EMA残留溶剂指南附录.pdf

Annexes to:

CPMP/ICH/283/95 Impurities: Guideline for residual solvents

&

CVMP/VICH/502/99 Guideline on impurities: residual Solvents

EMA关于残留溶剂指南CPMP/ICH/283/95 杂质-残留溶剂指南和CVMP/VICH/502/99 杂质指南-残留溶剂的附录

Annex I: specifications for class 1 and class 2 residual solvents in active Substances

附录I：API中I类和II类残留溶剂质量标准

Annex II: residues of solvents used in the manufacture of finished products

附录II：制剂生产中使用溶剂的残留

Discussion at Quality Working Party 质量工作组讨论会议January 2003 to June 2004 2003.01~2004.06

Adoption by CVMP CVMP 采纳July 2004 2004.07

Adoption by CHMP CHMP 采纳July 2004 2004.07

Date for coming into operation 生效时间January 2005 2005.01

Rev. 01 Adoption by Quality Working Party 质量工作组采纳的01版本22 November 2012

2012.11.22

Rev. 01 Adoption by CVMP CVMP采纳的01版本7 February 2013 2013.02.07

Rev. 01 Adoption by CHMP CHMP采纳的01版本11 February 2013 2013.02.11

Rev. 01 Date for coming into operation 01版本生效1 March 2013 2013.03.01

Introduction

前言

The two (V)ICH residual solvents guidelines, ICH Q3C Impurities: Guideline for residual solvents (CPMP/ICH/283/95) and VICH GL18 Guideline on impurities: residual solvents in new veterinary medicinal products, active substances and excipients (CVMP/VICH/502/99), have been in operation for several years, since March 1998 and June 2001 respectively.

虽然ICH颁布的ICH Q3C 杂质: 残留溶剂指导原则 (CPMP/ICH/283/95) 和VICH GL18 杂质指导原则：兽用药、API和辅料(CVMP/VICH/502/99)中的残留溶剂这两个关于残留溶剂的指南分别从1998.03和2001.06就开始被采纳应用。

However, it has become evident that further clarification was required regarding the specifications for Class 1 and class 2 residual solvents in active substances.

但是从应用的实际情况来看，EMA觉得需要对API中I类和II类残留溶剂质量标准的问题进行澄清。

A clear interpretation of the issues regarding residues of solvents used in the manufacture of finished medicinal products, both human and veterinary, was also required.

EMA同时也认为需要对人用药和兽用药生产中的溶剂残留问题进行清楚的解释和说明。

Annex I: Specifications for class 1 and class 2 residual solvents in active substances

附录I：API中I类和II类残留溶剂质量标准

Specifications for class 1 solvents

I类溶剂质量标准

In both the ICH and VICH guidelines on impurities: residual solvents it is stated that “solvents in class 1 should not be employed in the manufacture of drug/active substances, excipients, and drug/veterinary medicinal products because of their unacceptable toxicity or their deleterious environmental effect. However, if their use is unavoidable in order to produce a drug/veterinary medicinal product with a significant therapeutic advance, then their levels should be restricted as shown…….., unless otherwise justified”.

因为I类溶剂的巨大的毒性或者对环境的危害性的原因，因此在ICH和VICH关于杂质-残留溶剂的指南中已经明确说明了

在制剂/API、药用辅料和人用药/兽用药生产中不应该使用I类溶剂；但如果在生产一种具有显著疗效的人用药/兽用药时而

不得不使用到I类溶剂的时候，那么除非有其他的解释，否则就应该将相应的I 类溶剂残留水平控制在指南中规定的限度……。

The justification for using a class 1 solvent as a solvent in a manufacturing process may be based on the current scientific and technical knowledge and the step in which this solvent is involved. For example, use of that class 1 solvent is unavoidable for the specific chemical reaction, or the desired purity profile can only be obtained by using that class 1 solvent. If a class 1 solvent is involved in a very early step of the manufacturing process and if the absence of this solvent is shown in a suitable intermediate, such an approach may be acceptable (for example, friedel crafts chemical reaction).

（生产商）可以根据现阶段的科学技术以及I类溶剂在实际生产中使用的步骤来对工艺中采用I类溶剂的情况进行解释和说明。比如说某个化学反应必须要使用1类溶剂，或使用I类溶剂来获得所需的纯度。如果只是在生产中较早的工艺步骤中使用到I类溶剂，而且这个溶剂可以在某个中间体之前被除尽的话，在这种情况下在工艺中使用I类溶剂是可以接受的（例如傅-克反应）。

The maximum acceptable limit, in a suitable intermediate or in the final active substance, for a class 1solvent, whether it is used as a solvent, a starting material, is present as a by-product, or it is present in a solvent, should comply with the limits prescribed in the relevant aforementioned ICH/VICH guideline on impurities: residual solvents, unless otherwise justified (for example, by the benefit-risk ratio).

除非有其他特别的合理解释（比如说效益风险比的考虑），否则不论是作为溶剂、起始原料、反应副产物还是其他溶剂携带的I类溶剂在中间体还是API中控制的限度都必须符合前面提到的ICH/VICH指南中对于残留溶剂规定的限度。

In all cases, the content of class 1 solvents in the final active substance should comply with the requirements of the relevant aforementioned Guideline, if tested.

任何存在I类溶剂测试的情况下API中I类溶剂的残留量都必须符合前面提到的指南中相应的要求。

A class 1 solvents used as starting materials

作为起始物料使用的I类溶剂

Certain class 1 solvents, such as benzene and 1,2-dichloroethane, can be used as starting materials.

Indeed, the use of benzene as a starting material is unavoidable when benzene is a structural part of the active substance.

