一种发酵乳中双歧杆菌鉴别培养基计数评估

微生物发酵培养基的优化方法

工业发酵进展

微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。

3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法

大肠杆菌高细胞密度发酵

课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：郑帅超 学号：201106040030 专业班级：11 生物技术 指导教师：李安华 2014年5月26日

课程设计任务书 设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化 学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班11生物技术 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的帮助下完成题目设计。 2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。 3、学生在实验室完成实验方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288. [2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455. [3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275. [4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33. [5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275. [6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28. [7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25. [8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31. 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2014年5月13日 任务完成日期：2014年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：

沙门氏菌快速检测方法

沙门氏菌快速检测方法 1试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3所用试剂和培养基 1.3.1缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15min，冷至常温。 1.3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1配制BPW培养基（第一天） 2.2培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟,关灯60min 后使用。（第一天） 2.3预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4配制TTB增菌液（第一天） 2.5增菌（第二天） 2.5.1接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于9mLTTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。 2.5.2培养现象 菌名菌号生长状况 TTB培养特征 静置后浑浊CMCC(B)50071 伤寒沙门氏菌良好 静置后浑浊良好鼠伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50115 静置后清亮不生长大肠埃希氏菌 ATCC25922

(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒

(完整版)谷氨酸发酵

1）生物素营养缺陷型 ?作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与 了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏. ?控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵 初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换. 2）油酸营养缺陷型 ?作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少 到正常量的1/2左右. ?控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换. （3）添加表面活性剂 ?添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨 酸. ?机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细 胞膜. ?关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在 下进行分裂,形成产酸型细胞. （4）添加青霉素 ?机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作 用下受损,向外泄露谷氨酸. ?控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不 能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换. 谷氨酸发酵强制控制工艺 ?为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取 “强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法. ?控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料 中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。谷氨酸发酵 ? 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h. 措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短. ? 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧 下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h. 措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃ ? 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成. 措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃. ? 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低. 措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐. 发酵周期一般为30h. 二、谷氨酸发酵的生化过程

沙门氏菌的检验

沙门氏菌的检验 食品学院14食品质量与安全1班 刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君 2 2 2 2 摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。 关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定 前言 沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1仪器设备 均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃ 吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头

电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂 1.1.2试剂药品 鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡 1.1.3培养基 蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基 1.2 实验方法 1.2.1培养基的制备 1.2.1.1培养基的配制步骤 蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。分装10瓶，每瓶90ml 四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌 121 ℃，15 min灭菌冷却后至30℃，每100ml 基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml 1.2.1.2配制培养基的注意事项 （1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末； （2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量； （3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。 1.2.2 沙门氏菌群检测 1.2.2.1沙门氏菌检测程序

大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施：

第三章 发酵培养基

第三章发酵培养基 培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 作用：促进产物的形成、满足菌体的生长 发酵培养基的要求: ①培养基能够满足产物最经济的合成； ②发酵后所形成的副产物尽可能的少； ③培养基的原料应因地制宜，价格低廉，且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应； ④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。 培养基的类型及功能 一、按组成物质的纯度 合成培养基: 所用的原料其化学成分明确、稳定 ◆适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作； ◆培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产。 天然培养基: 采用天然原料，其成分不那么“纯” ◆发酵培养基普遍使用天然培养基； ◆原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适合于工业化生产； ◆由于其成分复杂，不易重复，如果对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性。 二、按状态 固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。 半固体培养基:琼脂用量为0.5%～0.8% ，主要用于微生物的鉴定。 液体培养基:发酵工业大规模使用的培养基。 三、按用途（从发酵生产应用考虑） 孢子（斜面）培养基:菌体迅速生长，产较多优质孢子，不易引起菌种变异。要求：营养不太丰富、无机盐浓度适量、合适pH和湿度。常用：麸皮培养基、小米、大米、玉米碎屑、琼脂斜面培养基。 种子培养基：孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体。要求：营养丰富完全、最后一级接近发酵培养基。 发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成产物。 发酵培养基的成分及来源 碳源 1、作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所必须的碳成分。 2、来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃

