Gateway系统快速构建花生条纹病毒cp反向重复序列载体

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(2):356~357

*基金项目： 中国农业科学院中荷博士生联合培养项目和农业部油料作物遗传改良重点实验室开放课题(NO.200404)资助。 **通讯作者。Author for correspondence.研究员， 博导,主要从事植物病毒学研究。E-mail:. 收稿日期：

2006-07-07 接受日期： 2006-08-26 ·研究简报

· Gateway 重组系统快速构建花生条纹病毒

基因反向重复序列载体 *

晏立英 1,2 , 许泽永 1 **, 陈坤荣 1 , Rob Goldbach 2 ,Marcel Prins

2

(1.中国农业科学院油料作物研究所油料作物遗传改良农业部重点实验室， 武汉 430062；

https://www.wendangku.net/doc/477366604.html,boratory of Virology,Wageningen University,Netherlands)

关键词： 花生条纹病毒； ； Gateway ； 反向重复序列载体

中图分类号:S184S188 文献标识码:A 文章编号: 1006-1304(2007)02-0356-02

Quick Construction of Inverted Repeat Vector of Gene by Gateway System

YAN Li-ying 1,2 ,XU Ze-yong 1 **,CHEN Kun-rong 1 ,Rob Goldbach 2 ,Marcel Prins

2

? ?Gateway?inverted repeat sequence vector

Gateway 重组系统是 Invitrogen 公司推出一种新的克隆 策略。鉴于一般用于农杆菌转化植物的质粒比较大， 采用常

规的酶切和连接的克隆策略耗时、费力， Gayteway

TM

重组系 统为大载体的操作提供了一种快速和可靠的手段。该系统利 用噬菌体转染细菌后整合细菌 DNA 的位点特异性重组策略 （Landy ， 1989），重组过程是保守位点特异性 DNA 链的切割 和重接， 整个过程中没有DNA 的合成。 应用Gateway 重组系 统构建植物反向重复序列表达载体包括两个重组过程： 第 一， BP 重组： 目的片段重组至入门载体 （Entry clone ）； 第二， LR 重组，

目的片段自入门载体重组至植物表达载体。本实验 室拟利用这一系统构建花生条纹病毒 （PStV ） 红安株系的 反向重复序列载体， 进行烟草转化， 期望获得抗性的转基因 植株。

1 材料和方法

1.1 材料

花生条纹病毒 （

,PStV ） 红安株系

（Hongan ） cDNA 克隆由本实验室构建； 质粒pDONR207购自 Invitrogen ； pK7GW1WG2 由 Belgium Ghent University 惠赠；

根癌农杆菌( )GV3101 菌株由荷兰

病毒实验室保存。 1.2 实验方法

PStV 基因的 PCR 扩增： 利用携带 位点的上游和下 游引物对 PStV-Hongan

基因进行PCR 扩增， 扩增条件为：

94 ℃预变性 3min ； 94 ℃变性 30s ， 51 ℃退火 30s ， 72 ℃延伸 1min ， 35个循环?72 ℃延伸 10min 。

BP 重组反应： 利用 Invitrogen 公司的 BP 重组试剂盒， 将 PStV-Hongan

基因 PCR 扩增后纯化的片段与入门载体

pDONR207 按照 5颐

1的比例根据 BP 重组试剂盒说明书进行 重组反应， 重组产物转化 XL1-blue 感受态细胞， 在含有庆大 霉素 （Get ） 的培养基上筛选重组克隆。利用 PStV-Hongan 基因的特异引物对重组克隆进行菌落 PCR 扩增， 利用 玉

对提纯质粒进行酶切鉴定。

LR 重组反应：利用 Invitrogen 公司的 LR 重组试剂盒，

将克隆至 pDONR207 上的 PStV-Hongan 基因与目标载体

pK7GW1WG2按照 LR 重组试剂盒说明书进行重组反应， 电 激转化后涂布含有壮观霉素平板。对获得的克隆进行 PCR 反应，鉴定目的片段是否以反向重复序列方式重组至载体， 并通过

玉酶切鉴定载体上Intron 的方向。

2 结果和分析

2.1PStV 基因的 PCR 扩增

利用携带

位点的引物扩增得到 PStV 全长

基因

（图 1）。

2.2BP 重组克隆的鉴定

利用 PStV

特异引物对 Get 平板上的抗性克隆（命名 为pDONR ） 进行 colony PCR 反应， 挑选的 6 个克隆都扩增 出914bp 的片段 （图 2）。 挑选 3个克隆提取质粒， 玉进行

第 2 期 晏立英等：Gateway 重组系统快速构建花生条纹病毒 基因反向重复序列载体 酶切， 得到 200bp 左右的目的片段 （图 3）。 图1.PStV 基因 RT-PCR 扩增的结果

Fig .1.RT-PCR amplified result of PStV

gene

1,200bp ladder?2,PStV

gene RT-PCR band.

