利用原位杂交及CAPS标记分析芸薹属A、B和C基因组间的关系

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1188?1192

https://www.wendangku.net/doc/4a7400311.html,/zwxb/

ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9

E-mail: xbzw@https://www.wendangku.net/doc/4a7400311.html,

基金项目: 国家自然科学基金项目(30671166) 作者简介: 孔芳(1973–), 女, 博士研究生。

*

通讯作者(Corresponding author): 王幼平, 男, 博士生导师, 教授, 主要从事油菜遗传和生物技术育种研究。Tel: 0514-********; E-mail: wangyp@https://www.wendangku.net/doc/4a7400311.html,

Received(收稿日期): 2007-11-23; Accepted(接受日期): 2008-02-01.

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01188

利用原位杂交及CAPS 标记分析芸薹属A 、B 和C 基因组间的关系

孔 芳 蒋金金 吴 磊 王幼平*

(扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州225009)

摘 要: 以来源于Brassica rapa 基因组(AA)的重复序列(151 bp)为探针, 分别同二倍体白菜型油菜(AA, 2n =20)、甘蓝(CC, 2n =18)和异源四倍体芥菜型油菜(AABB, 2n =36)的中期染色体杂交, 白菜型油菜和甘蓝的所有染色体上都有杂交信号, 芥菜型油菜的染色体上显示出20个明显的信号, 其余染色体上信号很弱或无, 可以区分出A 和B 基因组。对来源于油菜3个基本种与3个复合种FAE1基因进行CAPS 分析表明, 3个基本种表现出不同的酶切式样, 用Mbo I 和Msp I 酶切表现出多态性, 基因组A 和C 非常相似, 而基因组B 与A 、C 关系较远, 同时3个复合种也并不是2个基本种的简单相加, 表明异源四倍体在长期进化过程中可能发生了重排和重组。 关键词: 芸薹属; 荧光原位杂交; 重复序列; CAPS 标记; 亲缘关系

Relationships among Genome A, B, and C Revealed by FISH and CAPS

KONG Fang, JIANG Jin-Jin, WU Lei, and WANG You-Ping *

(College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China)

Abstract : Physical localization of repetitive DNA sequence from genome A (151 bp) was carried out on the chromosomes of the

selected Brassica species by FISH (fluorescence in situ hybridization). The signals distributed on all the chromosomes of A (Brassica rapa , 2n =20) or C genome (B. oleracea , 2n =18). For B. juncea (AABB, 2n =36), the signals were found on all the chromosomes of genome A and the strength of signal varied among different chromosomes, while the chromosomes of genome B showed weak or no signals. F AE1 gene is a rate-limiting gene for erucic acid synthesis in Brassica . The genes from six Brassica species of U-triangule were cloned by PCR. These PCR products were digested with different restriction endonucleases. Mbo I and Msp I were found to produce informative CAPS patterns of F AE1 gene. Three diploids displayed different patterns, the pat-terns of genome A was very similar to that of genome C, while the patterns of genome B was the most diverged out of the patterns of the A and C genomes. Three amphidiploids generally exhibited additive patterns of the progenitors, but not strictly in all cases, indicating that rearrangements and recombinations did occur in the formation and evolution of amphidiploids. Genetic relation-ships among Brassica species could be demonstrated through CAPS analysis of F AE1 gene and FISH method when repetitive DNA sequence (not ribosomal RNA genes) was used as a probe.