某些特定的I类溶剂，如苯和1,2-二氯乙烷是可能被用作起始物料的。实际上如

果苯环是API化学结构的一部分的话，那么在合成该API时，苯肯定是作为起始物料使用的。

Benzene, as a starting material, is commonly used in the very early steps of syntheses, well before the key starting material obtained. It is the reason why, in most cases benzene is not mentioned in the description of the manufacturing process. Therefore a manufacturer describing a synthesis starting from benzene should not be asked to eliminate it when another manufacturer could refer to a synthetic route starting from a later process step (where no questions related to the use of this class 1 solvent would be raised).

通常情况下当苯被当做起始物料使用的话，一般都是用在关键起始物料形成之前非常靠前的合成步骤中。这是为什么在大多情况下苯的使用都不会在生产工艺体现的原因。因此如果一个生产商A采用一个从苯开始进行合成的工艺会被另一个生产商B从该工艺后面步骤进行引用的话，那么对于生产商A来说，它不需要在生产中完全去除苯的残留。（此时I类溶剂的使用是不会被质疑的）。

When class 1 solvents are used as starting materials they should be routinely controlled, either in a suitable intermediate or in the final active substance.

如果I类溶剂是被作为起始物料使用的话，那么必须在中间体或者API中对其进行常规控制。

B class 1 solvents present as an impurity

作为杂质出现的I类溶剂

Benzene in an active substance can be a by-product from a chemical reaction (for example, Grignard reaction, when phenylmagnesium halide used in excess is hydrolysed to yield benzene), or may arise from another solvent, for example, toluene or acetone where benzene is a known process impurity.

原料药中的苯可能会是化学反应的副产物（例如，格氏反应中过量的卤化苯镁会水解生成苯）；也可能由另一种溶剂携带，比如说苯是甲苯和丙酮合成过程中的工艺杂质。

Where a class 1 solvent might be present in another solvent (e.g. toluene or acetone containing benzene), a routine test for this class 1 solvent, on a suitable intermediate or on the final active substance, is not required when:

当某个I类溶剂作为潜在杂质存在于另一溶剂中（例如甲苯或丙酮含有的苯）时，如果满足以下要求，那么对于中间体

或者API中该I类溶剂残留是可以不必进行日常检测的：

The limit applied to the originator solvent is such that the class 1 solvent will be present in the active substance at levels below the limits set out in the guideline,

taking into account the maximum likely level of contamination of the class 1solvent. The volatility of both solvents in the drying processes must be taken into account when applying this argument;

在考虑了该源溶剂中I类溶剂存在最大可能污染的情况下，通过在API中控制源溶剂的方式就可以使得I类溶剂的在API中的含量低于指南中的限度的时候；不过在运用这一条论据的时候必须结合到这两种溶剂在烘干工艺中的挥发性。

It is demonstrated with a validated method that the class 1 solvent is not more than 30 % of the specified limit, in a suitable intermediate or in the final active substance. Supporting data should be presented on 6 consecutive pilot scale batches or 3consecutive industrial scale batches;

如果当采用一个经过验证的分析方法对6个连续的中试批次或者3个连续的商业批次的某个中间体或API进行I类溶剂残留量检测的结果都不大于指南中规定限度的30%的话。

The specification for the originator solvent used includes a routinely performed test and limit for the class 1 solvent.

当在含有I类溶剂的源溶剂质量标准中已经对该I类溶剂设定了限度并进行了日常检测的时候。

Specifications for class 2 solvents

2类溶剂质量标准

When class 2 solvents are used as starting materials or solvents, they should be normally routinely controlled either in a suitable intermediate or in the final active substance depending on the step(s) of the syntheses in which they are used.

当工艺中用到了II类溶剂的时候，那么必须根据其在工艺中具体使用到的步骤在适当的中间体或者是API中对其进行常规控制。

The limit set for class 2 solvents in the final active substance should comply with the requirements of the relevant aforementioned ICH/VICH guideline on impurities: residual solvents.

API中对II类溶剂的设定限度必须符合前面提到的相关ICH/VICH杂质指南中对残留溶剂的要求。

A class 2 solvents used in the last step of the synthesis

最后合成步骤使用的2类溶剂

In all cases where a class 2 solvent is used in the last step of a synthesis it should be routinely controlled in the final active substance.

在任何情况下，如果在合成最后步骤使用了2类溶剂，那么必须在API中对该

II类溶剂进行常规控制。

B class 2 solvents used prior to the last step of the synthesis

最后合成步骤之前使用的II类溶剂

Class 2 solvents used prior to the last step in the synthesis have not to be included in the drug substance specification if it has been demonstrated, on a suitable intermediate or on the final active substance, that the content of class 2 solvents is not more than 10 % of the acceptable concentration limit (e.g., acetonitrile 41 ppm) stated in the relevant aforementioned ICH/VICH guideline on impurities: residual solvents. If tested, the content of class 2 solvents in the final active substance should of course meet the requirements of the relevant aforementioned guideline.

如果能够证明在合成最后步骤之前使用的II类溶剂在某个中间体或者API中实际残留量不大于指南中对该II类溶剂规定限量的10%（比如说乙腈不大于41ppm）的话，那么可以在API中不对其进行控制。如果在API中对II类溶剂进行检测的话，则其残留量必须符合前面所提到的相关指南要求。

To support the absence of a routine test for class 2 solvents in the final active substance or in the suitable intermediate, results of the content of class 2 solvents should be presented from 6 consecutive pilot scale batches or 3 consecutive industrial scale batches of the suitable intermediate or the final active substance.

如果想在API或中间体中不对II类溶剂进行常规检测的话，那么必须提交6个连续的中试批次或3个连续的商业批次的中间体或者API中II类溶剂的实际残留量数据。

Changes to manufacturing processes

生产工艺变更

When changes are proposed to a manufacturing process in which it has been demonstrated initially that a class 1 or class 2 solvent is below the defined threshold for routine testing, the manufacturer should consider the impact of manufacturing process changes on solvent levels and revalidate as necessary.