谷氨酸发酵知识完全总结

谷氨酸的性质及基本介绍 147.12926 1.538 主要用途简介： （一）食品工业：谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。 （二）日用化妆品：谷氨酸作为营养药物可用于皮肤和毛发。 N—酰基谷氨酸钠系列产品是由谷氨酸缩合而成的性能优良的阴离子表面活性剂，广泛用于化妆品、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等产品中。 焦谷氨酸钠（味精脱水生成的产物）具有极强的吸湿性，能保持皮肤湿润，防止干燥，并增强皮肤和毛发的柔软和弹力。日本己有以谷氨酸钠（或谷氨酸）为原料生产的高级人造革、化妆品和洗涤剂等产品。 （三）医药行业：谷氨酸作有较高的营养价值，医学上主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。 （四）农业：谷氨酸与某些激素配合，可制成柑桔增甜剂；还可作为微肥的载体，在氮磷钾基本满足的条件下，作为叶面喷洒的微肥具有投入少、效益高等特点。 谷氨酸钠既是西红柿保护性杀菌剂，又是防治果树腐烂病的特效杀菌剂。 氨基酸铜是目前生产上良好的杀菌剂，有机铜比无机铜的应用效果好。 特殊说明： （一）谷氨酸晶体为白色结晶或结晶性粉末，味微酸。 （二）吸湿性温度50℃，其临界湿度在90%以上。

谷氨酸生产水平与市场分析 生产水平： 谷氨酸棒状杆菌-生物素敏感型高产菌株：采用生物素亚适量工艺，发酵32h，产酸达140g/L以上，糖酸转化率达62%以上，国内同类研究的领先水平。 谷氨酸棒状杆菌-谷氨酸温度敏感型突变株：在最佳发酵条件下，发酵24h，产酸达到160g/L，糖酸转化率达72%，国际同类研究的先进水平。 市场分析： 我国味精工业的产量稳居世界第一位，2007年全国味精产量达190万吨。味精工厂的味精平均销售价格为7,800元/吨，成本为7,000元/吨。按照上述产量计算，我国味精工业中纯味精的总产值约150亿元，加上相当于上述总值30%的副产品（主要是饲料蛋白、化肥、液态肥料）的产出，我国味精工业年生产总值约为200亿元人民币。 从市场需求来看，2007年国内谷氨酸年产量约190万吨，国内人均消费味精仅1kg，与日本、香港、台湾、东南亚等国家及地区的味精消费水平（1.5kg）相比，还是较低的。味精综合开发利用的效益显著，通过提高产酸率，吨味精成本可降低500元左右，其生产成本将低于日本的味精生产成本，具备了参与国际市场的竞争力，可以抓住机遇扩大味精出口量。同时在国内可降低味精销售价格，刺激国内市场消费。

大肠杆菌培养基配制及培养方法

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大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。 2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。 五、大肠杆菌的培养

大肠杆菌培养基配制及培养方法

. 大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 o C冻存。-80 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒1 / 2 . 精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。 五、大肠杆菌的培养 1）将接种好的平皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养，大约十几小时后长出菌落。

谷氨酸发酵控制

一简述甜菜糖蜜添加吐温发酵的机理！！！ 吐温是一种表面活性剂，它是在菌体细胞不饱和脂肪酸合成的过程中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素具有拮抗作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，达到控制磷脂合成，导致磷脂合成不足。结果形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜，提高了谷氨酸向膜外漏出的渗透性。 二简述甘蔗糖蜜添加青霉素流加糖发酵的机理！！！ 添加青霉素可抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，主要抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁肽聚糖的生物合成。因为青霉素的结构与革兰氏阳性的谷氨酸菌所特有的糖肽的D-Ala-D-Ala末端结构类似，因而它取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心结合，是五肽末端的丙氨酸不能被肽酶移去，谷氨酸桥一头无法与它前面的丙氨酸相接，因此交联不能形成，网状的结构连接不起来，糖肽的合成就不能完成，于是菌体内的尿二磷和N-乙酰胞壁酸便大量的积累，青霉素与转肽酶相结合，形成了青霉素的酶，结果形成不完全的细胞壁，导致形成不完全的细胞膜。由于青霉素合成细胞壁后期生物合成，是细胞膜处于无保护的状态，又由于膜内外的渗透压差，进而导致细胞膜的物理损伤，形成不完全的细胞膜，失去渗透障碍物，增大了谷氨酸向胞外分泌的渗透能力。 三简述温度敏感突变株发酵生产谷氨酸的机理！！！ 谷氨酸温度敏感突变株的突变位置是在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上，发生碱基的转换或者颠换，一个碱基被另一