Keywords: Brassica ; Fluorescence in situ hybridization (FISH); Repetitive DNA sequence; Cleaved amplified polymorphic se-quences (CAPS); Relationship

芸薹属(Brassica )是十字花科植物中较大且具有重要经济价值的属。组成芸薹属3个二倍体种(白菜型油菜, B. rapa , 2n =20, AA; 黑芥, B. nigra , 2n =16, BB; 甘蓝, B. oleracea , 2n =18, CC)和3个异源四倍体种(甘蓝型油菜, B. napus , 2n =38, AACC; 芥菜型油菜, B. juncea , 2n =36, AABB; 埃塞俄比亚芥, B. carinata , 2n =34, BBCC)之间的关系被称之为禹氏三

角[1]。大量的实验也表明, 3个异源四倍体物种分别由各自不同二倍体种相互杂交通过自然选择后进化而来[2-5]。

已有报道通过原位杂交方法研究上述6个种间的亲缘关系。李宗芸等[6]以C 基因组DNA 为探针, 对芸薹属5个种进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH), 结果A 、C 基因组不能被

第7期孔芳等: 利用原位杂交及CAPS标记分析芸薹属A、B和C基因组间的关系1189

区分开, 但B基因组可以和A、C基因组区分。Hasterok等[7]用5S rDNA和45S rDNA作探针, 发现3个异源四倍体种中的rDNA位点并不是各自二倍体种简单相加。Lim等[8]利用45S rDNA和5S rDNA 并结合两种不同着丝粒重复序列(CentBr1, CentBr2, 176 bp)作探针, 对B. rapa的所有10条染色体进行区分, 并发现重复序列主要分布在着丝粒区域, 同时在染色体臂上也有很少的结(knob)。

通过分子标记方法研究芸薹属不同种基因组之间关系表明, 芸薹属基因组进化过程中可能发生了染色体融合或裂变, 导致染色体数目的变化, 同时也可能伴随着大片段染色体的易位和倒位[2,9-12]。酶切扩增多态性序列(CAPS)是将特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记技术, 已被广泛用于植物的突变检测[13], 新分子标记开发[14]、分子标记辅助育种[15]、遗传作图[16-17]和基于图谱的基因克隆[18]。脂肪酸延长酶基因(FAE1)是调控油菜芥酸合成的关键基因, James等[19]率先从拟南芥(Arabidopsis)中克隆出FAE1基因并在多种芸薹属物种中克隆。本文从芸薹属6种植物中克隆FAE1基因, 通过CAPS分析, 并结合着丝粒重复序列作探针进行原位杂交, 来研究油菜基因组A、B和C之间的相互关系。

1材料与方法

1.1植物材料

白菜型油菜(Brassica rapa var. chinensis L. AA, 2n=20), 甘蓝(B. oleracea var. botrytis L. CC, 2n=18), 黑芥[B. nigra (L.) Koch BB, 2n=16], 甘蓝型油菜(B. napus L. “国审油2004026”, AACC, 2n=38), 埃塞俄比亚芥(B. carinata A. Br., BBCC, 2n=34) 和芥菜型油菜[B. juncea (L.) Czern., “胜利油菜”, AABB, 2n=36]种子由江苏里下河农科所提供。

1.2试验方法

1.2.1 染色体制片种子放在湿润滤纸上25℃下发芽, 待根长2~3 cm时经2 mmol L?1的8-羟基喹啉25℃处理2 h, 再10℃处理2 h。根尖用乙醇-冰醋酸(31)

∶固定液固定24 h, 若暂时不处理, 可换至70%的乙醇溶液中保存。制片前先用蒸馏水冲洗根尖2~3次, 洗去残留的固定液。用2%(W/V)纤维素酶(cellulase), 20%(V/V)果胶酶(pectinase)混合酶液处理根尖2 h(37)

℃; 接着用75 mmol L?1 KCl低渗溶液处理45 min, 取单个的根尖置预冷载玻片上, 后用60%冰醋酸去除细胞质; 最后用预冷的固定液进行展开, 晾干。于37℃放15 min后用。Olympus相差显微镜镜检, 选出染色体分散良好的载玻片。因油菜的染色体较小(1.5~4.5 μm), 两臂的重复序列较少, 通常我们选用较长的前中期染色体作为研究对象。1.2.2 基因组DNA的提取取上述6种植物的幼叶1~2 g ,于研钵中用液氮速冻, 迅速研磨。采用CTAB法[20]提取叶片总DNA, 并保存于50 μL TE溶液中, 并用分光光度计进行定量, 稀释到10 ng μL?1。

