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western-blot 通用配方

1.Western Blotting 相关溶液及抗体

1)转膜缓冲液(running buffer)(10×)(1L)

Tris 30.3g

甘氨酸144g

不调pH

转膜工作液(1×)(1L)(现配现用)

(10×)转膜缓冲液(running buffer)100ml

无水乙醇100ml

水800ml

2)TBS 缓冲液(5×)(1L)

Tris-HCl 12.15g

NaCl 146.4g

用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4(约5ml浓盐酸,pH试纸检测即可)

TBST:TBS+Tween-20 0.1%(1ml for 1L)

3) 封闭液

TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)

4)Western Blotting 第一抗体

适合于自己蛋白的抗体

5)Western Blotting 第二抗体

辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)

4.实验步骤

(1)SDS-PAGE 电泳分离蛋白质:(浓缩胶70V,30-40min;分离胶120V,1h)

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5×loading buffer: 4ml

ddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml

甘油1ml 10%(w/v)SDS 0.8ml

?-巯基乙醇0.2ml

(2)将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形

(3)配(1×)转膜工作液

(10×)转膜缓冲液(running buffer)80ml

无水乙醇80ml

水640ml

800ml

(4)将胶泡在(1×)转膜工作液中(防止胶干掉,最好不要用水,水泡胶会涨)

(5)用尺子量胶大小,裁PDVF膜(不要用手蹭膜,手上有蛋白)

(6)PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到(1×)转膜工作液中。(PDVF膜为疏水性的,先在乙醇中泡会使其亲水性好)

(7)将海绵和滤纸在水中浸湿,然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干):白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜(靠正极)--胶(靠负极)(用小试管排气泡)--两层滤纸—海绵(用小试管排气泡)--夹住—放入胶槽中(白板靠红,黑板靠黑,保证电极方向不要错)--在胶槽中加入转子—倒入(1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V~100V 恒压,60min(该条件可以转移25kD~90kD的蛋白)

(8)封闭:在封闭液中室温,摇1h或者4℃静置过夜。

(9)漂洗:将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次,每次10 分钟;

(10)一抗:适量的一抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1% Gelatine)

室温摇1h.

(11) 漂洗:将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次,每次10 分钟

(12) 二抗:适量的二抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1% Gelatine)

室温摇1h.

(13)漂洗:将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次,每次10 分钟

两种显带方式:

曝光法

(14)用纸将PVDF 膜上的水分吸干,然后将将PVDF 膜放在保鲜膜上,将ECL试剂盒中的A液和B液按照1:1的比例混匀(见说明书)后均匀覆盖到PVDF 膜上1min,然后用纸将PVDF 膜上的溶液吸干,放入X光片的暗盒中。

(15)在暗室中,使用红光灯,将显影液,水,定影液分别倒入三个盘子中,然后取出X光片剪成合适大小,放入含有PVDF 膜的暗盒中,曝光一定时间后取出X光片,放入显影液中显影,检测显影的情况,当发现X光片中有条带时,放入水中清洗光片,然后在定影液

中定影。然后在黑暗情况下将光片和显影液定影液收好。显影液和定影液应为无色透明,若发现颜色异常、有沉淀或长菌需重配。

膜上显色法:

(14)增强型HRP-DAB底物显色试剂盒;包括1×HRP缓冲液,试剂A,试剂B和试剂C,三者添加的体积比为1ml 1×HRP缓冲液+50μl试剂A+50μl试剂B+50μl试剂C。显色剂体积依照个人的需要配置。

将PDVF膜置于显色剂中,暗处静置8-10min,接着用水冲洗以终止反应,然后将纸吸干PDVF膜上残余的水,扫描仪扫图即可。

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