个碱基所置换，这样为该基因所指导的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变，当控制培养温度为最适温度时，菌体正常的生长，当温度提高到一定的程度时，菌体便停止生长且大量的产酸。而它仅需通过控制物理的方式就可以完成谷氨酸生产菌由生长型细胞向产酸型细胞的转变。 四简述谷氨酸发酵培养基对发酵的影响及控制措施！！！ 影响因素及控制措施如下： 1.生物素 谷氨酸在发酵的过程中，前期：菌体的生殖期，一定量的生物素是菌体增殖期所必须的一般在5ug/L，而在产物合成期，要控制生物素的浓度,一般在0.5ug/g，以保证产物的正常合成。 2. 碳源 谷氨酸产生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等；有些菌种能利用醋酸、乙醇、正烷烃等作碳源。淀粉水解糖的质量对发酵影响很大。一般还原性的糖的浓度控制在125—150g/L。 3 碳氮比 碳氮比对谷氨酸发酵影响很大，在发酵的不同阶段，控制碳氮比以促进以生长阶段向产酸阶段转化，在长菌阶段，如氨根离子过量会抑制菌体生长，在产酸阶段，如氨根离子不足，a-酮戊二酸不能还原并氨基化，而积累a-酮戊二酸，谷氨酸生成量少。 一般发酵工业碳氮比为100：(0.2～2.0)，谷氨酸的碳氮比为100：(15～30)，当碳氮比在100：11以上才开始累积谷氨酸。

沙门氏菌显色培养基

培养基名称：沙门氏菌显色培养基 英文名称：Chromogenic Salmonella Agar 沙门氏菌显色培养基用途：用于沙门氏菌的快速分离和鉴定。 沙门氏菌显色培养基使用原理： 蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;胆盐抑制革兰氏阳性菌;选择性添加剂增强培养基的抑制杂菌的能力;混合色素分别与沙门氏菌和大肠菌群所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上沙门氏菌产生品红色的菌落，大肠菌群产生蓝绿色的菌落。 沙门氏菌显色培养基配方(每升)： 蛋白胨19.6g 酵母膏粉3g 氯化钠5g 胆盐 1.5g 琼脂12g 混合色素 6.4g 最终pH7.0±0.2 沙门氏菌显色培养基使用方法： 1、称取沙门氏菌显色培养基47.5g，混合均匀加热至100℃，并按常规不断搅拌直至完全溶解(不能持续高温加热，建议不要重复煮溶)，不需高压灭菌，冷至50℃，加入10支沙门氏菌选择性添加剂(冻干粉每支需先用1ml无菌水溶解)，混匀，倾注灭菌平皿。 2、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液与增菌液。 3、建议使用二步增菌法： (1)前增菌：将处理过的样品25g置于225mL缓冲蛋白胨水中，混合均匀后37℃培养6～8h; (2)选择性增菌：取前增菌液1mL加入到9mL四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)中，混合均匀后37℃培养18～24h;

4、用接种环取增菌液一环，划线接种于沙门氏菌显色平板上，置于36±1℃培养18-24小时。 5、观察结果。挑取显色平板上呈品红色，扁平透明，边缘光滑，直径约2mm的可疑菌落进行进一步的试验。 6、可使用MicrogenTMGN-ID或API20E或生化管试验，对疑似沙门氏菌菌落进行生化鉴定。 质量控制： 沙门氏菌显色培养基倾注平皿后呈淡黄色，下列菌株接种后于36±1℃培养18—24h生长情况如下表。 菌名菌号生长状况培养特征 鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115良好菌落品红色 大肠埃希氏菌ATCC25922良好菌落蓝绿色 奇异变形杆菌CMCC(B)49005良好菌落无色 粪肠球菌ATCC29212受抑制----- 贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期二年。 规格：可配置1L的培养基干粉。