1.2.3 探针的制备根据GenBank(CW978699)设计引物5′-ATCCTGGTTTGATTGGAACG-3′, 5′-TGGATACATAAAGTGGTGGAGAA-3′。以B. rapa 基因组DNA为模板, 20 μL体系含 1 mmol L?1 MgCl2、1 U Taq酶(Hotstar)、800 μmol L?1 dNTP、0.2 μmol L?1引物、模板DNA 10 ng。反应程序为95℃变性15 min; 94℃变性45 s, 50℃退火1 min, 72℃延伸45 s, 30个循环; 72℃延伸10 min。

重复序列探针采用DIG-11-dUTP经缺口平移法标记, 按照试剂盒(Catalogue No. 11745816910, Roche, 瑞士)说明进行, Mix 10 μL, 蒸馏水20 μL, PCR产物20 μL, 15, 2 h

℃。

1.2.4 原位杂交染色体制片上加200 μL去离子甲酰胺(formamide deionized), 80℃变性3 min; 接着用乙醇梯度脱水70%、90%和100%(V/V), 空气晾干; 每张制片30~40 μL杂交液[50%(V/V)去离子甲酰胺, 10%(W/V)硫酸葡聚糖, 10 μL标记的探针, 0.5 μL变性鲑鱼精子DNA和5 μL 20×SSC]。加盖玻片, 封片。80℃变性10 min; 在保湿盒中37℃杂交过夜; 杂交后制片经2×SSC, 0.4×SSC在40℃条件下冲洗各2次。

1.2.5 信号检测和图像处理按照试剂盒(Catalogue No. 11745816910, Roche, 瑞士)说明进行杂交信号的放大和标记。然后每张制片用10 μL PI (propidium iodide)复染。使用Olympus BX51荧光显微镜观察染色体和杂交信号, 每个材料至少观察5个细胞, 对于分散较好的细胞加不同的滤光片进行拍照, 用Image-Pro Plus Version 5.0软件进行图片合成和处理。

1.2.6 FAE1基因的克隆和CAPS分析从6种材料中克隆FAE1基因, 根据Gupta等[21]提供的序列设计引物, PCR总体积为20 μL, 含10 ng基因组DNA、2.5 mmol L?1 MgCl2、0.2 mmol L?1 dNTP、0.2 μmol L?1引物、1 U Taq酶(Hotstar)。PCR扩增程序为95℃变性15 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸

1190 作 物 学 报 第34卷

45 s, 35个循环; 72℃延伸10 min, 10℃保存。PCR 产物经7种不同的限制性核酸内切酶(Alu I, Hpa I, Hin f I, Mbo I, Mse I, Msp I, Taq I)于37℃条件下酶切2~3 h, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳2~3 h/20 W, 银染。

2 结果与分析

2.1 原位杂交分析

来源于B. rapa 基因组的重复序列(151 bp)的杂交信号分布如图1, 杂交信号在二倍体种 B. rapa (AA) 和 B. oleracea (CC)上所有染色体上均有分布, 但主要分布在染色体的着丝粒部位; 对于异源四倍体种芥菜型油菜B. juncea (AABB), A 基因组的染色体上均有杂交信号, 分布在(近)着丝粒区域, 信号强度在不同的染色体上不同, B 基因组染色体上的杂交信号弱或无。

2.2 FAE1基因的克隆和CAPS 分析

所试6个种PCR 产物均可扩增出约1 500 bp 的产物(图2-A), 当这些PCR 产物经过不同的限制性核酸内切酶单酶切后, 在7种供试酶中, 均表现出不同的多态性。如图2-B 所示, Mbo I 消化后基因组B 总共出现4条带, 基因组A 和C 出现5条带, 而且基因组A 与C 的带型一致。3个双二倍体种中, 它们的带型效果一般来说是祖先种各自的CAPS 标记多态性的叠加, 例如AABB 分别是基因组AA 与BB 的CAPS 多态性的叠加。但是BBCC 和AACC 却不是基因组条带的简单叠加, 它出现了一条新的特异