在生产商拟对生产工艺进行变更时应考虑生产工艺的变更对那些已经被证明了不需要进行常规检测的I类或II类溶剂残留水平的影响以及对工艺进行再验证的必要性（如有必要则需要对工艺进行再验证）。

Annex II: residues of solvents used in the manufacture of finished products

附录II：制剂生产中使用的溶剂残留

Justification for the use of organic solvents in the manufacture of finished products

制剂生产中使用有机溶剂的论证

Organic solvents can be used in the manufacture of medicinal products for different reasons.

在药品生产的过程中会因为各种原因而使用到有机溶剂。

For example:

比如说：

●as a granulation solvent for the manufacture of tablets;

在片剂生产中作为制粒溶剂

●as part of a tablet coating solution;

作为片剂包衣液的成分

●as a solvent for adhesives used in manufacture of transdermal patches;

作为透皮贴剂生产中的胶粘剂使用

●as a solvent for polymers used in manufacture of implants.

在移值体生产中作为聚合物使用

The justification and choice of solvents used in the manufacture of finished products should be included within the pharmaceutical development documentation. For example, ethanol can be proposed as a solvent for the granulation and/or for the coating solution if the drug substance is demonstrated to be very sensitive to moisture. Organic solvents seem to be unavoidable when certain polymers have to be introduced into the product manufacture. The use of a class 1 solvent in the manufacture of the finished product is not considered acceptable.

在制剂生产中对溶剂的使用的选择和论证必须写进研发文件中。比如说如果制剂的API对水分比较敏感，那么就可以用乙醇作为制粒和/或包衣液的溶剂；即使为了在制剂生产中引入特定的聚合物而必须使用有机溶剂的话，那么也不能使用I类溶剂。

Specifications for finished products when organic solvents have been used

in their manufacture

针对在生产中使用了有机溶剂的制剂质量标准的制订

A test for organic residues of solvents that are used in the manufacture of finished products should be included in the product specifications. Process validation results are not considered to adequately justify the omission of such a test from the specifications, but they can be used to justify skip testing.

制剂的质量标准中必须包含有对制剂生产工艺中使用到的有机溶剂残留量的检测。不能仅通过工艺验证的结果来作为在质量标准中省略残留溶剂检测的唯一依据，而仅能将其作为支持省略该检测的证据之一。

If class 3 solvents only are used, routine testing by loss on drying with a < 0.5% acceptance limit is acceptable when this test is appropriately validated for determination of the relevant solvent(s). Where residues of class 3 solvents cannot be reduced to this level and/or where class 2 solvents are used in the production, specific (chromatographic) techniques should be used.

如果只使用了III类溶剂而且可以通过干燥失重对其控制的话，那么可以通过将干燥失重限度设定为小于0.5%的方式来来控制III类溶剂的残留。如果III类溶剂不能降低至该水平（＜0.5%）或着在生产中使用了II类溶剂的话，那么必须通过特定（色谱）方法溶剂的残留进行控制。

《南京农业大学学报》-论文撰写要求

论文撰写要求 1．题名 准确、精炼、清晰，充分反映论文的基本内涵与特色。中英文题名内容应一致，英文题名通常以名词短语为主要形式，整个题名只有第1个词的首字母大写，其余均小（专有名词除外）；禁止使用非公知公用的符号、缩写词、外来语、代号和商品名。 2．作者姓名及单位 中英文作者姓名顺序应一致，通信作者请用“*”标识，作者英文名为汉语拼音，姓在前，名在后，姓全大写，双名只首字母大写，如，WANG Dawei。作者单位请准确写出全称，不能简写。 3．摘要 中文摘要：摘要是对正文主要内容高度浓缩的简短论文，与论文具有同等的信息量，包含“研究目的、方法、结果、结论”4个要素。句首不要简单重复文章题名中的信息。目的、方法、结论要简炼，结果的内容要具体。方法部分须有试验材料和主要设计；结果部分应突出原创性工作，着重反映出文章的创新、独到之处，只叙述新信息和发现及主要数据。缩写或代号首次出现必须加以说明。摘要不宜太短，500字左右。 英文摘要：所有论文都必须有500词左右的英文摘要，包含“研究目的、方法、结果、结论”4个要素，与中文摘要对应，结果部分可以详细些。研究目的用一、两句话概括，写出论文的主要研究目的；方法、结果的内容尽可能详细，即解决问题的主要方法、过程（包括试验材料、试验设计、测定方法等），研究结果部分重点描述研究中的创新内容，尽量包括论文中的主要论点和重要的论证和数据；结论应明确。 中英文摘要的数据必须与正文的数据一致。 摘要模板： 摘要：[目的] ×××××××××××××。[方法] ×××××××××××××。 [结果] ×××××××××××××。[结论] ××××××××××× ××。 Abstract：[Objectives]×××××××××××××.[Methods]×××××××××××××.[Results]×××××××××××××.[Conclusions]××××× ××××××××. 4．关键词 尽量选用主题词，如果自由选词，选词的关键在于要精选能代表文章主要内容的词或词组；每篇论文可列出3～8个关键词；中英文关键词既要意思一致又要顺序一致。 5．中图分类号 从《中国图书馆分类法》（第四版）中查找，自查。 6．引言 内容包括研究意义、研究背景、提出问题即本研究与已有研究的不同之处及研究目的。

化学药物残留溶剂研究的技术指导原则

指导原则编号： 【H】G P H7-1化学药物残留溶剂研究的技术指导原则 二OO五年三月

目 录 一、概述 (1) 二、基本内容 (2) (一)残留溶剂研究的基本原则 (2) 1、确定残留溶剂的研究对象 (2) 2、确定残留溶剂时需要考虑的问题 (2) 3、残留溶剂分类及研究原则 (4) (二)研究方法的建立及方法学验证 (6) 1、研究方法的建立 (6) 2、方法学验证 (8) (三)研究结果的分析及质量标准的制定 (9) 1、残留溶剂表示方法 (9) 2、质量标准制定的一般原则及阶段性要求 (10) (四)需要关注的几个问题 (12) 1、附录中无限度规定和未收载的有机溶剂 (12) 2、未知有机挥发物 (12) 3、多种有机溶剂综合影响 (13) 4、中间体的残留溶剂 (13) 5、制剂工艺对制剂残留溶剂的影响 (14) 6、辅料残留溶剂的研究及对制剂的影响 (14) 三、参考文献 (14) 四、附录 (16) 五、著者 (17)