生物素对谷氨酸发酵的影响及控制

生物素对谷氨酸发酵的影响及控制摘要： 阐述生物素对谷氨酸在发酵过程中的影响和控制生物素的用量来提高谷氨酸的产量，以及生物素测定方法的介绍。 关键词：生物素谷氨酸影响测定方法发酵 1生物素对谷氨酸生产的影响 1.1谷氨酸的生物合成途径 谷氨酸生物合成的主要途径：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和磷酸戊糖途径（HMP途径）生成丙酮酸，再被氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及NH4+的存在条件下，经还原氨基化反应生成谷氨酸。 1.2 生物素对谷氨酸生物合成途径的影响 生物素对谷氨酸生物合成途径有下列几方面的影响[1]： （1）生物素对糖酵解速度的影响 生物素在糖酵解过程中，主要影响糖酵解速度，而不是EMP途径与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，糖降解速度远远超过丙酮酸的氧化速度，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸，引起了乳酸的溢出。只有在生物素限量的情况下，糖降解速度与丙酮酸氧化速度才趋于平衡。 （2）生物素对NAD及NADH2含量的影响 在生物素缺乏菌中，葡萄糖氧化能力降低，特别是醋酸、琥珀酸的氧化能力显著减弱。在生物素缺乏菌中，NAD及NADH2含量减少到l/2-1/4。 （3）生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，该酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，在生物素亚适量条件下，异柠檬酸裂解酶几乎没有活性。原因在于丙酮酸氧化能力下降，醋酸生成速度减慢，为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶很少。再者，由于该酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶活性，并阻遏该酶的生成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向沿异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动。 （4）生物素对氮代谢的影响 生物素限量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时由于完全氧化降低的结果，使ATP的形成减少，蛋白质合成活动停滞。在铵离子适量条件下，生成积累谷氨酸，且生成的谷氨酸也不会通过转氨作用生成其他氨基酸。在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶、琥珀酸氧化力、丙酮酸氧化力、蛋白质合成、乙醛酸循环比例、草酰乙酸和苹果酸脱羧反应都不断加大，导致谷氨酸量减少，通过转氨作用生

第三章 工业发酵培养基

第三章工业发酵培养基 一、填空题 1．工业培养基按用途分可分为 、 和 三种类型。 2. 培养中速效碳是指，速效氮是指。 3.工业发酵培养基的成分有碳源、氮源、水以及，， 。 4. 碳源物对微生物的功能是 __和_ __，微生物可用的碳 源物质主要有___ _、___ _、__ _、__ _、__ __等。 5. 微生物利用的氮源物质主要有_ _、_ _、_ __、_ __、__ _等。 6. 生长因子主要包括 、 和 。 7. 在微生物研究和生长实践中，选用和设计培养基的最基本要求是 __ _、_ _、_ _、_ _和 _ _。 2、名词解释 1.前体 2.促进剂 3.碳氮比 4.孢子培养基 5.玉米浆 6.发酵培养基 三、判断题 1. 培养基灭菌前加豆油，主要是预防泡沫的产生和提供氮源。 2. 青霉素发酵培养基中添加苯乙酸目的是促进产量的增加。 3. 前体是构成细胞结构的小分子物质。 4. 营养成分碳源是细胞组成成分和各种产物的构成元素，不能作为生物 能量代谢的必需元素。 5. 柠檬酸可调节培养基的ｐＨ，但不能作为碳源被菌利用。 6. 在味精生产时培养基中添加青霉素是为了抑制杂菌。 7. 在固体培养基中，琼脂的浓度一般为0.5—1.0%． 8. 培养基中加入一定量的NaCl，其作用是调节渗透压。 四、选择题 ⒈大肠杆菌液体培养时，它首先利用的碳源是（ ）。

A 淀粉 B 乳糖 C 葡萄糖 D 玉米粉 ⒉ 适合细菌生长的C/N比一般为（ ） A　5：1 B　25：1 C　40：1 D　80：1 ⒊实验室常用的培养细菌的培养基是（ ） A　牛肉膏蛋白胨培养基 B　马铃薯培养基　 C　高氏一号培养基 D　麦芽汁培养基 ⒋下列物质属于生长因子的是（ ） A．葡萄糖 B．蛋白胨 C．NaCl D．生物素 ⒌食品工业微生物发酵一般要求培养基原料( ) A.价格高质量好 B.营养好价格高 C. 价廉易得 D.纯度高 6 无机氮是速效氮，因为其（） A．微生物对其吸收快 B．是无机物 C. 纯度高 D.价廉易得 7 下列哪些是生理碱性物质（） A．硝酸钠 B．氯化钠 C．氢氧化钠 D．氯化铵 8 平板划线分离法需要下面所有的物品，除了( )之外。 A 接种环 B 琼脂培养基平板 C 细菌的培养物 D 电泳仪 五、问答题 1. 选择和配制发酵培养基应遵循哪些基本原则？ ①必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成份； ②所用的单位营养物质能产生最大量的微生物体或发酵产物； ③能形成最大浓度的微生物体或产物； ④能形成最大产物生成率，从而缩短发酵周期； ⑤尽量减少副产物的形成，便于产物的他离纯化； ⑥对生产中除发酵以外的其他方面如通气、搅拌、精制、废弃物的处理等所带来的困难最少；