图1 重复序列作探针和3种不同油菜杂交结果

Fig. 1 FISH analysis to mitotic chromosomes of three different Brassica species when repetitive sequence used as a probe

A: 白菜型油菜(AA); B: 甘蓝(CC); C: 芥菜型油菜(AABB)。探针用地高辛标记, 黄色; 染色体用PI 负染, 红色。

A: B. rapa (AA, 2n =20); B: B. oleracea (CC, 2n =18); C: B. juncea (AABB, 2n =36).

The chromosomes were counterstained by PI in red, and probe was labeled by anti-mouse-Ig-DIG in yellow. Bar=3 μm.

图2 6个种FAE1基因的CAPS 分析

Fig. 2 CAPS analysis of FAE1 genes in six Brassica species A: PCR 产物; B: Mbo I 酶切PCR 产物; C: Msp I 酶切PCR 产物

(箭头示新的条带)

A: PCR products; B: PCR products digested with Mbo I; C: PCR products digested with Msp I (novel band indicated by arrow) BB: B. nigra ; CC: B. oleracea ; AA: B. rapa ; BBCC: B. carinata ; AABB: B. juncea ; AACC: B. napus ; M: molecular weight marker.

性条带(如箭头所示)。PCR 产物经Msp I 消化后, 表现出不同的限制性片段模式(图2-C), AA 与CC 出现同样的带型, BB 有2条完全不同于AA 、CC 的片段, 双二倍体中总体来说还是出现祖先种条带的总和, 但AACC 出现了1条新带, 而在AA 、CC 中却无(如箭头所示); AABB 和BBCC 带型相似, 只出现1条位置不同于它们祖先种的条带。表1是4种内切酶CAPS 统计分析结果。

3 讨论

用A 基因组的重复序列作探针, 杂交信号在A 、C 基因组所有染色体上均有分布, B 基因组染色体上的杂交信号弱或无。这说明在长期的进化过程中, 甘蓝与白菜型油菜的亲缘关系较近, 基因组的分化程度较小, 而甘蓝与黑芥的亲缘关系较远, 基因组的分化程度高。在实验中AABB 用该探针就可

第7期孔芳等: 利用原位杂交及CAPS标记分析芸薹属A、B和C基因组间的关系1191

以将A和B基因组分开, 这也进一步表明B基因组与A、C关系较远。还未见用基因组重复序列(除rDNA外)作探针来研究A、B和C基因组亲缘关系的报道。目前我们正在寻找更多的重复序列, 特别是能够和染色体对应的分子标记相结合开展芸薹属基因组间的相互关系研究。

芸薹属6个种的FAE1基因的CAPS分析的条带不同, 即酶切位点不同, 说明不同品种中FAE1的核苷酸序列不同。FAE1基因是芥酸(C22:1)形成过程中一种关键酶基因, Das等[22]研究发现甘蓝型油菜的FAE1有两个不同等位基因位点, 芥酸含量由种胚基因型控制, 一个在A基因组, 另一个在C基因组, 呈加性遗传。本研究也表明A、B、C基因组具有不同序列的FAE1基因, 同时异源四倍体中存在不同的等位基因位点。在异源四倍体中发现有新的条带出现, 即出现了新的酶切位点, 这表明在四倍体的形成过程中, 来自于A、B或C基因组的FAE1基因发生了结构的重组或突变。CAPS方法实际反映出来的是该基因序列的变化, 该方法简单而且稳定, 可以快速而且直观地对A、B和C基因组间的相互关系进行区分和鉴定。