化学药物残留溶剂研究的技术指导原则 一、概述 药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中、以及在制剂制备过程中使用或产生而又未能完全去除的有机溶剂。根据国际化学品安全性纲要，以及美国环境保护机构、世界卫生组织等公布的研究结果，很多有机溶剂对环境、人体都有一定的危害，因此，为保障药物的质量和用药安全，以及保护环境，需要对残留溶剂进行研究和控制。 本指导原则是在参考人用药物注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）颁布的残留溶剂研究指导原则,美国药典（the United States Pharmacopoeia，USP）、英国药典(British Pharmacopoeia, BP)、欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)、中国药典(Chinese Pharmacopoeia, ChP)相关内容的基础上，结合我国药物研发的特点，通过分析、研究残留溶剂问题与药物的安全性、有效性及质量可控性之间的内在关系而制定的。本指导原则总结了对残留溶剂问题的一般认识，旨在帮助药物研发者科学合理的进行残留溶剂方面的研究，也为药物评价者提供参考。 考虑到残留溶剂研究涉及的范围比较广泛，本指导原则主要对原料药的残留溶剂问题进行讨论，并以此为基础，探讨和总结药物研究过程中对残留溶剂问题的一般性原则。药物研发者可参考本指导原则对制剂和辅料的残留溶剂问题进行研究。

变形梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢。由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用的分子标记方法。 DGGE最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。这一技术能够提供群落中优势种类信息，并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化。而且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析，鉴定群落组成。DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度，可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。 DGGE的基本原理及方法： DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中

Q3C：杂质残留溶剂的指导原则

杂质： 残留溶剂的指导原则 页脚内容1

1．介绍 本指导原则旨在介绍药物中残留溶剂在保证人体安全条件下的可接受量，指导原则建议使用低毒的溶剂，提出了一些残留溶剂毒理学上的可接受水平。 药物中的残留溶剂在此定义为在原料药或赋形剂的生产中，以及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物，它们在工艺中不能完全除尽。在合成原料药中选择适当的溶剂可提高产量或决定药物的性质，如结晶型。纯度和溶解度。因此．有时溶剂是合成中非常关键的因素。本指导原则所指的溶剂不是谨慎地用作赋形剂的溶剂，也不是溶剂化物，然而在这些制剂中的溶剂含量也应进行测定，并作出合理的判断。 出于残留溶剂没有疗效，故所有残留溶剂均应尽可能．去，以符合产品规范、GMP或其他基本的质量要求。制剂所含残留溶剂的水平不能高于安全值，已知一些溶剂可导致不接受的毒性（第一类，表1），除非被证明特别合理，在原药、赋形剂及制剂生产中应避免使用。一些溶剂毒性不太大（第二类，表2）应限制使用，以防止病人潜在的不良反应。使用低毒溶剂（第三类，表3）较为理想。附录1中列出了指导原则中的全部溶剂。 表中所列溶剂并非详尽无遗，其他可能使用的溶剂有待日后补充列人。第一、二类溶剂的建议限度或溶剂的分类会随着。新的安全性资料的获得而调整。含有新溶剂的新药制剂、其上市申请的安全性资料应符合本指导原则或原料药指导原则（Q3A新原料药中的杂质）或新药制剂（Q3B新药制剂中的杂质）中所述的杂质控制原则，或者符合上述三者。 2. 指导原则的范围 指导原则范围包括原料药、赋形剂或制剂中所含残留溶剂．因此，当生产或纯化过程中会出现这些溶剂时。应进行残留溶剂的检验。也只有在上述情况下，才有必要作溶剂的检查。虽然生产商可以选择性地测定制剂，但也可以从制剂中各成分的残留溶液水平来累积计算制剂中的残留溶剂。如果计算结果等于或低于本原则的建议水平，该制剂可考虑不检查残留溶剂，但如果计算结果高于建议水平则应 页脚内容2

分子生物学课程教学大纲

分子生物学课程教学大纲 课程名称：分子生物学（Molecular Biology） 课程编号：1313072215 课程类别：专业课 总学时数：68 课内实验时数：18 学分：3.5 开课单位：生命科学学院生物技术教研室 适用专业：生物技术 适用对象：本科（四年） 一、课程的性质、类型、目的和任务 分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。 通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。 二、本课程与其它课程的联系与分工 从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。 三、教学内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容； 第一章绪论 第一节引言 创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2] 第二节分子生物学简史[1] 第三节分子生物学研究的主要内容 分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3] 第四节展望 分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1] 重点：分子生物学的含义和研究内容

