来的高压制冷剂液体（无氟制冷剂V55C），经过干燥过滤器及电磁阀到达毛细管，经节流后进入蒸发器，由于冷冻机的抽吸作用，使蒸发器内的压力下降，液体制冷剂吸收环境的热量而迅速沸腾蒸发。低压制冷剂气体被冷冻抽回，再经压缩成高压气体，完成一次制冷循环，加热/冷却装置中的冷排管以凝结器中的冷排管以及凝结器中的冷气盘管恪于制冷系统中蒸发，它们是通过两个不同的电磁阀来供应制冷剂的。 加热系统由电热管，媒体（硅油）、媒体泵、媒体箱等组成一个循环管路，硅油经电热管加热后，由媒体泵输送至干箱搁板中的媒体导管，对制品进行加温，提供升华热，当冻结时，则由冷却排管对硅油进行降温，由媒体泵输送至干燥箱搁板中心的媒体导管，对制品进行冷却及冻结。

蛋白质在加工和贮藏中的变化讲解

蛋白质在加工和贮藏中的变化 2013级食品质量与安全X班 XXX 201330520XXX 摘要：本文以蛋白质为研究对象，探索了其在加工和贮藏这两大过程中理化性质的变化，包括热处理、碱处理、脱水处理、辐射处理等等，发现蛋白质在这些因素的作用下均有一定程度的改变。其中研究发现，在加工过程中，会有不利的如热变性、美拉德反应、赖丙复合物(LAL)生成、氨基酸的变旋等，而有利的有酶促褐变的制止、灭菌、含氮化合物利用率提高等；而在干燥后的贮藏过程中，热风干燥对蛋白质的不良影响较大，真空、冷冻干燥技术较小，真空干燥技术效果最佳。辐射处理对于蛋白质食品的保藏影响甚小，要避免强辐射情况。 关键词：蛋白质加工贮藏理化性质 引言 在日常饮食中，我们常常会接触到富含蛋白质的食品，如蛋制品、鸡肉、猪肉、牛肉和水产品等等。而这些食品在生产到出售的过程中，都会必然会经历加工和贮藏这两个重要的过程，在很大程度上决定了最终产品的口感、风味、外观和营养价值。所以，研究蛋白质在加工和贮藏中的变化就显得尤为重要。本文综合性地研究了蛋白质在加工和贮藏中在理化层面上的变化，如热碱和低温处理、化学反应和脱水处理等等，发现这些因素都会对蛋白质性质造成一定有利或有弊的影响。 1品蛋白在加工过程中的变化 1.1热处理 1.1.1蛋白质热变性 以牛乳为例，我国国家标准将液态奶分为巴氏杀菌奶(Pasteurized milk) 和杀菌奶(Sterilized milk)。根据企业生产的实际情况，巴氏杀菌奶还包括超巴氏杀菌奶。杀菌奶的主要产品形式为超高温瞬时灭菌奶，即UHT 奶(Ultra hightemperaturesterilized milk)[1-2]。乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，还含有少量其他蛋白质，如乳脂肪球膜蛋白。 Douglas Jr 等(1981)研究了不同热加工产品的乳清蛋白中的氮含量，结果显示生鲜乳中无变性乳清蛋白检出，高温短时灭菌(HTST, high temperatureshort time)乳中含0.4%的变性乳清蛋白，UHT 乳中的含量为56%。加热会造成乳清蛋白由于变性而变得不可溶，影响人体的吸收，同时也会造成赖氨酸降解，造成必需氨基酸的损失[3-4]。进一步针对乳清蛋白中可利用赖氨酸的含量的研究表明：生鲜奶、HTST 奶及UHT 乳中赖氨酸的含量有轻微减少，但这种减少不会影响牛乳的营养价值[5-6]。 1.1.2美拉德反应 美拉德(Maillard)反应常导致蛋白质非酶褐变的发生，是由于食品在热处理中，还原性性糖与氨

04 冷冻干燥保护剂

冻干保护剂 一、冻干损伤机理： 蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。预冻过程中水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏，从而使活性损失；另外，水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化，导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。 二、冻干保护作用机理： 第一，“水替代假说”：认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，蛋白的主相变温度会升高，发生变性。但某些糖类属于亲水性物质，形成氢键能力较强，能替代蛋白表面的水的羟基，与蛋白质中的极性基团形成氢键，使得蛋白的主相变温度变化不大，低于操作温度，从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。能够直接测量到冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键。 第二，“玻璃态假说”：认为在含糖溶液的干燥过程中，糖-水混合物会玻璃化，兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶；且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。 研究表明，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行为，只是玻璃化转变温度不同而已。由于某些糖的玻璃化温度较高，在较高的保存温度下，仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态。（大于玻璃化温度就不形成玻璃态了） 一般说来，如工作温度低于保护剂的玻璃化温度，高于被保护的活性物质的主相变温度，那么该活性物质就能有效地保持活性。但在目前，这两种假说还不能完全解释现有的实验现象。 三、冻干保护剂的选择： 冻干保护剂需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。常用的保护剂有如下几类物质： 1.糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。 2.聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等； 3.无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等； 4.表面活性剂：Tween 80等； 5.氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等； 6.盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等； 具体分类： （一）按相对分子量分 1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用。如：酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸； 中性物质：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇D； 碱性物质：精氨酸、组氨酸。 2.高分子化合物高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如：白蛋白、明胶、蛋白胨、脱脂奶粉。 明胶水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为－12℃。对微生物的保护作用高出普通明胶10％以上。

蛋白质药品冷冻干燥技术研究

蛋白质药品冷冻干燥技术研究 引言 冷冻干燥就是把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体。然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得干燥制品不失原有的固体骨架结构，保持物料原有的形态,且制品复水性极好。 利用冷冻干燥目的是为了贮存潮湿的物质，通常是含有微生物组织的水溶液，或不含微生物组织的水溶液。产品在冻结之后置于一个低水气压下，这时包含冰的升华，直接由固态在不发生熔化的情况下变成汽态。与其他干燥方式相比避免了化学、物理和酶的变化，从而确保了制品物性在保存时不易改变。实际需要的低水汽压是靠真空的状况下达到的。由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品。 药品冻干损伤和保护机理 药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。 因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。它需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。 常用的保护剂有如下几类物质： a) 糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等； b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等； c) 无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等； d) 表面活性剂：Tween 80等； e) 氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等； f) 盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等； 由于冷冻干燥过程存在多种应力损伤，因此保护剂保护药品活性的机理也是不同的，可以分为低温保护和冻干保护。