利用芸薹属6个种的FAE1基因的CAPS分析能清楚、直观地区别基因组A、B和C, 以及这6个种之间的相互关系, 结合原位杂交更进一步验证了基因组A、C亲缘关系近, 与B关系远的结论, 这与Song等[2]对3个基本种的核基因组, 线粒体和叶绿体的RFLP图谱的比较研究结果一致, 认为二倍体基本种可能起源于一个祖先的两个分支, 即 B. rapa、B. oleracea分支和B. nigra分支。本研究中CAPS分析结果还发现异源四倍体的带型是它们祖先种的带数总和, 但也出现不同于祖先种的新带, 表明在异源四倍体形成过程中可能发生了结构性重排或基因组间的重组。为了克服核质基因组间不利的相互作用, 促进新物种的形成, 有些染色体变化在杂交后迅速产生, 因此在多倍体化的过程中, 基因组内和基因组间的重新组织是广泛存在的[23-24]。从表1也可以看出, 在3个异源四倍体中, AABB所形成的带均是双亲二倍体带的总和, 没有出现新的条带, 而AACC出现新的条带的次数最多, BBCC次之。是不是意味着AACC在形成过程中A和C基因组间发生更多的重组和重排, 目前我们正在对人工合成的AACC减数分裂染色体形为进行研究。

表16种芸薹属植物FAE1基因的CAPS分析

Table 1 CAPS analysis of FAE1 genes in six Brassica species

限制性内切酶Restriction endonuclease

带式样

Band pattern

黑芥

B. nigra

甘蓝

B. oleracea

白菜型油菜

B. rapa

埃塞俄比亚芥

B. carinata

芥菜型油菜

B. juncea

甘蓝型油菜

B. napus

总带数

Total bands

4 5 5 7 6 6

Mbo I

新带数

Novel bands*

—— — 1 — 1

总带数Total bands 3 5 5 8 8 6

Msp I

新带数

Novel bands

— — — — — 1

总带数Total bands 6 7 8 12 11 10

Alu I

新带数

Novel bands

— — — 1 — —

总带数Total bands 9 10 10 13 13 11

Hpa I

新带数

Novel bands

— — — — — 1 *：与二倍体进行比较。*: compared with both diploid progenitors.

4结论

组成芸薹属3个基本种和3个复合种之间的亲缘关系不仅可以通过多种分子标记方法加以阐述, 而且也可以用重复序列(包括核糖体RNA基因)作探针, 通过分子细胞遗传学的方法对基因组A、B和C 之间的关系进行研究。A和C具有很高的同源性, 如果能够寻找到更多的特异性重复序列, 结合分子标记对A和C基因组染色体加以区分, 对油菜基因组学, 芸薹属物种的形成和进化, 油菜的育种和种质

1192作物学报第34卷

创新等研究均具有重要的意义。

References

[1] U N. Genome analysis in Brassica with special reference to the

experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertili-

zation. Jpn J Bot, 1935,7: 389?452

[2] Song K M, Osborn T C, Williams P H. Brassica taxonomy based

on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs): I.

Genome evolution of diploid and amphidiploid species. Theor

Appl Genet, 1988, 75: 784?794

[3] Parkin I A P, Sharpe A G, Keith D J, Lydiate D J. Identification of

the A and C genomes of amphidiploid Brassica napus (oilseed

rape). Genome, 1995, 38: 1122?1131

[4] Hasterok R, Jenkins G, Langdon T, Jones R N, Maluszynska J.

Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes.

Theor Appl Genet, 2001, 103: 486?490

[5] Warwick S I, Sauder C. Phylogeny of tribe Brassiceae (Brassica-

ceae) based on chloroplast restriction site polymorphisms and nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplast trnL

intron sequences. Can J Bot, 2005, 83: 467?483

[6] Li Z-Y(李宗芸), Wu X-M (伍晓明), Wang X-Q (王秀琴), Song

Y-C (宋运淳). Genomic in situ hybridization (GISH) analysis of

B. oleracea and 5 related Brassica species. Chin J Oil Crop Sci

(中国油料作物学报), 2003, 25(4): 16?19 (in Chinese with Eng-

lish abstract)

[7] Hasterok R, Jenkins G, Langdon T. Ribosomal DNA is an effec-

tive marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet, 2001, 103: 486?490