残留溶剂的指导原则

杂质：残留溶剂的指导原则 1．介绍 本指导原则旨在介绍药物中残留溶剂在保证人体安全条件下的可接受量，指导原则建议使用低毒的溶剂，提出了一些残留溶剂毒理学上的可接受水平。 药物中的残留溶剂在此定义为在原料药或赋形剂的生产中，以及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物，它们在工艺中不能完全除尽。在合成原料药中选择适当的溶剂可提高产量或决定药物的性质，如结晶型。纯度和溶解度。因此．有时溶剂是合成中非常关键的因素。本指导原则所指的溶剂不是谨慎地用作赋形剂的溶剂，也不是溶剂化物，然而在这些制剂中的溶剂含量也应进行测定，并作出合理的判断。 出于残留溶剂没有疗效，故所有残留溶剂均应尽可能．去，以符合产品规范、GMP或其他基本的质量要求。制剂所含残留溶剂的水平不能高于安全值，已知一些溶剂可导致不接受的毒性（第一类，表1），除非被证明特别合理，在原药、赋形剂及制剂生产中应避免使用。一些溶剂毒性不太大（第二类，表2）应限制使用，以防止病人潜在的不良反应。使用低毒溶剂（第三类，表3）较为理想。附录1中列出了指导原则中的全部溶剂。 表中所列溶剂并非详尽无遗，其他可能使用的溶剂有待日后补充列人。第一、二类溶剂的建议限度或溶剂的分类会随着。新的安全性资料的获得而调整。含有新溶剂的新药制剂、其上市申请的安全性资料应符合本指导原则或原料药指导原则 （Q3A新原料药中的杂质）或新药制剂（Q3B新药制剂中的杂质）中所述的杂质控制原则，或者符合上述三者。 2. 指导原则的范围 指导原则范围包括原料药、赋形剂或制剂中所含残留溶剂．因此，当生产或纯化过程中会出现这些溶剂时。应进行残留溶剂的检验。也只有在上述情况下，才有必要作溶剂的检查。虽然生产商可以选择性地测定制剂，但也可以从制剂中各成分的残留溶液水平来累积计算制剂中的残留溶剂。如果计算结果等于或低于本原则的建议水平，该制剂可考虑不检查残留溶剂，但如果计算结果高于建议水平则应进行检测，以确定制剂制备过程中是否降低了有关溶剂的量以达到可接受水平。果制剂生产中用到某种溶剂，也应进行测定。 本指导原则不适用于临床研究阶段的准新原料药、准赋形剂和准制剂。也不适用于已上市的药品。 本指导原则适用于所有剂型和给药途径。短期（如30天或更短）使用或局部使用时，允许存在的残留溶剂水平可以较高。应根据不同的情况评判这些溶剂水平。 有关残留溶剂的背景附加说明见附录2。 3．通则 3.1 根据危害程度对残留溶剂分类 “可耐受的日摄人量”（TDI）是国际化学品安全纲要（IPCS）用于描述毒性化合物接触限度的术语。“可接受的日摄人量”（ADI）是WHO及一些国家和国际卫生组织所用的术语。新术语“允许的日接触量”（PDE）是本指导原则中用于定义药物中可接受的有机溶剂摄人量，以避免与同一物质的ADI混淆。 本原则中残留溶剂的评价以通用名和结构列于附录1，根据它们对人体可能造成的危害分为以下三类； （1）第一类溶剂：应避兔的溶剂 为人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物。 （2）第二类溶剂。应限制的溶剂 非遗传毒性动物致癌或可能导致其他不可逆毒性测神经毒性或致畸性）的试剂。 可能具其他严重的但可逆毒性的溶剂。 （3）第三类溶剂：低毒性溶剂 对人体低毒的溶剂，无须制定接触限度；第三类溶剂的PDE为每天50mg或50mg以上。 3.2 建立接触限度的方法 用于建立残留溶剂的PDE方法见附录3。用于建立限度的毒理数据的总结见Pharmeuropa，Vol . 9，No . l，Suplement，April 1997. 3.3 第二类溶剂限度的选择方法 制定第二类溶剂的限度时有两种选择。 方法1: 使用表 2中以 ppm为单位的浓度限度，假定日给 药量为10g，以方程(1)计算。 方程(1) C(ppm)= PDE：mg／天剂量：g／天 这些限度对所有原料药、赋形剂和制剂均适用。因此，这一方法可用于日剂量未知或未定的情况、只要在处方中所有的赋形剂和原料药都符合方法1给定的限度，就可以以任何比例用于制剂。只要日剂量不超过10g，就无须进一步计算。服用剂量超过 10g／天，应考虑用方法 2。 方法2：制剂中的每一种成分不必符合方法1的限度。药物中允许的残留溶剂限度水平，可根据表2中 PDE mg／天及已知最大日剂量，用方程（1）来计算。只要证明已降低至实际最低水平，便可以认为这种限度是可接受的、该限度能说明分析方法的精度、生产能力和生产工艺的合理变异，并能反映当前生产的标准水平。 应用方法2时可将药物制剂的每种成分中残留溶剂叠加起来，每天的总溶剂量应低于PDE给定的值。 下面举例说明如何用方法l和2来考虑制剂中的乙睛限度。乙睛的允许日接触量是4.1 mg／天，因此由方法1算出限度是