亚适量法L-谷氨酸发酵培养基的优化

亚适量法Ｌ-谷氨酸发酵培养基的优化白长胜*，韩隽，王刚，姬慧军，张敬蛟 （中粮生化能源（龙江）有限公司，黑龙江齐齐哈尔　１６１１００） 摘要：采用单因素和正交试验对亚适量谷氨酸发酵培养基进行了研究。最佳培养基组成为葡萄糖１５０ｇ／Ｌ，玉米浆５．０ｇ／Ｌ，磷酸氢二钠２．７ｇ／Ｌ，氯化钾１．８ｇ／Ｌ，硫酸镁１．２ｇ／Ｌ。与初始发酵培养基相比，Ｌ-谷氨酸产量从１２０．３ｇ／Ｌ提高到１３５．６ｇ／Ｌ，糖酸转化率从５８．６％提高到６０．８％，显著提高了发酵水平，降低了综合成本。关键词：谷氨酸；发酵；优化；正交试验 中图分类号：ＴＳ２０１．５ 文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ． ｉｓｓｎ．１０００-９９７３．２０１６．０８．０１９文章编号：１０００-９９７３（２０１６）０８-００８７-０４ ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍｆｏｒＬ-ｇＩｕｔａｍｉｃ ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＳｕｂｏｐｔｉｍａＩＤｏｓｅ ＢＡＩＣｈａｎｇ-ｓｈｅｎｇ*，ＨＡＮＪｕａｎ，ＷＡＮＧＧａｎｇ，ＪＩＨｕｉ-ｊｕｎ，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ-ｊｉａｏ（ＣＯＦＣＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｅｒｇｙ（Ｌｏｎｇｊｉａｎｇ）Ｃｏ． ，Ｌｔｄ．，Ｑｉｑｉｈａｒ１６１１００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｏｆＬ-ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｓｕｂｏｐｔｉｍａｌｄｏｓｅｉｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｍｅｄｉｕｍｉｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｇｌｕｃｏｓｅｏｆ１５０ｇ ／Ｌ，ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒｏｆ５．０ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏｏｆ２．７ｇ／Ｌ，ＫＣｌｏｆ１．８ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏｏｆ１．２ｇ／Ｌ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｗｉｔｈｔｈｅｐｒｉｍｉｔｉｖｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆＬ-ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｆｒｏｍ１２０．３ｇ／Ｌｔｏ１３５．６ｇ／Ｌａｎｄｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｔｏｇｌｕｃｏｓｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｆｒｏｍ５８．６％ｔｏ６０．８％，ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＬ-ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄ，ａｎｄｔｈｅｏｖｅｒａｌｌｃｏｓｔｉｓｒｅｄｕｃｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌ-ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一， 在代谢上具有十分重要的意义［１］ 。谷氨酸具有多种生理功能［２］，应用广泛。谷氨酸主要用于生产味精、鸡精 等调味品，同时也被大量应用于医药、农业、日化等行 业以及作为其他发酵行业的营养底物［３，４］ 。 谷氨酸发酵作为典型的代谢控制发酵［５］ ，是工业微生物发酵工艺与过程控制的典型代表［６］ 。在发酵工 业中，发酵工艺条件的优化在微生物发酵产业化生产中举足轻重，是从实验室研究到工业化生产的必要环 节。环境的变化对微生物的生命活动有一定程度的影响， 因此获得与生产菌种相匹配的最佳发酵工艺条件将有利于挖掘菌株的发酵潜力，最大程度地发挥菌株的优势。 谷氨酸及味精生产作为一个成熟的发酵行业，利润微薄， 生产水平的高低直接关系着企业的生死存亡［７］ 。生产企业必须从制造环节本身考虑，尽可能谋 求综合成本的最低化，才有可能在激烈的市场竞争中站稳脚跟。发酵水平的高低是决定产品成本的主要因 收稿日期：２０１６－０２－１０ *通讯作者 作者简介：白长胜（１９８５－） ，男，工程师，硕士，研究方向：生化产品的制备与分离。— ７８—第４１卷第８期２０１６年８月 中国调味品 China Condiment 基础研究

大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养 、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40即油，-80°C冻存。 、培养基制备 LB 培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton ）：10 g/L ；酵母提取物（Yeast Extract ）：5 g/L ；NaCl：10 g/L ；pH 7.4 ） 液体培养基 胰化蛋白胨10.0g 酵母粉5.0g 氯化钠10.0g 水1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH M pH至7.4左右，定容至1L,调pH 7.4 （若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）） 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%勺琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC 灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。 液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min 以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL （直径90mr）在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min 左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min,使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21 冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。 2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应