图2.pDONR 的PCR 鉴定 Fig.2.Detection of pDONR

by PCR

1～6,PCR bands of pDONR ? M,λ DNA/ Ⅰ marker.

图3.pDONR 的酶切鉴定 Fig.3.Identification of pDONR by

I

M, λ DNA/ Ⅰ marker?1～3,3 different clones of pDONR .

2.3LR 重组克隆的鉴定

pDONR 与植物表达载体 pK7GW1WG2经 LR 重组试

剂盒进行重组，挑选壮观霉素平板上抗性克隆进行鉴定。 PStV 基因反向重复插入和内含子方向的鉴定分别利用 PCR 和酶切。内含子上游载体引物与 PStV 特定引物鉴定

PStV

基因在内含子左侧的整合（图 4）， PStV 特定引物与

内含子下游载体引物鉴定PStV

基因在内含子右侧的整合

（图 5）； Ⅰ酶切鉴定重组后内含子的方向，

内含子重组后 正方向的片段为 1.3kb ， 反方向的片段大小为 1.5kb （图 6）。 挑选的 12个克隆经PCR 扩增， 100% 得到 PStV

基因的反

向重复序列方式插入，其中重组后内含子为正方向的有 7

个， 为反方向的有5个。

图5.对pK 内含子右侧PStV 基因的PCR 扩增

Fig .5.Detection of PStV

gene on the right side of

intron of pK by PCR

M, λ DNA/ Ⅰmarker?1～12,PCR amplified band.

图6. I 对pK 内含子方向的酶切鉴定

Fig.6.Identification of intron direction of pKcp by Ⅰdigestion

1～12,12clones digested by Ⅰ?M,DNA Ⅰmarker.

3 讨论

利用 Gateway 系统进行目的基因或片段反向重组序列 载体的构建， 该重组系统设计了 DNA 重组序列

（ 位点） 和 毒性基因 （Bernard and Couturier,1992）， 由于

基

因产生的蛋白对常用的大肠杆菌菌株有毒性，

未能发生重组 的克隆不能正常生长， 所以在筛选培养基上得到的菌落几乎 都是阳性重组克隆。

本实验对 PStV BP 重组后随意挑选的

6 个克隆进行 Colony PCR ，

都得到目的大小的片段， 挑选其 中3个进行酶切鉴定， 结果都为阳性。 对 LR 重组后任意挑选 的 12 个克隆进行 colony PCR 扩增， 12个克隆都发生了目的 片段正向和反向重组，

经 Ⅰ酶切鉴定，

7个克隆内含子为 正确方向， 5 个克隆内含子改变了方向。从目的片段的PCR

扩增， 到最后重组至植物表达载体只用了 2

周的时间，

而利 用常规的酶切、

连接方法约一个月， 利用 Gateway 系统大大 节约了时间。该系统为目的基因反向重序列载体的构建提供 了快速、 可靠的手段。

参 考 文 献

Bernard P and Couturier M.Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase 域 complexes （J ） .

,l992,226(3):735～745

Landy A.Dynamic,structural and regulatory aspects of lambda

site-specific recombination （J ） . 1989,58:913～949

图4.对pK 内含子左侧 PStV 基因的 PCR 扩增

Fig.4.Detection of PStV

gene on the left side of intron

of pK by PCR

1～12,PCR amplified band?N,

negative control?M, λ DNA/ Ⅰmarker.