残留溶剂的指导原则

残留溶剂的指导原则 1．介绍 本指导原则旨在介绍药物中残留溶剂在保证人体安全条件下的可接受量，指导原则建议使用低毒的溶剂，提出了一些残留溶剂毒理学上的可接受水平。 药物中的残留溶剂在此定义为在原料药或赋形剂的生产中，以及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物，它们在工艺中不能完全除尽。在合成原料药中选择适当的溶剂可提高产量或决定药物的性质，如结晶型。纯度和溶解度。因此．有时溶剂是合成中非常关键的因素。本指导原则所指的溶剂不是谨慎地用作赋形剂的溶剂，也不是溶剂化物，然而在这些制剂中的溶剂含量也应进行测定，并作出合理的判断。 出于残留溶剂没有疗效，故所有残留溶剂均应尽可能．去，以符合产品规范、GMP或其他基本的质量要求。制剂所含残留溶剂的水平不能高于安全值，已知一些溶剂可导致不接受的毒性（第一类，表1），除非被证明特别合理，在原药、赋形剂及制剂生产中应避免使用。一些溶剂毒性不太大（第二类，表2）应限制使用，以防止病人潜在的不良反应。使用低毒溶剂（第三类，表3）较为理想。附录1中列出了指导原则中的全部溶剂。 表中所列溶剂并非详尽无遗，其他可能使用的溶剂有待日后补充列人。第一、二类溶剂的建议限度或溶剂的分类会随着。新的安全性资料的获得而调整。含有新溶剂的新药制剂、其上市申请的安全性资料应符合本指导原则或原料药指导原则（Q3A新原料药中的杂质）或新药制剂（Q3B新药制剂中的杂质）中所述的杂质控制原则，或者符合上述三者。 2. 指导原则的范围 指导原则范围包括原料药、赋形剂或制剂中所含残留溶剂．因此，当生产或纯化过程中会出现这些溶剂时。应进行残留溶剂的检验。也只有在上述情况下，才有必要作溶剂的检查。虽然生产商可以选择性地测定制剂，但也可以从制剂中各成分的残留溶液水平来累积计算制剂中的残留溶剂。如果计算结果等于或低于本原则的建议水平，该制剂可考虑不检查残留溶剂，但如果计算结果高于建议水平则应进行检测，以确定制剂制备过程中是否降低了有关溶剂的量以达到可接受水平。果制剂生产中用到某种溶剂，也应进行测定。 本指导原则不适用于临床研究阶段的准新原料药、准赋形剂和准制剂。也不适用于已上市的药品。 本指导原则适用于所有剂型和给药途径。短期（如30天或更短）使用或局部使用时，允许存在的残留溶剂水平可以较高。应根据不同的情况评判这些溶剂水平。 有关残留溶剂的背景附加说明见附录2。 3．通则 3.1 根据危害程度对残留溶剂分类 “可耐受的日摄人量”（TDI）是国际化学品安全纲要（IPCS）用于描述毒性化合物接触限度的术语。“可接受的日摄人量”（ADI）是WHO及一些国家和国际卫生组织所用的术语。新术语“允许的日接触量”（PDE）是本指导原则中用于定义药物中可接受的有机溶剂摄人量，以避免与同一物质的ADI混淆。 本原则中残留溶剂的评价以通用名和结构列于附录1，根据它们对人体可能造成的危害分为以下三类； （1）第一类溶剂：应避兔的溶剂 为人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物。 （2）第二类溶剂。应限制的溶剂 非遗传毒性动物致癌或可能导致其他不可逆毒性测神经毒性或致畸性）的试剂。 可能具其他严重的但可逆毒性的溶剂。

分子生物学实验教学大纲

分子生物学实验教学大纲 一、说明 1、课程类别 专业课 2、教学目的 通过实验教学使学生了解、验证、巩固和加深所学理论知识，掌握分子生物学研究的基本实验技能，如：质粒（植物/动物）DNA的分离及纯化、植物总RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳等技术。培养科学、严谨、实事求是的学风，提高动手能力、分析问题解决问题的能力以及创新性思维。 3、教学内容 本门课教学主要以某一基因为主线，从基因的分离、纯化、克隆、及鉴定等方面入手，帮助学生掌握分子生物学基本的实验方法和技能，在此基础上对分子生物学方法的应用和意义有一个整体的把握，在可能的情况下同时提供多种实验材料让学生自行设计和准备实验，培养其独立科研能力。 4、教学方式 以实验操作为主，配合原理教授、实践性教学、多媒体教学和学生实验报告、撰写论文、自学等方法进行学习。 5、考核内容及方式 实验操作 30％，实验结果 30％，实验报告 30％，考勤 10％。参照以下几个方面评定成绩。 （一）认真预习实验并书写实验预习报告； （二）实验态度认真，操作规范，遵守实验室管理规定； （三）按规定步骤进行实验，实验结果准确； （四）认真撰写实验报告。 6、本课程授课时间（学期），总学时数。 本课程在三年级开设，总计36学时，学时分配见下表: 教学时数分配表

二、教学内容 1、教学目标（课程） 通过本课程的教学使学生了解和掌握现代分子生物学研究的基本原理、方法、技术和技能，包括DNA 提取、PCR 扩增等。通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生命科学探索的兴趣和爱好。 2、教学内容（分章节描述） 实验一质粒DNA的提取 1．主要内容碱裂解法提取载体质粒。 2．教学要求学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。 实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA 1．主要内容（1）电泳基本知识介绍（2）琼脂糖凝胶的制备（3）质粒的定量。 2．教学要求掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 实验三植物总RNA的提取及检测 1．主要内容（1）RNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握植物组织中提取RNA的基本原理和实验技术方法。 实验四动物总DNA的提取 1．主要内容（1）总DNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握动物组织中提取总DNA的基本原理和实验技术方法。 实验五 PCR基因扩增 1．主要内容（1）PCR基本原理（2）PCR溶液体系的制备（3）PCR仪使用 2．教学要求掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。 （二）重点和难点

