方法--流式细胞术检测细胞

2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期

2.2.2.5.1 实验原理

用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。

2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤

收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。

48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清；

一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清；

加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30 min；

流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。

2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡

2.2.2.6.1实验原理

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

2.2.2.6.2 结果判断

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。

细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象

限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

2.2.2.6.3流式实验步骤

收集对数生长期A549细胞，计数，以(1～5)×105个/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁；次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次；

在药物处理48 h后，以不含EDTA的胰酶消化并收集细胞于流式管1000 r/min离心5 min，弃上清。冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清；

按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明，向细胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管，振荡混匀。室温、避光反应15 min；

再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管，振荡混匀；

用流式细胞仪检测细胞凋亡。

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在

流式细胞仪常用的几种检测方法

精品文档，放心下载，放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。

流式细胞仪常用的几种检测方法

流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）

最详细的流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或

流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡

A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。

方法--流式细胞术检测细胞

2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期 2.2.2.5.1 实验原理 用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。 2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤 收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。 48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清； 一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清； 加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30 min； 流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。 2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡 2.2.2.6.1实验原理 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 2.2.2.6.2 结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。 细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象

流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

(完整word版)流式细胞术步骤.docx

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； 于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1 （propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。

流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群

流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群 点击次数：22 发布日期：2008-5-12 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负 早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。 由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。 淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。 材料与方法 试剂 PMA（Sigma） 贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃ 保存。 工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1μg/ml。 Ionomycin（Sigma） 贮存液：Ionomycin 溶于DMSO 浓度为1mg/ml -20℃ 保存。 工作液：贮存液1:20 稀释于RPMI 1640 培养基中，此时为50μg/ml。 GolgiStop（内含Monensin ，BD Pharmingen） Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均购自BD Pharmingen。 抗体 细胞表面标记抗体：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC。抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。 细胞内因子抗体：抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC。抗鼠IL-4-PE, IFN-γ-FITC。以上抗体均购自BD Pharmingen。 实验方法 1 外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。弃去上清，细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓

将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上

↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，

流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 PBS溶液； PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 70%乙醇 400目筛网 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。 2. 3ml PBS洗涤1次。 3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。 4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。 5. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。 6. 用1ml PI染液染色，4℃避光30min。 7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。 8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。 注意事项 细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

流式细胞检测方法

Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌） K：不加菲A：5000ug/L菲B: 500ug/L C: 500ug/L 1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600 2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。） 3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。 4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。 7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。 8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。 9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。 二醋酸酯荧光素（FDA）与碘化丙啶的流式细胞术 1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600 2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5ml PBS轻轻重悬 3、取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。 4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入200μl FDA，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入200ul FDA单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。 7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。

流式细胞术检测细胞周期

流式细胞术检测细胞周期 流式细胞术在许多题中常用到，但对其结果的分析却不是很清楚。在此收集点相关资料并以实验中的一张图片为例，大家共同学习。图中白色箭头及尾部G1,G2,S是我用PS加上去的，方便讨论。首先来认识下图： 1.纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数； 2.横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期我们等下 再讲； 3.G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示； 4.右侧数字含义：Mean G1=19 5.4即G1期DNA含量平均值为 195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；以此类推……

下面从细胞周期的角度看各参数的意义： 1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。 可分为四个阶段（见图）： ①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； ②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期； ③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。 2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类： ①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层 细胞、部分骨髓细胞。 ②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞， 如淋巴细胞、肝、肾细胞等。 ③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞， 如神经、肌肉、多形核细胞等等。 细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。

流式细胞仪常用的几种检测方法

流式细胞仪常用的几种 检测方法 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】

流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1)? ?? ???取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=）缓冲液中； 2)? ?? ???300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3)? ?? ???重悬细胞于 PBS缓冲液中； 4)? ?? ???将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2? ?? ? 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2? ?? ? 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2? ?? ? 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2? ?? ? 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2? ?? ? 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2? ?? ? 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2? ?? ? 上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1)? ?? ???用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2)? ?? ???500g离心5分钟； 3)? ?? ???弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4)? ?? ???再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5)? ?? ???上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1)? ?? ???从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2)? ?? ???用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3)? ?? ???加入PI液1ml室温避光30分钟； 4)? ?? ???调整细胞浓度为1×106/ml； 5)? ?? ???上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 点击次数：621 作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园 来源：51protocol 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆">）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆" 克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只