[8] Lim K B, Jong J, Yang T J, Park J Y, Kwon S J, Kim J S, Lim M

H, Kim J A K, Jin Y M, Kim S H, Lim Y P, Bang J W, Kim H I, Park B S. Characterization of rDNAs and tandem repeats in the heterochromatin of Brassica rapa. Mol Cell, 2005, 19: 436?444 [9] Demeke T, Adams R P, Chibbar R. Potential taxonomic use of

random amplied polymorphic DNA (RAPD): A case study in Brassica. Theor Appl Genet, 1992, 84: 990?994

[10] Thormann C E, Ferreira M E, Carmago L E A, Tivang J G,

Osborn T C. Comparison of RFLP and RAPD markers to esti-

mate genetic relationships within and among cruciferous species.

Theor Appl Genet, 1994, 88: 973?980

[11] Quiros C F, Truco M J, Hu J. Sequence comparison of two

codominant RAPD markers in Brassica nigra: Deletions, substi-

tutions and microsatellites. Plant Cell Rep, 1995, 15: 268?270 [12] Lagercrantz U. Comparative mapping between Arabidopsis

thaliana and Brassica nigra indicates that Brassica genomes have evolved through extensive genome replication accompanied by chromosome fusions and frequent rearrangements. Genetics, 1998, 150: 1217?1228

[13] Konieczny A, Ausubel F M. A procedure for mapping Arabidop-

sis mutations using co-dominant ecotype-specific markers. Plant J, 1993, 4: 403?410

[14] Caranta C, Thabuis A, Palloix A. Development of a CAPS

marker for the Pvr4 locus: A tool for pyramiding potyvirus resis-

tance genes in pepper. Genome, 1999, 42: 1111?1116

[15] Moury B, Pflieger S, Blattes A, Lefebvre V, Palloix A. CAPS

marker to assist selection of tomato spotted wilt virus (TSWV) resistance in pepper. Genome, 2000, 43: 137?142

[16] Mou Z L, Dai Y, Li J Y. Fine-mapping of an Arabidopsis cell

death mutation locus. Sci China (Ser C), 2000, 43: 138?145

[17] Brugmans B, Fernandez C A, Bachem C W, van Os H, van Eck

H J, Visser R G. A novel method for the construction of genome

wide transcriptome maps. Plant J, 2002, 31: 211?222

[18] Jander G, Norris S R, Rounsley S D, Bush D F, Levin I M, Last

R L. Arabidopsis map-based cloning in the post–genome era.

Plant Physiol, 2002, 129: 440?450

[19] James D W, Jr Lim E, Keller J, Plooy I, Ralston E, Dooner H K.

Directed tagging of the Arabidopsis fatty acid elongation 1 (FAE1) gene with the maize transposon activator. Plant Cell, 1995, 7: 309?319

[20] Doyle J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue.

Focus, 1990, 12: 13?15

[21] Gupta V, Mukhopadhyay A, Arumugam N, Sodhi Y S, Pental D,

Pradhan A K. Molecular tagging of erucic acid trait in oilseed mustard (Brassica juncea) by QTL mapping and single nucleo-

tide polymorphisms in F AE1 gene. Theor Appl Genet, 2004, 108: 743?749

[22] Das S, Roscoe T J, Delseny M, Srivastava P S, Lakshmikumaran

M. Cloning and molecular characterization of the Fatty Acid Elongase 1 (F AE1) gene from high and low erucic acid lines of Brassica campestris and Brassica oleracea. Plant Sci, 2002, 162: 245?250

[23] Parkin I A P, Parkin I A P, Sharpe A G, Lydiate D J. Patterns of

genome duplication within the Brassica napus genome. Genome,

2003, 46: 291?303

[24] Lysak M A, Koch M A, Pecinka A, Schubert I. Chromosome trip-

lication found across the tribe Brassiceae. Genome Res, 2005, 15: 516?525