ICH_Q3c_杂质：残余溶剂的指导原则(中文版)纯净版

杂质：残留溶剂的指导原则
杂质：残留溶剂的指导原则
1．介绍 本指导原则旨在介绍药物中残留溶剂在保证人体安全条件下的 可接受量，指导原则建议使用低毒的溶剂，提出了一些残留溶剂毒理 学上的可接受水平。 药物中的残留溶剂在此定义为在原料药或赋形剂的生产中，以 及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物， 它们在工艺中 不能完全除尽。 在合成原料药中选择适当的溶剂可提高产量或决定药 物的性质，如结晶型。纯度和溶解度。因此．有时溶剂是合成中非常 关键的因素。本指导原则所指的溶剂不是谨慎地用作赋形剂的溶剂， 也不是溶剂化物，然而在这些制剂中的溶剂含量也应进行测定，并作 出合理的判断。 出于残留溶剂没有疗效，故所有残留溶剂均应尽可能．去，以 符合产品规范、GMP 或其他基本的质量要求。制剂所含残留溶剂的 水平不能高于安全值，已知一些溶剂可导致不接受的毒性（第一类， 表 1） ，除非被证明特别合理，在原药、赋形剂及制剂生产中应避免 使用。一些溶剂毒性不太大（第二类，表 2）应限制使用，以防止病 人潜在的不良反应。使用低毒溶剂（第三类，表 3）较为理想。附录 1 中列出了指导原则中的全部溶剂。
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杂质：残留溶剂的指导原则
表中所列溶剂并非详尽无遗， 其他可能使用的溶剂有待日后补充 列人。第一、二类溶剂的建议限度或溶剂的分类会随着。新的安全性 资料的获得而调整。含有新溶剂的新药制剂、其上市申请的安全性资 料应符合本指导原则或原料药指导原则（Q3A 新原料药中的杂质） 或新药制剂（Q3B 新药制剂中的杂质）中所述的杂质控制原则，或者 符合上述三者。 2. 指导原则的范围 指导原则范围包括原料药、 赋形剂或制剂中所含残留溶剂． 因此， 当生产或纯化过程中会出现这些溶剂时。应进行残留溶剂的检验。也 只有在上述情况下，才有必要作溶剂的检查。虽然生产商可以选择性 地测定制剂， 但也可以从制剂中各成分的残留溶液水平来累积计算制 剂中的残留溶剂。如果计算结果等于或低于本原则的建议水平，该制 剂可考虑不检查残留溶剂， 但如果计算结果高于建议水平则应进行检 测， 以确定制剂制备过程中是否降低了有关溶剂的量以达到可接受水 平。果制剂生产中用到某种溶剂，也应进行测定。 本指导原则不适用于临床研究阶段的准新原料药、 准赋形剂和准 制剂。也不适用于已上市的药品。 本指导原则适用于所有剂型和给药途径。短期（如 30 天或更短） 使用或局部使用时，允许存在的残留溶剂水平可以较高。应根据不同 的情况评判这些溶剂水平。 有关残留溶剂的背景附加说明见附录 2。
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感受态细胞转化操作步骤12.8

感受态细胞转化 （一）实验准备： 1.Amp母液： 称取氨苄青霉素100mg溶于1ml dd H2O中。0.22μm滤器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱. 2.X-Gal溶液（2%，m/v） 称取20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺（DMF）中。用玻璃试管或聚丙烯管分装后储存于-20℃冰箱,装有X-Gal溶液的试管须用铝箔包裹以防因光照而被破坏.（无须过滤） 3.IPTG（20%,m/v,0.8mol/L） 称取IPTG2g溶于8ml dd H2O中。用蒸馏水定容至10mL。0.22μm 滤器过滤除菌，用EP管分装成1mL一小份后储存于-20℃冰箱. （二）操作步骤“ 质粒pBS SK(-)的转化 1.取感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，分别在100μl 感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。 感受态细胞+pBS SK(-)质粒2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl) 感受态细胞+无菌水2μl （阴性对照） 2. 热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。

3. 复苏：向每管中加入400μl LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 涂布平板筛选转化质粒 方法一（《分子克隆实验指南》标准方法） 1.将溶化的顶层琼脂分装于17*100mm试管，将试管置于45℃的加 热块槽内备用。 （90mm培养板用3mL顶层琼脂；150mm培养板用7mL顶层琼脂）2．从加热块取出一支试管，快速加入活菌含量不多于3000（90培养基）或10000（150培养基）的细菌悬液0.1mL。盖紧试管盖颠倒数次。以使细菌在琼脂中混匀。 3.按下表加入： 4. 快速将溶化的顶层琼脂倾入含有适当抗生素的凝固琼脂板的中部，旋转培养板使琼脂散匀。 .注：含Amp的LB固体培养基倒板 (1)配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 (2)抗生素的加入：高压灭菌后，应使培养基降温至50℃，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/ml Amp溶液1ml，使其终浓度为

ICH残留溶剂指南(中文翻译)

5．4残留溶剂在活性物质、赋形剂和药品中残留溶剂的级别限度 International Conference on Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)已采用了关于残留溶剂的杂质指南，它规定了生产后允许残留在活性物质、赋形剂和药品中溶剂的含量限度。本指南（文本复制见下文）不包括已上市的产品。然而欧洲药典应用了存在的活性物质、赋形剂和药品指南中同样的原理，无论它们是否药典专论主题。所有物质和产品都需要测定可能存在于物质或产品中的残留溶剂的含量。 如果异类溶剂的使用已被证明其合理性也已授权，那么它会在各个专论的测试部分受限定。 通常，药典专论不包括单一二类溶剂的测试限度，因为该类溶剂随生产商的不同变化很大。因而生产工艺中使用该类溶剂时应通知主管当局。这个通知也应随用于证明欧洲药典的实用型的档案一同提交，并在证明中提及。 当生产工艺中只使用了三类溶剂，可应用干燥失重测试，该测试应在单一专论中叙述。如果三类溶剂的限度大于0.5%，并已经证明合理性和授权，那么还要求有该溶剂的指定的检测方法。在这种情况下，限度在单一专论中给出，因为定义指的是无水和无溶剂的物质。在所有情况下，应巴使用的溶剂通知主管当局。至于二类溶剂，该通知已在适用性证明中提及。 当使用了一类残留溶剂或二类残留溶剂（或三类残留溶剂超过0.5%），应尽可能使用在一般方法（2.4.24）中叙述的方法学。否则应使用经适当验证的方法。 _______________________

杂质：残留溶剂指南 （CPMP/ICH/283/95） 1.引言 2.指南的范围 3.一般原则 3.1.危险评估对溶剂的分类 3.2.规定暴露限度的方法 3.3.二类溶剂的限度叙述的选择 3.4.分析规程 3.5.残留溶剂的报告水平 4.残留溶剂的限度 4.1.避免使用的溶剂 4.2.规定限度的溶剂 4.3.低毒性潜能的溶剂 4.4.未发现充分毒性数据的溶剂 词汇表 附录1. 溶剂列表包括指南 附录2. 附加背景资料 附录2.1: 有机挥发性溶剂的环境规程 附录2.2: 药物中的残留溶剂 附录3. 规定暴露限度的方法 _______________________