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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月

目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

载体构建流程

载体构建SOP流程: GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒 I.获取目的基因/序列片段 一.获取序列信息 通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。 在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。 二.制备模板 1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含

载体构建的基本步骤

载体构建 一．原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二．操作步骤 1．摇菌 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。2．提质粒 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3．酶切 按下表加入试剂。 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4．电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 5．连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下： 双蒸水5μL 10×T4 DNA连接缓冲液1μL 载体2μL 酶切后的目的基因1μL T4DNA连接酶1μL 总体积10μL 置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6．转化 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7．单克隆检测 （1）挑单克隆

先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。 三．注意事项 1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验； 2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA 片段的自身环化。 参考： 1.刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002 2.周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社，2003：117-120 3.李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社，2008:138-142 4.朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006:134-139

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用 摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。 关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗 基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介 慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建 由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件 为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体

慢病毒包装原理及应用

慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选； 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

慢病毒载体,稳定表达

慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】

慢病毒载体构建步骤研究

一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可 折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前 通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的

慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法

一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。B．PCR扩增产物的胶回收 原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收

慢病毒相关知识问答

慢病毒载体相关知识问答 Q:什么是慢病毒？ A: 慢病毒载体(Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。慢病毒和细胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞内。慢病毒RNA通过逆转录酶转录为DNA。DNA整合前复合体进入细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。由于靶基因或基因干扰序列整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因的导入能够获得稳定的表达。慢病毒的显著优势在于其可以整合到非分裂细胞，而其他载体（如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体）不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂细胞的染色体（如常规的逆转录病毒）。目前我们使用的慢病毒载体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次改造在包装滴度和使用安全性等方面都非常理想。在实际的使用中我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着RNAi研究的深入，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列. Q:慢病毒用于RNAi研究 A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

载体构建 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用） 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。 2、提质粒（也就是载体） 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3、酶切（双酶切产生粘性末端） 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能； 检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。 5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6、转化（连接产物转化到感受态细胞中） 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。 7、单克隆检测 （1）挑单克隆 先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μ

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基

慢病毒载体构建及包装操作手册

慢病毒载体构建及包装操作手册 目录 慢病毒收到后的注意事项 一、整体实验流程 二、实验材料 三、慢病毒包装和浓缩 四、感染目的细胞 附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表 附2. 慢病毒滴度测定方法简介 附3. 慢病毒MOI感染参数 附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较

慢病毒安全使用和注意事项 ?慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*） 1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。 2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3)操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70% 乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。 4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。 5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。 6)实验完毕用香皂清洗双手。 ?慢病毒收到后的注意事项 1)慢病毒的储存 用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。 注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。 b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。 2)慢病毒的稀释

用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

载体构建

载体构建

载体构建分为以下步骤： 1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因 2.目标片段的PCR扩增 3.载体和目标片段的限制性酶切 4.连接转化 5.挑取克隆提质粒 6.单克隆的验证及送样测序。 载体的选择 实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。举例如下： 实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。 引物设计 引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。 载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。 Flag标签： D Y K D D D D K GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG 6XHis标签： H H H H H H CAC CAC CAC CAC CAC CAC HA标签： Y P Y D V P D Y A TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT Myc标签： E Q K L I S E E D L 这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。

病毒转染原理及步骤PDF.pdf

病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。 二、慢病毒载体构建及包装流程： （一）实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD 酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因 CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化

CRISPRCas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建

CRISPRCas9基因敲入试验步骤（三）donor载体构建载体构 建 1、质粒骨架的选择 CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C. elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2（可剪切RNA）。当然，还有一些筛选标记，如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种，最具有争议的Ngago，本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样，GFP验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种Ngago载体，效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证；最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷），这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据，最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好，knock down 有表型，如果没表型，估计也会放弃。这里就说到这，有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有，网址/。

2、酶切位点的选择 插入sgRNA的酶切位点，质粒基本为这两种，BsmbI和Bbsi，具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有，我就不啰嗦了。哦还忘了一件事，使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！！以慢病毒载体V2为例具体说明3、同源臂的设计 同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段，长度大约1kb-2kb，效率还可以。当然了，有人也用40-100bp做了也做成功了，但基本原则是越长效率越高。1kb-2kb效率已经很高，所以这个最合适。有相关文献支持，自己Pubmed查看。 4、启动子、目的基因及其终止子的扩增 这里也没什么可说的，启动子在我们选择质粒的时候就决定了，当然我们还可以改造以提高sgRNA的表达效率，这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子，替换上去就ok了。 目的基因的话，如果我们要做敲除，基本就是根据基因组，在外显子区域设计sgRNA序列，切割后以非同源性末端接合（Non-homologous end joining, NHEJ），造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式，同源性重组（Homologous recombination，HR）同源性重组修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性，若其中一条染色体上的