RNA干扰载体的构建的实验流程图

RNA干扰载体的构建的实验流程 RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。 产品技术背景 pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。插入寡核苷酸设计

pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。 1. 选择干扰序列 在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列： 推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。 RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。 RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。 确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。

重组质粒在大肠杆菌中的表达

重组质粒在大肠杆菌中的表达 1. 仪器耗材 紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml 三角烧瓶、移液枪、枪头。 2. 试剂及配制 （1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。 （2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。 （3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。 （4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。 3. 实验步骤 （1）构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。 （2）挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。 （3）把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。 （4）37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。 （5）取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。 （6）诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。（7）将不同诱导时间的菌样进行SDS-PAGE，分析蛋白的诱导表达情况。

某公司内部的CRISPR-Cas9操作流程

Genloci Classic CRISPR-Cas9内 部操作流程

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下： pGK1.1 U6 CACC G CAAA 4 5 5’ -5’ 3’ -3’ - - ～20bp

2，操作步骤 实验前，请您务必做好以下验证实验： A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。 B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分 析靶基因的活跃度。 1. 设计Oligo DNA序列 首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计： ●麻省理工学院的CRISPR Design：https://www.wendangku.net/doc/452749513.html,/ ●德国癌症研究中心的E-Crisp：https://www.wendangku.net/doc/452749513.html,/E-CRISP/designcrispr 下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。 点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8” 根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）： Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC ※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。 另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp 的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。 将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。 2. T4 DNA Ligase连接 将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

世界各国药典对药物残留溶剂测定法的比较研究

世界各国药典对药物残留溶剂测定法的比较研究 发表时间：2012-01-10T11:20:29.600Z 来源：《医药前沿》2011年第22期供稿作者：李明[导读] 为药物残留溶剂提供了不同药典测定的思路。 李明（江西省赣州卫生学校药学医技系江西赣州 341000）【中图分类号】R921.3/.7【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）22-0213-02 【摘要】目的比较世界各国药典对药物残留溶剂测定方法，为残留溶剂提供不同药典的测定思路。方法对ChP2010、USP34、BP2011、EP7.0、JP15收载的残留溶剂种类、限度、色谱检测方法和系统适用性要求，对照品及供试品的配制要求作了详细介绍。结论因为某一具体品种各生产企业引入的溶剂亦有不同而难于统一规定，国外药典通过混合对照品法对残留溶剂的测定控制较为严格，中国药典2010也逐步认识到残留溶剂测定的重要性。 【关键词】世界各国药典残留溶剂测定法药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及在制剂过程中使用或产生的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。根据国际化学品安全性纲要，美国环境保护机构、世界卫生组织等一些国际组织的研究结果，很多有机溶剂对环境、人体都有一定的危害，因此，为保障药物的用药安全，控制产品质量，需要进行有机溶剂残留量的研究和控制。目前虽有陈立亚[1]和陈苏伟[2]等人发表了相关文章，但均未对各国药典中的残留溶剂测定法做系统的比较分析，本文通过对ChP2010、USP34、BP2011、EP7.0、JP15收载的残留溶剂种类、限度、色谱检测方法和系统适用性，对照品及供试品的配制要求作详细介绍。为药物残留溶剂提供了不同药典测定的思路。 1 各国药典收载的残留溶剂种类及限度目前ChP2010、USP34、BP2005、EP5.0、JP15 等残留溶剂的种类和限度的规定均参考人用药物注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical Use, ICH）颁布的指导原则。ICH于1996年11月6日颁布了残留溶剂测定指导原则征求意见稿，并对外公布，以便获取公众对指导原则的建议。该指导原则于1997年 7 月 17 日被ICH指导委员会采用，正式实施。 ICH 根据危害程度对残留溶剂进行了系统分类，“允许的日接触量”（permitted daily exposure ,PDE）的定义是指某一有机溶剂被允许摄入而不产生毒性的日平均最大剂量，单位为mg/天。依据毒性的不同，将69种残留溶剂分成了四类。（见表1）表 1 69种残留溶剂的分类 类别毒性 PDE（mg/天）第一类溶剂人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物 0.1以下(1,1,1)三氯乙烷除外（15.0）第二类溶剂有非遗传致癌毒性或其他不可逆毒性、或其他严重的可逆毒性 0.5-50 第三类溶剂对人体低毒 50 以上 第四类溶剂尚无足够毒理学资料 PDE也一直是一个动态的修订过程，鉴于新的毒理学数据的获得，ICH 分别于2002年12月12日和10月28日修订了四氢呋喃（THF）和N-甲基吡咯烷酮（NMP）的PDE，将四氢呋喃（THF）由三类溶剂改为二类有机溶剂。ICH根据不同残留溶剂的的PDE值，制定了不同残留溶剂的限度。其中USP30版本之前对“残留溶剂”一直称为“有机挥发性杂质”（organic volatile impurities<467>,2008年7月1日美国药典统一改为了 “残留溶剂” （residual solvents <467>）。其中BP2011将环氧乙烷和二氧六环不再作为残留溶剂项下，而是另外作为一测定项单独列出。即各国药典收载的残留溶剂种类和限度是一致的，目前均遵守ICH 指导原则。 2 世界各国药典对残留溶剂色谱检测方法的比较世界各国药典均首选气相色谱法测定有机残留溶剂，但是具体在测定方法、色谱条件、供试品和对照品的制备、系统适用性方面有差别，下面分别予以比较。 2.1 ChP2010 的相关规定（表2）[3] 表2 ChP2010中残留溶剂的测定方法

分子克隆实验指南

做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。 关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。 有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。 1，PCR引物的设计。通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG 位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（A TC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。 2，PCR产物。两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种，连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。 3，提质粒。有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。 4，酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点： ①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。 ②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。 ③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。 ④酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。 5，回收。回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，